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方法論記事

ナマコ腸細胞の一次培養におけるアポトーシス誘導と検出

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DOI:

10.3791/60557

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2020年1月21日

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture, Marine Science College, Zhejiang Ocean University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ナマコアポスピコプスジャポニクスから腸細胞を培養するための扱いやすい方法を提供し、エキノデルマ、モルスカ、甲殻類を含む海洋生物から広く利用可能な様々な組織サンプルと互換性があります。

要約

一次培養細胞は、生物物質の機能評価や特定の生物学的活動の特徴付けのための非常に重要なツールとして、様々な科学的分野で使用されています。しかしながら、普遍的に適用可能な細胞培養培地およびプロトコルの欠如のために、海洋生物に対する細胞培養方法は依然として限定的である。一方、海洋無脊椎動物細胞の一般的に起こっている微生物汚染および多発性特性は、海洋無脊椎動物に対する効果的な細胞培養戦略の確立をさらに妨げる。ここでは、ナマコアポジコプスヤポニクスから腸細胞を培養するための扱いやすい方法について説明します。さらに、一次培養腸細胞におけるインビトロアポトーシス誘導および検出の例を提供する。また、本実験では、適切な培養培地及び細胞採取方法について詳細を提供する。記載されたプロトコルは、エキノデルマタ、モルスカ、および甲殻類を含む海洋生物から広く利用可能な様々な組織サンプルと互換性があり、複数のin vitro実験用途に十分な細胞を提供することができる。この技術により、研究者は海洋無脊椎動物からの一次細胞培養物を効率的に操作し、細胞上の標的生物学的物質の機能的評価を容易にすることが可能になる。

概要

人工的に制御された条件下で細胞を培養し、自然環境ではなく、特に実験室環境で容易に培養できない種に対して、生物学的研究のための均一な実験材料を提供します。海洋無脊椎動物は全動物種1の30%以上を占め、再生2、3、ストレス応答4、環境適応5、6などの特定の生物学的プロセスの調節機構に関する研究を行うための多数の生物学的材料を提供する。

ナマコ、アポストコモスジャポニクスは、北太平洋沿岸の温帯水域に生息する最も研究されたエキノデルム種の一つです。東アジア、特に中国7では、商業的に重要な種として知られており、大規模にマリカルチャーされています。A.ジャポニクスに関する多くの科学的な質問は、死後8後の腸の再生の基礎となる調節機構および失神9の変性、代謝制御10、11、および免疫応答12、13熱ストレスまたは病原性ストレス下で、研究者の注目を集めている。しかしながら、よく研究されたモデル動物と比較して、基礎研究、特に細胞レベルに関する研究は、高度な細胞培養方法の欠如などの技術的なボトルネックによって制限される。

研究者は細胞株の確立に多くの努力を捧げてきたが、彼らはまた、多くの課題に直面しており、海洋無脊椎動物からの細胞株はまだ14を確立していない。しかし、海洋無脊椎動物からの一次細胞培養は、過去数十年で進歩した15、16、そして彼らは細胞レベルで実験する機会を提供している。例えば、A.ジャポニクスからの再生インテシンは、海洋無脊椎動物17の一次細胞培養のための実用的な方法を提供した長期細胞培養のための細胞源として利用されている。このプロトコルは、無脊椎動物細胞培養アプローチを組み合わせ、最適化し、ナマコまたは他の海洋無脊椎動物に広く適した一次培養方法を開発した。

アポトーシスは、様々な内因性および内因性刺激によって引き起こされる本質的な細胞自殺プログラムである。協調アポトーシスは、多くの生物学的システム18、19にとって極めて重要であり、そして、それは、アスティベーション9の間にナマコの腸の退行に関与している。目的の生物におけるアポトーシス過程を調べるために、Hoechst染色および顕微鏡アッセイを含む一連の方法が確立され、20を正常に適用した。ここでは、ナマコの一次培養腸細胞におけるアポトーシス誘導と検出を行い、海洋無脊椎動物の生物学的研究における一次細胞の使いやすさを評価した。一般的に使用される合成グルココルチコステロイド21の一つであるデキサメタゾンは、ナマコから培養腸細胞にアポトーシスを誘導するために使用され、有意なHoechst 33258シグナルは蛍光顕微鏡により染色細胞内で検出に成功した。

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プロトコル

1. 細胞培養培地調製

  1. コロミック流体製剤
    1. コロミック流体コレクション:滅菌条件下で、健康なナマコ(85〜105gの湿式重量)を解剖し、コエロミック液を採取し、滅菌ガラスフラスコに貯蔵する。
    2. コロミック細胞除去:5分間1,700 x gで50 mL遠心管内のコロミック流体を遠心分離し、新しい滅菌ガラスフラスコに上清を移します。次に、ナマコの無細胞のコエロミック液を収集します。
    3. コンポーネントの非アクティブ化を補完する:ナマコのコロミック液を含む滅菌ガラスフラスコを40~50°Cの水浴で20~40分間インキュベートし、補体成分不活性化コエロミック液を得た。
    4. 微生物除去:0.22μmの膜フィルターを通して濾過することにより、細菌およびクラミジアを除去します。次に、0.1μm膜フィルターを用いて濾過してマイコプラズマやその他の微粒子を除去し、コエロミック流体前処理液を得た。
    5. サリン度調整:20%の高濃度の前滅および濾過NaCl溶液(前処理されたコエロミック流体で希釈)またはDDW(二重蒸留水)を加えることによって、コロミック流体前処理溶液の塩分濃度を30°(塩ノメーターで測定)に調整します。ナマコのコロミック液を滅菌ボトルに移し、ボトルを密封し、4°Cで保管して実験を行います。
  2. ライボヴィッツのL-15細胞培養培地最適化
    1. NaClの重量5.05g、KClの0.135 g、CaCl2の0.15g、Na 2 SO4の0.25g、MgCl2の0.975 g、0.25gのグルコース、6.25mgのタウリン、および6.25mgのタウリンでそれらを希釈し、50mriLチューブで40 mLで希釈する。塩が完全に溶解していることを確認するために、1時間シェーカーのチューブを攪拌します。
    2. 2.5 mLのL-グルタミン(100mg/mL)と500 μLのVE溶液(1.75 mg/L)をライボヴィッツのL-15培地に加え、0.22μmの膜フィルターを通して培地をさらに濾過します。
    3. 新鮮なライボヴィッツのL-15媒体と以前に調製されたコエロミック流体の100 mLで500 mLに合計媒体量を調整します。次に、NaOH溶液を使用してpHを7.6に調整します。滅菌環境での操作工程を維持してください。コロミック液の配合比率は10%~50%で、A.ジャポニクス腸細胞培養には20%で十分です。

2. 腸細胞の準備

  1. ナマコ腸加工
    1. アイスボックスに健康なナマコを麻酔します。前腸を解剖して採取し、組織サンプルを縦に切り、内側の内容物を取り除く。
    2. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で組織試料を2回洗浄し、水性エタノール溶液に浸漬して消毒し(体積75%)、2s以下で消毒する。
    3. PBSで組織サンプルを3回洗浄し、エタノールを除去し、約100mgの組織サンプルを2.0mL滅菌マイクロ遠心管に移す。
  2. セルコレクション
    1. アマキュウ科の腸組織ブロックに最適化された培養培地の1.5 mLを追加し、溶液が曇るまで殺菌された手術用ハサミでブロックをミンチします。
      注:オプションの簡略化されたプロトコルの場合は、ナマコの腸組織ブロックに最適化された培養培地の0.5 mLを追加し、殺菌された手術用ハサミでブロックを1mm3にカットします。直接培養料理にサンプルを移し、その後のインキュベーションステップを行います。
    2. トリプシンの400 μL(0.25%)を加え、反転して溶液を混合し、室温で5分間インキュベートし、100μmの細胞ストレーナーを使用して溶液を濾過します。
      注:異なる組織サンプルを治療する際に細胞分散液にトリプシンを添加することは任意です。エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)は、培養培地中のCa2+およびMg2+からの阻害活性を低下させるためにトリプシン溶液に含まれるべきである。
    3. 新しい滅菌2.0 mLマイクロ遠心管に濾液を回収し、1,700 x gで3分間遠心分離し、上清を廃棄し、培養培地(抗生物質を補給)でペレットを再び中断し、2回洗浄する。
      注:実験開始前に、2%ペニシリン・ストレプトマイシン溶液(10,000 U/mLペニシリンおよび10mg/mLストレプトマイシン)と1%ゲンタマイシン(4mg/mL)を添加した新鮮な最適化された培養培地を調製します。

3. 細胞培養

  1. インキュベーターのプリ設定:細胞培養用のインキュベーターをプリセットし、温度18°C、飽和湿度で少なくとも24時間あらかじめ実行してください。
    注:細胞培養培地の特性に応じて、CO2をインキュベーターに送ります。ライボヴィッツのL-15の基本培地を使用する場合、CO2を供給する必要はありません。
  2. 第1段階の細胞培養
    1. 微生物の増殖を抑制し、細胞培養の初期段階で増殖を促進するために、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液(10,000 U/mLペニシリンおよび10mg/mLストレプトマイシン)と0.5mLのゲンタミシン(40mg/mL)を500mLごとに添加する。さらに、500 mL 培養培地ごとに0.6mLのインスリン(10mg/mL)、インスリン様成長因子100μL(0.1μg/μL)、25μLの線維芽細胞増殖因子(0.1μg/μL)を補う。
    2. 細胞を1.5mLのチューブに集め、示された媒体の200μLを使用して再サスペンドし、φ4cmの皿にピペットします。
    3. 細胞をインキュベーターで培養し、6時間後に培養皿に2.0mLの培地を加え、次の段階に達するまで12時間ごとに培地の半分を交換する。
      メモ:セルがしっかりと皿に取り付けられていないので、媒体の変化を穏やかに扱ってください。ポリ-D-リジンコーティングされた料理は、皿の細胞に緩く取り付けるために使用することができます。
  3. 第二段階の細胞培養
    1. 培養細胞に対する抗生物質の悪影響を減らすには、培養培地中の示された抗生物質(ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン)の濃度を半減させる。
      注:インスリンおよび成長因子の使用は、細胞培養条件に依存し、任意である。
    2. 細胞培養培地を交換してください。細胞密度に応じて2~3日ごとに培地の変化を行います。
      注:培養細胞を顕微鏡で毎日観察し、増殖状態を記録します。
  4. 細胞通過
    注:一次細胞密度が60%に達したとき、細胞を通過およびサブカルチャーする。
    1. 培養した細胞を室温でPBSを用いて2回洗浄する。トリプシン溶液200°Lを加えて(0.25%)各皿に、手動で全体の底が覆われていることを確認する皿を攪拌。トリプシン溶液を廃棄し、室温で5分間細胞をインキュベートする。
    2. 細胞をピペットにして再サスペンドすることにより、1.0 mLの新鮮な培養培地で細胞を洗浄します。0.5 mLの細胞懸濁液を新しい皿に移し、1.5 mLの新鮮な培地を加え、18°Cで細胞をインキュベートする。
      注:トリプシン溶液が皿から細胞を消化し、切り離すことができない場合、細胞スクレーパーは細胞の収集に使用できます(一部のセルラインは接着剤が付けすぎです)。ただし、両方の方法を同時に実行しないでください。
    3. 12時間後に培地を変更し、顕微鏡下で細胞を観察し、条件を評価する。さらなる実験アッセイのために細胞を培養する。

4. A. ジャポニクス腸細胞におけるアポトーシス誘導と検出

  1. 細胞培養およびデキサメタゾン治療
    1. 以前に導入されたプロトコルに従って腸細胞を準備し、ウェルあたり2 x 106の細胞容積で12ウェルプレートに細胞をドロップワイズを追加します。
    2. 培養3日後、「第1段階の細胞培養」のステップに従い、細胞をPBSで3回洗浄し、培地を最適化された培地(抗生物質および増殖因子なし)に置き換える。
    3. 培養培地中のデキサメタゾン(DXMS)を希釈し、実験を開始する前に新鮮な2μMおよび200μM DXMS溶液を調製します。
    4. 培養培地の同じ体積で成長した培養細胞に異なる濃度のDXMS溶液を追加します。制御(CTL)、1 μM、および100 μM DXMSを含む3つの実験グループを設定します。
  2. ホエヒスト染色
    1. 指定された期間(0時間、24時間、48時間)のDXMSのインキュベーション後にPBSで3回細胞を洗浄します。
    2. 1ウェル当たり300μLのHoechst 33258溶液を12ウェルプレートに加え、18°Cで30分間インキュベートし、プレートを軽く攪拌してすべての細胞を覆い、染色を確実にします。
    3. Hoechst染色液を取り除き、各ウェルに4%パラホルムアルデヒド溶液(PBS)の300 μLを加えて細胞を固定します。15分間穏やかに攪拌する。
      注意:パラホルムアルデヒドは、皮膚接触または吸入によって適度に有毒であり、ヒト発癌物質の可能性があると指定される。化学ヒュームフード、ベントバランスエンクロージャ、またはパラホルムアルデヒドの計量および取り扱いの間に他の保護措置を使用する必要があります。
    4. 固定細胞をPBSで3回洗浄します。細胞を覆った状態に保つために、洗浄後にPBSを廃棄しないでください。
  3. 蛍光顕微鏡分析
    1. 水銀灯の電源、蛍光灯の電源、PC などの蛍光顕微鏡ハードウェアをオンにします。オペレーティング システム アカウントにログインし、ソフトウェアを起動して、その構成を確認します。
    2. 準備したプレートを顕微鏡のステージに置きます。ステージコントローラを使用して、サンプルを対物レンズの上に置きます。
    3. 光顕微鏡で目的の細胞を見つけ、蛍光顕微鏡に切り替え、パラメータをチューニングして画像をキャプチャします。
      注:核DNAに結合したHoechst 33258蛍光シグナルを観察するには、蛍光顕微鏡検査をそれぞれ約352nmと461nmで励起と発光で行う必要があります。

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結果

ここでは、A.ジャポニクスの原発性腸細胞培養を確立し、細胞を通過させた。図1は、培養の異なる段階における丸い細胞を示す。そして、EdU染色アッセイは、後の段階でこれらの丸細胞の増殖活性を明らかにする直接的な証拠を提供する(図2)。我々はまた、濾過細胞の代わりに細分化された組織ブロックを培養し、プロトコルをわずかに調整しました。さらに、スピンドル細胞型は正常に培養することができた。この細胞型は腸組織ブロックの周りで発生し、培養の4日後に観察することができました;しかし、パッセージに失敗しました(図3)。

培養細胞は、異なる生物学的実験用途に使用することができる。細胞をDXMSで異なる期間処理し、続いてHoechst 33258染色してアポトーシス細胞検出を行った。図4は、Hoechst 33258染色および蛍光顕微鏡によってナマコ...

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ディスカッション

過去数十年にわたり、細胞株の確立に向けた広範な研究努力が行われてきましたが、海洋無脊椎動物14、22からの細胞の長期培養の進展はまだ困難です。ホロチュリアン組織の再生から培養した細胞は長期間生存し、増殖の高い活性が特定の細胞17、23で検出できることが報告されている。しかしながら、正常な海洋無脊椎動物細胞については、まだ実用的な細胞培養アプローチは記載されていない。ここで提示されるプロトコルは、海洋無脊椎動物種A.ジャポニクスから腸細胞を培養し、通過するための効率的かつ容易に解釈可能な方法を提供する。この方法は、イカやカニなどの多くの異なる海洋無脊椎動物生物の一次細胞培養に容易に適応することができる。

一連の重要な要因は、この手順の正常な適用に影響します。微生物汚染の予防は、全体のプロセス、特に培養の最初の週の間に最も重要です。水生...

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開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

著者たちは浙江大学のナイミング周教授の技術アドバイスと研究室の設備の利用に感謝したいと思います。この研究は、中国国立自然科学財団(補助金番号41876154、41606150、41406137)と浙江省の大学・研究機関のための基礎研究基金[補助金番号2019JZ00007]によって財政的に支えられた].

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.1 μmフィルターミリポアSLVV033RS
0.22 μm フィルターミリポアSLGP033RB
0.25% トリプシンゲノムGNM25200
100 μmフィルターFalcon352360
4 cm皿ExCell BioCS016-0124
4%パラホルムアルデヒド溶液Sinopharm化学試薬PBS
ベンチトップ遠心分離機ックマンアレグラX-30R
BeyoClick EdU-488キットBeyotimeC0071S
CaCl2Sinopharmの化学試薬10005817
定温のインキュベーターの幸運なriptileHN-3
デキサメタゾンSinopharmの化学試薬XW00500221
電気サーモスタット水浴senxin17DK-S28
エタノールSinopharmの化学試薬8017696175%
の線維芽細胞の成長因子(FGF)PEPROTECH100-18B
蛍光顕微鏡カDMI3000BDMI3000B
ガラマイシンシノファーム化学試薬XW14054101
グルコースシノファーム化学試薬63005518
Hoechst33258 染色液BeyotimeC1017
インスリンシノファーム化学試薬
インスリン様成長因子(IGF)PEPROTECH100-11
KClSinopharm Chemical Reagent10016308
Leibovitz's L-15GenomGNM41300
L-glutamine (100 mg/mL)GenomGNM-21051
MgCl2>Sinopharm Chemical Reagent
Na2SO4Sinopharm 化学試薬10020518
NaClSinopharm 化学試薬10019308
NaOHSinopharm 化学試薬10019718
PBSSolarbioP1020pH7.2-7.4
ペニシリン-ストレプトマイシンゲノム
GNM15140 PHメーターバンテA120
タウリンSIGMAT0625
VESeebio185791
の80096618ベライXW1106168001XW77863031

参考文献

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