ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

Summary

ここで提示するプロトコルは、ヒト胚性幹細胞の単細胞培養の生成とその後の神経前駆細胞への分化のためのプロトコルである。プロトコルは、シンプルで堅牢でスケーラブルで、薬物スクリーニングや再生医療用途に適しています。

Abstract

ヒト胚性幹細胞(hESC)のインビトロ分化は、生物学的および分子レベルの両方で人間の発達を研究する能力を転換し、再生用途に使用する細胞を提供しました。コロニー型培養を用いたhESC培養に対する標準的なアプローチは、未分化のhESCおよび胚体(EB)を維持し、異なる胚層への分化のためのロゼット形成は非効率的で時間がかかる。ここで紹介する単細胞培養法は、コロニー型培養物の代わりにhESCを用いた方法である。この方法により、コロニー型hESCに匹敵するレベルでのhESCマーカーの発現を含む、未分化hESCの特徴を維持することができます。さらに、このプロトコルは、1週間以内にNPCを産生する単一細胞型hESCからの神経前駆細胞(NPC)生成のための効率的な方法を提示する。これらの細胞は、いくつかのNPCマーカー遺伝子を高度に発現し、ドーパミン作動性ニューロンおよびアストロサイトを含む様々な神経細胞型に分化することができる。hESC用のこの単細胞培養システムは、これらのプロセスの分子機構、特定の疾患の研究、および創薬画面の調査に役立ちます。

Introduction

ヒト胚性幹細胞(hESC)は、3つの一次生殖層に分化する可能性を有し、その後、様々な多能性前駆細胞系統に分化する。これらの系統は、その後、人体内のすべての細胞タイプを生じる.in vitro hESC培養システムは、ヒト胚発生を研究する能力を変革し、これらのプロセスが生物学的および分子レベルでどのように調節されるかについての新しい洞察を得るための貴重なツールとして機能してきました。同様に、ヒト患者から単離された体細胞のリプログラミングから生じる人工多能性幹細胞(iPSC)の研究は、様々な疾患に対する新しい洞察を提供する。また、hESC由来の前駆細胞および分化細胞は、幹細胞治療および薬物スクリーニング^{1、2、3、4}を含む研究に有用であり得る。

hESCは、広範な自己再生能力を有する多電位細胞である神経前駆細胞(NPC)に分化するように誘導することができる。続いて、これらの細胞は、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイト^5、6に分化することができる。NPCはまた、神経発達生物学と様々な神経疾患のインビトロ研究のための細胞システムを提供しています.しかしながら、hESCとNPCへのその分化を含む現在のコロニー型培養方法は非効率的であり、多くの場合、胚体(EB)およびロゼット形成^{5、7、8、9}と同様に共培養を伴う。これらのプロトコルは、低い生存率と自発的な分化を示し、より時間がかかります。

ここで紹介する、容易にスケーラブルで、hESC¹⁰の高密度単一細胞型培養を使用する改良された堅牢な培養システムである。Roh-キナーゼ(ROCK)阻害剤の含有は、hESC^{10、11、12、13、14}の単一細胞型培養中の生存効率を有意に高めることに寄与した。このカルチャシステムでは、hESC を簡単に保守および拡張できます。さらに、このプロトコルは、hESCの単一細胞型培養物からNPCを生成する効率的な方法を提示し、高純度NPCの産生を可能にする。

要約すると、hESCを用いた単一細胞型培養プロトコルは、NPCを含む様々な系統へのこれらの細胞の分化を研究する魅力的なモデルを提供する。このプロトコルは簡単にスケーラブルであり、したがって、再生療法や薬物スクリーニングを含む研究のための細胞を生成するのに適しています。

Protocol

1. hESC認定基底膜マトリックスコーティングプレートの調製

1. hESC認定基底膜マトリックス(材料表参照)溶液を少なくとも2~3時間または一晩でゆっくりと解凍し、ゲルの形成を避けます。
2. 基底膜マトリックスコーティングプレートを調製するために、冷間DMEM/F12で希釈マトリックスを2%の最終濃度にする。よく混合し、希釈されたマトリックス溶液の1 mLで6ウェルプレートの各ウェルをコーティングします。
3. 基底膜マトリックスコーティングプレートを室温(RT)で少なくとも3時間または4°Cの一晩でインキュベートする。
   注:基底膜マトリックスを有するプレートは、マトリックス溶液が除去され、プレートが使用される前に、4°Cで1週間保存することができます。

2. コロニー型hESCの単細胞hESC培養への適応

1. 基底膜マトリックス上で増殖したコロニー型H9(WA09)hESCのフィーダーフリー培養物を通過させ、ウェルから培地を吸引する(図1A)9。
2. DPBSの1 mLで1xを洗浄します。ウェルあたり1mLのディスパーゼ溶液(1 U/mL)を加え、37°Cで20分間インキュベートします。
3. ディスパーゼを取り除き、DMEM/F12の2 mLで細胞1xを穏やかに洗い、培地を取り除き、各プレートに2mLのDMEM/F12を加えます。
4. ゆっくりと上下にピペットをしてコロニーを取り外し、15 mLチューブに移します。
5. 370 x gで2分間ペレットを遠心分離し、培地を吸引する。
6. 細胞ペレットを単一細胞に解離するには、2mLの細胞剥離溶液(1x濃度、材料表参照)を加え、37°Cで10分間インキュベートします。
7. 370 x gで2分間の遠心分離細胞を取り外し、剥離溶液を除去する。
8. 新鮮なmTeSR1ヒトESC培地を追加し、穏やかなピペット上下によって単一細胞に細胞を解解き分けます。
9. コロニー型hESCを単一細胞型培養に適合させるには、10μM ROCK阻害剤を24時間含むmTeSR1の2mLの基底膜マトリックスコーティング6ウェルプレートの各ウェルに約1.5〜2.0 x 10⁶ hESCをプレートする(図1A)。
10. 24時間後、hESC培地をROCK阻害剤なしで新鮮なmTeSR1に交換し、hESCが3日間単一細胞型として成長できるようにします。毎日メディアを変更します。
11. 4日目に、培養物が100%近いコンフルエンスに達したら、剥離溶液中の細胞を解離し、次いでステップ2.6に記載の方法で再プレートする。
    注:ROCK阻害剤は、単一細胞型hESC培養の初期24時間の間に細胞生存率を向上させる。

3. 胚体形成と3つの生殖層への分化 (図2)

1. EBを形成するには、最初の24時間の間に10μM ROCK阻害剤を用いてmTeSR1培地の3 mLで細胞を再サスペンドし、次に37°インキュベーターで60mmの低付着皿に一晩インキュベートして凝集を可能にする。
2. 24時間後、小さなEBは15 mLチューブに移される。EBをチューブの底部に落ち着かせ、ピペットで媒体を軽く取り除きます。EB培地にEBを転写し(20%ノックアウト血清置換を補ったノックアウトDMEM、1xグルタミンサプリメント[材料表を参照]、1%NEAA[非必須アミノ酸;材料表]、および0.2%β-メルカプトエタノールを参照)、7日間低い付着皿で拡大することを可能にする。培地は、上述したように1日おきに変更することができます(図2A)。
3. 7日目に、食器からEBを収集し、15 mLチューブに転送します。ピペットで媒体を軽く取り出し、ベース膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレートにEBを移します。
4. EBをプレートに取り付け、EB培地で12日間インキュベートし、その間に3つの胚芽層に分化させます(図2B)。1 日おきにメディアを変更します。
   メモ:セルの凝集中に、低い添付ファイルの皿はEBの付属品を避けるのに役立つ。

4. 単一セル型hESCをNPCに差別化する (図 3)

1. NPC分化を誘導するには、1mLの剥離溶液(1x)で単一細胞型hESCを解離し、37°Cで10分間インキュベートする。
2. 370 x gで2分間細胞を遠心分離し、剥離溶液上清を除去する。DMEM/F12を1mL加え、穏やかなピペットで細胞を再サスペンドします。
3. 10μM ROCK阻害剤を含有するmTeSR1の2mLにおける2x¹⁰⁵細胞/ウェルの密度で基底膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレート上のプレートセル。
4. 24時間後、培養培地を1μMドルソモルフィンと5μM SB431542を補充した神経誘導培地(DMEMと1%B27からビタミンA)に交換します。
5. 神経誘導の最初の4日間は1日おきに培地を交換し、その後7日目に合流に達するまで毎日を変更する(図3B)。
   注:(1)ドルソモルフィンはALK2,3,6受容体を標的とすることによりBMP経路を阻害し、AMPKを阻害する;SB431542はALK5,7を標的とすることによりTGFβ/アクチビン経路の阻害剤である。(2) 同じプロトコルを別の ESC 回線(WA01)でテストし、WA09¹⁶と同様の結果をもたらしました。(3)我々は、一般的に基底膜マトリックスにマトリゲルを使用しています。しかし、細胞をゲルトレックス上で培養し、いくつかのNPCマーカーの発現によって示されるように非常によく似た結果を持つNPCに分化することができます(図4D,E)。マトリゲルと同じ方法でゲルトレックスを取り扱います(セクション1を参照)。

5. NPCの拡大と凍結保存

1. 神経誘導の7日後、1mLの剥離溶液(1x)で細胞を解離し、37°Cで10分間インキュベートする。
2. 370 x gで2分間細胞を遠心分離し、剥離溶液上清を除去する。NPC 膨張媒体を 1 mL 加え(材料表を参照)、穏やかなピペットによって細胞を再サスペンドします。
3. 基底膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレート上のNPC膨張培地の2mL中のプレート1x105細胞。
4. 培養が90%近くに達すると、必要に応じて何度もNPCを通過する。最初の3~4回の通路では、細胞死を防ぐために、最初の24時間に10μM ROCK阻害剤を添加します。これらの通路の後、細胞はROCK阻害剤なしで通過および培養することができる。拡張中に 1 日おきにメディアを変更します。
5. 培養が合流に達すると、凍結NPC。
   1. 凍結保存のために、37°Cで5分間剥離溶液(1x)の1mLで細胞を解離し、次いで370 x gで2分間遠心分離懸濁液を除去する。
   2. 細胞凍結溶液(材料表参照)を加え、1 x 10⁶細胞/mLでNPCを解剖し、1mLのアリコートをクライオビアーに分配します。
   3. 凍結容器に凍結容器に入れ、-80°Cの冷凍庫に一晩保存します。
6. 凍結膜を液体窒素に入します。

6. ポリL-オルニチン(PLO)およびラミニンコーティングプレートの調製

1. PLO/ラミニンコーティングプレートを調製するには、PLO原液をPBSまたは水に希釈し、最終濃度10μg/mLにします。よく混ぜ、希釈されたPLO溶液の1 mLで6ウェルプレートの各ウェルをコーティングします。
2. 少なくとも2時間、37°Cでインキュベートするか、4°Cで一晩インキュベートする。
3. PBSでそれぞれをよく洗います。
4. 冷たいPBSまたは水の希薄ラミニン原液を10μg/mLで希釈します。ラミニン溶液をよく混ぜます。PBSを取り外し、直ちにラミニン溶液1mLで各ウェルをコーティングします。プレートは4°Cに保ち、1週間以内に使用してください。PBSで洗浄し、すぐに培養培地を追加します。
   メモ:PLO/ラミニンコーティングプレートを乾燥させないでください。

7. ドーパミン作動性ニューロンへのhESC由来NPCの分化 (図 6A)

1. 約50%の密度でNPC膨張媒体中のPLO/ラミニンコーティングされた料理のプレートNPC。
2. 24時間後、培地をDA1培地(2mMグルタミンサプリメントを含む神経バサバル培地、1x NEAA、1x B27、200ng/mL SHH、および100ng/mL FGF8)に変更し、1日おきに培地を変更する。
3. 彼らが合流に達したときの通路文化。1 mLの剥離溶液(1x)で細胞を解離し、37°Cで10分間インキュベートする。
4. 370 x gで2分間細胞を遠心分離し、剥離溶液上清を除去する。DA1培地を1mL加え、穏やかなピペットで細胞を再サスペンドします。
5. プレート1 x 10⁵細胞を2mLのDA1培地でPLO/ラミニンコーティング6ウェルプレートに記載。
6. 10日後、DA2培地(2mMグルタミンサプリメントを含む神経バサガル培地、1x NEAA、1x B27、200μMアスコルビン酸、20ng/mL BDNF、および20 ng/mL GNDF)に変更し、さらに20日間1日おきに培地を変更する(図6A)。
   メモ:DA2培地に新鮮なアスコルビン酸を毎日追加します。最初の14日以内に、分化した細胞は90%のコンフルエンスに達したときに渡されるべきですが、その後は渡す必要はありません。

8. ESC由来NPCをアストロサイトに分化する

1. 約50%の密度でNPC膨張培地中のPLO/ラミニンコーティングプレート上のプレート神経前駆細胞。
2. 24時間後、培地をアストロサイト培地(DMEM/F12培地を含む1:100 N2、1:100 B27、200ng/mL IGF、10ng/mLアクティビンA、10ng/mLヘレグリンβ-1、および8 ng/mL bFGF)に変更し、1日おきに培地を変更する。
3. 彼らが合流に達したときの通路文化。1 mLの剥離溶液(1x)で細胞を解離し、37°Cで10分間インキュベートする。
4. 370 x gで2分間細胞を遠心分離し、剥離溶液上清を除去する。1 mLのアストロサイト培地を追加し、穏やかなピペットによって細胞を再サスペンドします。
5. PLO/ラミニンコーティングされた6ウェルディッシュ上のアストロサイト培地の2 mL中のプレート1 x 10⁵細胞。
6. 差別化を合計 5 ~ 6 週間継続できるようにします (図 6B)。

9. 免疫蛍光染色

1. 上記の細胞タイプごとに35mmμ皿で培養する。培地を吸引し、1皿あたり4%PFA溶液の1 mLを加え、RTで20分間インキュベートします。
2. PBSで2xを5分間洗う。
   注:細胞が固定されると、アッセイプレートをパラフィルムで密閉し、4°Cで保存することができます。固定後1週間以内に抗体で染色する。
3. 1皿あたり300μLのブロッキング溶液(PBSのヤギまたはロバ血清)を加え、RTで30~60分間インキュベートします。
4. 料理2xをPBSで5分間洗います。
5. 300 μLの一次抗体(表1)溶液(ブロッキング溶液で希釈)を加え、RTで1.5時間または4°Cで一晩インキュベートします。
6. PBSで2xを10分間洗う。
7. 300 μL の蛍光共役二次抗体 (表 1)をブロッキング溶液に加え、暗闇の中で1時間RTでインキュベートします。
8. 細胞を2倍にPBSで10分間洗浄します。
9. ハフスト染色液(PBSでは1μM最終濃度)を加えて核を染色します。暗闇の中の細胞をRTで5分間インキュベートします。
10. 細胞1xをPBSで5分間洗浄し、500μLのPBSを加える。皿を暗闇の中に置き、共焦点顕微鏡で蛍光を観察します(図2B、図5C、図6A、図7B)。

Results

ここで提示する、hESCの単一細胞型培養の維持と拡大のための改良されたプロトコルと、神経前駆細胞への効率的な分化は、その後、様々な下流の神経系統に分化し、ドーパミン作動性ニューロンおよびアストロサイトを含む。

代表的な位相差画像は、コロニー型hESCを単一細胞型培養物に適応させる間、異なる工程で細胞形態を示す(図1A)。単細胞培養条件を通じて、適合したhESCを高密度に維持することができ、その後、コンフルエントに達すると容易かつ効率的にサブカルチャー化できることがわかった(図1A,B)。これらの細胞は、コロニー型hESCの典型的な細胞周期特性(すなわち、S相における細胞の短いG1位および高い割合)を保持した(図1C,D)。また、ESCマーカー(すなわち、OCT4、TRA 1-81、SOX2、およびNANO...

Discussion

様々な系統へのhESCの分化および十分な数の分化細胞の生成のためのスケーラブルで効率的な方法は、薬物スクリーニングおよび幹細胞治療のための重要な基準である。様々な単細胞通過方法が公表されており、細胞は生存を改善するためにROCK阻害剤または他の小分子の存在下で培養されるが、これらの培養方法の最終産物はコロニー型hESC17、18、19、20、21である。以前に公開された方法^{19、20、21、22}に部分的に基づく単一セル ESC プロトコルは、単一セル型 hESC...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm m-dishes	ibidi	81156	細胞培養ディッシュ
6 ウェルプレート	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104-500	細胞剥離液
Activin A	R&Dシステム	338-AC-050
アスコルビン酸	Sigma Aldrich	A4403
B27 サプリメント	サーモフィッシャー	17504044
B27 サプリメント (-Vit A)	サーモフィッシャー	12587010
BDNF	Applied Biological Materials	Z100065
bFGF	Peprotech	100-18C
遠心分離機	DAMON/ICE	428-6759
CO2インキュベーター	サーモフィッシャー	4110
コーニング hESC-qulified マトリックス (Magrigel)	コーニング	354277	基底膜マトリックス (ここではほとんどのプロトコルに使用)
クライオスター CS 10	Stemcell Technologies	7930	細胞凍結液
ディスパーゼ	Stemcell Technologies	7923
DMEM	サーモフィッシャー	10569-010
DMEM/F12	サーモフィッシャー	10565-018
ドルソモルフィン	トクリス	3093
EGF	ペプロテック	AF-100-16A
ウシ胎児血清	フィッシャー サイエンティフィック	SH3007003HI
FGF8	応用生物材料	Z101705
GDNF	Applied Biological Materials	Z101057
Geltrex matrix	Thermo Fisher	A1569601	Basement membrane matrix
GlutaMax	Thermo Fisher	35050061	Glutamine supplement, 100X
H9 (WA09) ヒト胚性幹細胞株	WiCell	WA09
ヘレグリン b-1	Peprotech	100-3
IGF	Peprotech	100-11
ノックアウト DMEM	サーモフィッシャー	10829018
ノックアウト血清交換	サーモフィッシャー	10828028
ラミニン	シグマ アルドリッチ	L2020
mTeSR1	ステムセルテクノロジー	85850	hESC 培地
N2 サプリメント	サーモフィッシャー	17502001
NEAA	サーモフィッシャー	11140050
ニューロベース	サーモフィッシャー	21103049
ポリ-L-オルニチン	Sigma Aldrich	P3655
ROCK 阻害剤	Tocris	1254
SB431542	Tocris	1614
SHH	Applied Biological Materials	Z200617
Stemdiff 神経前駆細胞培地	Stemcell Technologies	5833	NPC 拡張培地