方法論記事

心筋機械変形(DIAMOND)の変位解析は、胚性ゼブラフィッシュにおける心機能のセグメント的不均一性を明らかにする

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DOI：

10.3791/60547

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2020年2月6日

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1Division of Cardiology, Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California, Los Angeles, 2Ronald Reagan UCLA Medical Center, 3Veterans Affairs West Los Angeles Medical Center

この記事について

サマリー

このプロトコルの目標は、生理学的および病理学的条件の下で胚性ゼブラフィッシュにおけるセグメント性心機能の評価のための新しい方法を詳述することです。

要約

ゼブラフィッシュは、心筋症や再生のためのモデル生物としてますます利用されています。心機能を評価する現在の方法は、セグメント力学を確実に検出できず、ゼブラフィッシュでは容易に実現できません。ここでは、4次元(4D)セグメント心機能の定量評価のための半自動化オープンソース法:心筋機械的変形(DIAMOND)の変位解析を提示する。トランスジェニック胚性ゼブラフィッシュは、4D心臓運動同期を有する光シート蛍光顕微鏡システムを用いて生体内で画像化した。取得した3Dデジタルハートは、末端収縮期および末側拡張期に再構築され、心室は手動でバイナリデータセットにセグメント化された。その後、心臓の向きを変えて真の短軸に沿って等熱帯にリサンプリングし、心室は短軸に沿って8つの部分(I-VIII)に均等に分割された。末端収縮期と末端収縮期の平面と行列が異なるために、変換行列が画像登録に適用され、リサンプリングされた収縮期と拡張期の画像行列の元の空間関係が復元されました。画像登録後、末端収縮期から末端拡張期までの各セグメントの変位ベクトルを、3次元(3D)における質量の中心数の変位に基づいて計算した。DIAMONDは、房室管に隣接する基底心筋セグメントが最も機械的変形を受け、ドキソルビシンによる心臓損傷の影響を最も受けやすいことを示している。全体として、DIAMONDは、生理学的および病理学的条件の両方の下で、従来の放出分率(EF)を超えるゼブラフィッシュ胚におけるセグメント心臓力学に関する新しい洞察を提供する。

概要

化学療法による心臓毒性とそれに伴う心不全は、化学療法中止の主な理由の1つである1.したがって、心臓機能評価は、心臓毒性の同定において重要な役割を果たし、さらに重要なことに、化学療法後の早期心臓損傷の予測において2である。しかし、心臓機能評価のための現在のアプローチは限界に遭遇する。左心室駆出分率(LVEF)のような方法は、損傷3、4の後に世界的かつしばしば遅れた心臓力学のみを提供する。組織ドップラーイメージングは、セグメント性心筋変形情報を提供するが、超音波ビーム角度依存性5に部分的に、重要なイントラ観察者および観察者間変動に苦しむ。2次元(2D)のスペックルトラッキングは、理論的には角度依存性を排除するエコーカルディグラフィのBモードを利用しますが、その精度は面外モーション6によって制限されます。したがって、セグメント性心機能を定量化するための厳密なアプローチは、研究と臨床の両方に欠けている。

そこで、心筋の変位解析(DIAMOND)を3次元空間における心筋質量心筋の変位ベクトルを決定する、心筋変形解析(DIAMOND)と名付けた、セグメント心臓機能の解析のための4D定量法を開発しました。動物モデルとしてゼブラフィッシュ(Danio rerio)を用いた心機能およびドキソルビシン誘発心毒性のインビボ評価にDIAMONDを適用し、その再生心筋および高度に保存された発達遺伝子に起因して選択した。さらに、セグメントDIAMOND変位と、全発放出分率(EF)決定およびドキソルビシン処理後の2Dひずみとを比較した。DIAMONDは、胚性ゼブラフィッシュ心臓の4D光シート蛍光顕微鏡(LSFM)取得したレンダリングとDIAMOND変位を統合することにより、房室管に隣接する基底心筋セグメントが最も機械的変形を受け、急性ドキソルビシン心臓損傷の影響を最も受けやすいことを示している。

   

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プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、UCLA機関動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されており、実験はUCLA動物研究局によって承認されたプロトコルに準拠して行われました。

1. Tg(cmlc2:mCherry)ゼブラフィッシュの繁殖と胚の採取

  1. 以前に確立された畜産および繁殖慣行に記載されているように、住宅、繁殖、および胚の収集手順に従ってください。詳細については、メッサーシュミットら9を参照してください。
  2. 採取した胚をE3培地18時間受精で0.003%1-フェニル-2-チオ尿素(PTU)で治療し、LSFMイメージングのための胚の透明性を維持する。

2. 心臓損傷を誘発するドキソルビシン治療

  1. 3日間の受精後(dpf)で、E3魚水培地中の10μMの濃度でドキソルビシンで胚を治療する。4 dpfに24時間処理した後、ドキソルビシン培地を新鮮なE3培地に交換します。
    注意:ドキソルビシンは化学療法薬です。適切な個人用保護具(PPE)が必要であり、廃棄物はバイオハザード廃棄物容器に保管する必要があります。

3. ノッチ経路変調

  1. ゼブラフィッシュ胚をノッチ経路阻害剤(2S)-N-(3,5-ジフルオフェニル)アセチル]-L-アラニル-2-フェニル]グリシン1,1-ジメチレチルエステル(DAPT)を3~6dpfのE3魚水中に10μMの濃度で治療します。
  2. ノッチダウンストリームエフェクターノッチ細胞内ドメイン(NICD)およびノイレグリン1(Nrg-1)mRNAをそれぞれ10pg/nLおよび5 pg/nLの濃度で1細胞段階ゼブラフィッシュ胚8,10にマイクロ注入する。
    注:マイクロインジェクションは、注入された容積を正確に制御するために、空気ポンプのサポートを受けて顕微鏡下で行われます。細胞へのmRNAマイクロインジェクションは、受精卵が最初の細胞段階にあるときに行われます。mRNAの準備と順序の詳細については、Chen et al.8を参照してください。注射針のマイクロインジェクションおよび調製の詳細については、Rosenらの10を参照してください。

4. LSFM イメージングとポストイメージング同期

  1. LSFM イメージング技術およびポストイメージング同期アルゴリズムについては、前の資料9,11の詳細を参照してください。
    注:簡単に説明すると、当社のシステムは、すべてのトランスジェニックゼブラフィッシュラインを画像化するための照明源として連続波レーザーを使用しています。検出モジュールは、2つの科学的相補的な金属酸化物半導体(sCMOS)カメラとデュアルチャンネルイメージング用の2組のフィルタで構成されています。検出モジュールは照明面に垂直に取り付けられている。各LSFMフレームは20ミリ秒の露光時間内に取得され、断面の分解能は約0.65μm、連続するフレーム間のステップサイズは約2μmです。589 nmレーザーを使用して、mCherry蛍光シグナルを励起した。

5. 3D収縮期および拡張期心の再構築

  1. 同期後のアルゴリズムで作成されたフォルダを開き、Outputフォルダを開きます。心臓の中央平面を選択し、フォルダ全体を ImageJ にロードします。最初の拡張期および収縮期を見つけて、フレーム番号を記録します。
  2. 「出力/状態別」フォルダを開き、記録したフレーム番号と同じ番号のフォルダを探します。フォルダ内の画像を3D TIFF(タグ付き画像ファイル形式)ファイルに変換し、「dia、syの.tif」と「syのtif」と名前を付けます。

6. 心室のセグメンテーション

  1. イメージ分析ソフトウェアを開きます(資料の表を参照)。[ファイル] をクリックして |データを開き、「拡張期.tif」と「収縮期.tif」をロードします。イメージング設定に従ってボクセルサイズを入力します。
    メモ:使用するLSFMシステムの場合、一般的なボクセルサイズは0.65 μm x 0.65 μm x 2 μmです。
  2. 「セグメンテーション」パネルをクリックし、心臓の心室部分を手動でセグメント化します。特定の強度を超えるすべての領域を選択できる組み込みのしきい値ツールを使用すると、このプロセスを容易にできます。心室は、より強い蛍光を有するより厚いチャンバーである。
    注: これは変位解析に影響するため、セグメント化された心室の房室管と流出管を必ず取り除くようにしてください。
  3. セグメンテーションが完了したら、「プロジェクト」パネルをクリックします。「拡張期」を右クリックします。ラベル.tif"と"収縮期。コンソールの labels.tifタブをクリックし、[データをエクスポートする形式] をクリックして、データを 3D TIFF ファイルとして保存します。

7. 画像登録用の長方形の平行エピペスの作成

  1. プログラミング環境でprepImage_1.mを実行します (資料の表を参照)。5 行目で"prepImage_1.m""ImPath"を開き、フォルダに元の TIFF ファイルとセグメント化された TIFF ファイルが含まれ、4 行目の"slice"を3D tif ファイルのスライス数に変更します。
  2. コードを実行した後、5つの新しい3D TIFFファイル(「test.tif」、「diastole_200.tif」、「systole_200.tif」、「diaLabel.tif」、および「sysLabel200.tif」)と2つの新しいフォルダ(「resample_dia」と「resample_sys」)を生成します。

8. 短軸平面に沿って収縮期および拡張期の3D心をリサンプリングする

  1. 5 つの 3D TIFF ファイルをすべてイメージ分析ソフトウェアにインポートします(「マテリアルの表」を参照)。
    メモ:ボクセルのサイズは変更されません。
  2. マルチプラナーパネルに移動します。プライマリ データとして [diastole_200.tif] を選択します。X 軸(XY 平面の緑の線)を心室の縦長の長軸に合わせ、Z 軸(YZ 平面の赤い線)を心室の横長軸に揃えます。
    注: 垂直長軸は、XY 平面の頂点と流出路を結ぶ最長の軸を求めることによって決定され、横長軸は YZ 平面の頂点と流出路を結ぶ最長の軸を見つけることによって決定されます。軸の終点にカーソルを置いて軸を回転します。
  3. 斜め YZ 平面(短軸平面)から 3 つのランダムポイントを反時計回りに選択し、3D 位置座標を記録します。
    注: 点が反時計回りに選択されていることを確認します。
  4. 「systole_200.tif」に対して、手順 8.2 と 8.3 を繰り返します。
  5. 「プロジェクト」パネルをクリックします。"diastole_200.tif" を右 diastole_200クリックし、"スライス" オブジェクトを検索して、"slice"オブジェクトを作成します。作成したスライスオブジェクトを左クリックし、プロパティパネルで |オプションを選択し、「平面を設定」をチェックし、「平面定義」で3点を選択します。ステップ 7.3 から 3 点の座標を入力します。
  6. 「systole_200.tif」に対して手順 8.5 を繰り返します。
    注: 作成されるスライスオブジェクトには、"Slice 2"という名前が付いています。
  7. 右クリックしてdiastole_200.tif」をクリックし、「変換後の画像を再サンプル」を検索して、オブジェクトを作成します。プロパティパネルで、「参照」として「スライス」を選択し、「適用」をクリックします。これにより、" diastole_200.トランスフォーメーション "という名前のオブジェクトが生成されます。
  8. 右クリック"diastole_200.変換 "をクリックし、 "Resample" を検索してオブジェクトを作成します。[モード] として [ボクセル サイズ] を選択し、[プロパティ]パネルで "ボクセル サイズ" を x = 1、y = 1、z = 1 に変更します。
  9. [適用] をクリックします。これにより、" diastole_200.resampled" という名前のオブジェクトが生成されます。右クリックして"diastole_200.resampled"3D TIFF ファイルとして保存します。
  10. "diaLabel.tif" と "test.tif" についても同じ手順を繰り返します。「diaLabel.resampled」と「test.resampled」を 3D TIFF ファイルとして保存します。「スライス 2」を参照として使用して「systole_200.tif」、「sysLabel.tif」、「test.tif」と同じ手順を繰り返し、「systole_200.resampled」、「sysLable.resampled」、「test2.resampled」を 3D TIFF ファイルとして保存します。
    注: この手順では、合計 6 つの TIFF ファイルが保存されていることを確認します。

9. リサンプリングされた心臓の分割

  1. 手順 8 から ImageJ に 6 つのリサンプリングされたファイルをすべてインポートします。房室管がはっきりと視覚化されている「systole_200.resampled」のスライスを選択します。スライスの番号を記録します。
    1. 画像を使用する |変換 |房室の管が垂直になるようにImageJの機能を回転させる。すべてのファイルに同じローテーションを適用します。すべてのウィンドウを閉じ、すべての変更を保存します。
    2. "diastole_200.resampled"、"diaLabel.resampled"、および "test.resampled" を "resample_dia" フォルダーに移動し、"systole_200.resampled" 、"sysLable.resampled"、および "test2.resampled" を "resample_sys" フォルダーに移動します。
  2. 「divider_2_8_pieces.m」を開きます。行 5 の"ImPath"と 395 行目の"ImPath"をイメージ ディレクトリに変更します。22 行目および 411 行目の変数 "中" を、房室管がはっきりと視覚化されるスライス数に変更しますsystole_200.resampled」 および "diastole_200.resampled" 。
  3. コードを実行し、プロンプトウィンドウで心室の中心で1回クリックし、房室管の中心で1回クリックします。これは、収縮期と拡張期の両方の画像のために2回行う必要があります。

10. 収縮期および拡張期イメージ行列の登録

  1. "register_3.m" を開き、4 行目の"ImPath"をイメージ フォルダのパスに変更します。システムの計算能力によっては、このコードを実行するのに 5 ~ 20 分かかる場合があります。
    注: ステップ 7 で人工的に作成された矩形の平行エピペスは、3 点と 3 点で登録された 2 つの点と角度の間の距離を保持する 3D リジッド登録に使用されます。末端直径の矩形平行(赤)が末端収縮矩形平行(緑色)に登録されると、続く分離円板3D位置は、末方収縮マトリックスから末端収縮マトリックスへの回転および移動からなる剛直変換のユニークなマトリックスの導出を可能にする(図1H)。画像処理ツールボックスを使用して変換後に行列をノイズ除去するための登録と正規化されたエネルギー最小化を実行します(教材表を参照)。数学の詳細については、Chen et al.8を参照してください。

11. 変位ベクトルの出力

  1. "displacement_4.m"を開き、4 行目の"ImPath"をイメージ フォルダのパスに変更します。
  2. "displacement_4.m"を実行し、"vector8.txt" ファイルを "vectors" フォルダーに生成します。"vector8.txt" ファイルが開かれると、8 x 4 の行列が表示されます。行列の各行には、X 成分、Y 成分、Z成分、および心室の特定のセグメントの変位ベクトルの SUM の大きさの 4 つの数値があります。
    注: 変位ベクトルは、3D 空間における各セグメントの質量中心数の変位を計算することによって取得されます。収縮期から拡張期までのセグメンテーション データセットの3D質量重figure-protocol-1心(PSおよびPD)座標(kはそれぞれX、Y、またはZ座標を示す)を計算します(図1J)。質量の中心数figure-protocol-2は、次のように 3D 空間で定義します。
    figure-protocol-3
    ここで、C x =X 、 Cy = Y、およびC = Z = Z、Mi = 各セグメントの質量 (I ≤ i ≤ VI)、m = 各セグメントのボクセル数、およびセグメント化領域としての密度関数 ρ = 残りは 0 です。X軸、Y軸、Z軸に沿ったサブ変位ベクトルと合計変位ベクトルのL2ノルムは、心周期の間に計算されます。マトリックスには合計 8 行あります。最初の行と8列目には房室管が含まれているので、我々の分析では無視されます。セグメント I から VI は、2 行目から 7 行目で表されます。

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結果

DIAMOND が3次元のセグメント性心機能を評価するために開発されたプロセスを図1に示します。発生源ゼブラフィッシュ心臓の3DにおけるLSFM画像取得および再構成(図1A)に続いて、真の短軸平面は、縦および横長軸に垂直な平面として決定され、どちらもマルチプレーンビューアで決定される(図1B)。心臓を短軸平面に沿って再サンプリングし(図1C)、そして、心室空洞の中心を房室管の中心に接続する仮想分割線(赤点線)に従って等しい8つの等しいセグメントに分割した(図1E)。特定されたセグメントの 3D 描写は、断面図 (図 1F)

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ディスカッション

セグメント心筋機能の定量のための厳格な戦略は、心筋損傷1、4、12の無神経で遅延指標であることが知られている従来のEFを超えて心臓力学を評価するために重要です。したがって、初期心筋変化のマーカーへの関心が高まっており、成長体の文献は心室機能不全4、13を予測するための早期指標として心筋変形パラメータをサポートしている。左心室(LV)株の心エコー測定は、心筋変形測定13の確立された方法を提供する。しかし、組織ドップラーベースの歪みイメージングは、角度依存性および観察者内変動14に起因する多くの欠点を患っている。スペックルトラッキングエコーカルディオーグラフィ(STE)は、角度独立した2Dおよび3D組織変形を解決することができますが、2Dスペック...

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開示事項

著者らは、利益相反は存在しないと宣言している。

謝辞

現在の研究は、米国心臓協会の助成金16SDG30910007および18CDA34110338、および国立衛生研究所によってHL083015、HL111437、HL118650、およびHL129727によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Amira6FEI画像解析ソフトウェア
DAPTMillipore SigmaD5942-5MG
Doxorubicin hydrochlorideMillipore SigmaD1515-10MG
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonateMillipore SigmaE10521-10GTricaine
MATLABMathWorksプログラミング環境
MATLAB Image Processing ToolboxMathWorks画像処理ツールボックス

参考文献

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