ここでは、ゼブラフィッシュ胚および幼虫の全製剤におけるタンパク質の蛍光抗体媒介検出に関するプロトコルを提示する。
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この記事について
サマリー
要約
免疫賦技化学は、正常な発達状態と疾患状態の両方でタンパク質の発現および局在を調べる広く使用されている技術です。多くの免疫組織化学プロトコルは哺乳類の組織および組織切片に最適化されているが、これらのプロトコルは、多くの場合、非哺乳類モデル生物の修飾および最適化を必要とする。ゼブラフィッシュは、発達過程の分子、遺伝、細胞の生物学的メカニズムを調べるための基礎的、生物医学的、および翻訳的研究のモデルシステムとしてますます使用されています。ゼブラフィッシュはモデルシステムとして多くの利点を提供しますが、最適なタンパク質検出のために修正技術も必要です。ここでは、ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全実装蛍光免疫化学に関するプロトコルを提供します。このプロトコルでは、さらに、使用できるいくつかの異なる取り付け戦略と、各戦略が提供する利点と欠点の概要について説明します。また、このプロトコルの改変により、全実装組織における発がん基質の検出と、切片された幼虫組織における蛍光検出を可能にする。このプロトコルは、多くの発達段階および胚構造の研究に広く適用可能である。
概要
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、短期間、急速な発達、遺伝的手法の評価可能性など、いくつかの理由から、生物学的プロセスの研究のための強力なモデルとして登場しました。その結果、ゼブラフィッシュは、一般的に、毒性研究や創薬のためにハイスループットの低分子スクリーンで使用されています。ゼブラフィッシュはまた、単一の女性が日常的に一度に50〜300個の卵を生産することができ、光学的に透明な胚が外部的に発達し、発生過程を効率的に視覚化できることを考えると、発達プロセスの研究のための魅力的なモデルである。しかし、初期の研究は、逆遺伝的技術を確立する際の課題のために、N-エチルN-ニトロソーレ(ENU)または他の変異原体を使用して前方遺伝的スクリーンに主に依存していた。およそ20年前、ゼブラフィッシュで最初にモルフォリノが使用され、標的遺伝子1をノックダウンしました。モルフォリノスは、初期の発生段階で胚への微小注入後の標的mRNAの翻訳を阻害する小さなアンチセンスオリゴヌクレオチドである。モルフォリノの主な弱点は、細胞が分裂するにつれて希釈され、一般的に受精後72時間(hpf)によって有効性を失うことである。形態素はゼブラフィッシュ遺伝子破壊のための強力なツールであり続けるが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、およびクラスター化された定期的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート(CRISPR)は、ゼブラフ....
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プロトコル
このプロトコルに記載されているゼブラフィッシュ繁殖成人および胚を扱うための手順は、マレー州立大学の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された。
1. 胚の採取と固定
- 一晩システム水で満たされたメッシュまたはスロットライナーでタンクに大人のゼブラフィッシュ混合セックスペアまたはグループを配置することにより、産卵タンクを準備します。
- ライトが点灯している時に、新鮮な水を取り除くために産卵タンク水を交換してください。午前9時に点灯するライトで14時間/10時間のライトダークサイクルを使用してください。
- 卵が産まれると、大人を家庭用タンクに戻します。
- 転送ピペットを使用してそれらを描くか、メッシュストレーナーにそれらを注ぐことによって卵を収集します。
- 胚培地(0.5 mg/Lメチレンブルーの30%ダニオーまたはE2胚培地など)で半分に充填されたペトリ皿に卵を移し、1皿当たりの胚数を50個に制限する。
- 死んでいるか、分割に失敗した卵を取り除きます。
注:死んだ胚は、不透明になり、しばしば「曇っている」ように見えるため、容易に識別できます。メチレンブルーを胚培地に添加すると、死んだ胚は濃い青色の外観を取る。 - 卵の料理を所望の段階に達するまで28.5 °Cでインキュベートします。この実験では、胚を23hpfまで上げます。
- ....
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結果
全実装免疫組織化学は、無傷の動物におけるタンパク質発現の空間パターンを検出するために抗体を使用する。免疫組織化学の基本的なワークフロー(図1に示す)は、ゼブラフィッシュの繁殖、胚の発生および調製、非特異的抗原のブロッキング、目的のタンパク質を標的とする抗原特異的一次抗体の使用、標識された二次抗体を有する一次抗体の検出、標本の取り付け、および文書化を含む。
全実装免疫賦体化学は、ゼブラフィッシュの開発中に空間的および時間的なタンパク質発現の研究に役立つ貴重なツールです。ゼブラフィッシュは、運動ニューロンが接触する前の19hpfの前に始まるギャップ接合によって媒介される自発的収縮を示す19。ゼブラフィッシュ神経筋接合は、他の脊椎動物と同様に、ニコチン性アセチルコリン受容体で作用するアセチルコリンによって媒介される。これらの組み立て型受容体は、まず約1.......
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ディスカッション
免疫組織化学は、生物に関心のあるほぼすべてのタンパク質の時空間的発現を特徴付けるために使用できる汎用性の高いツールです。免疫組織化学は、多種多様な組織およびモデル生物に使用される。このプロトコルはゼブラフィッシュでの使用のために最適化されています。異なる種の免疫組織化学は、異なる固定および取り扱い技術、種および内因性ペルオキシダーゼの存在に応じて溶液を遮断し、組織の厚さと組成によるインキュベーション時間を必要とするかもしれない。ゼブラフィッシュのIHCは、癌24、代謝疾患25、神経疾患26、および人間の健康に大きな関連性を持つ他の多くの分野の理解を進める上で不可欠であった。IHCの大きな利点の1つは、この手順がISHなどの他の技術と比較して比較的短く、技術的に要求が厳しくなくてはならないということです。しかし、検体の年齢、標的とする抗原、および使用されている抗体に基づいて最適化を必要とする多数のステップがあります。
このプロトコルの複数のス.......
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開示事項
著者らは開示する情報を持っていません。
謝辞
NIH助成金8P20GM103436 14からの資金。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アガロー | フィッシャー サイエンティフィック | BP160-100 | |
| アルミ箔、ヘビーデューティー | カークランド | 任意のブランドを代用可能 | |
| 抗NMDA抗体 | ミリポア シグマ | MAB363 | |
| 抗リン酸化ヒストン H3 (Ser10)、クローン RR002 | ミリポア シグマ | 05-598 | |
| 抗パン AMPA 受容体 (GluR1-4) | ミリポア シグマ | ||
| ウシ血清アルブミン (BSA) | フィッシャーサイエンティフィック | BP1600-100 | |
| 硝酸カルシウム [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| 遠心分離チューブ、1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| クリア マニキュア | サリー・ハンソン | 任意のマニキュアまたは硬化剤を代用できます | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES 超純水中。 | ||
| 胚培地、E2 | 7.5 mM NaCl、0.25 mM KCl、0.5 mM MgSO4、75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L メチレンブルー | ||
| フローティングチューブホルダー | Thermo Scientific | 59744015 | |
| 蛍光化合物顕微鏡 | Leica Biosystems | DMi8 | |
| 蛍光実体顕微鏡 | ライカBiosystems | M165-FC | |
| ガラスカバースリップ 18 mm x 18 mm | Corning | 284518 | |
| ガラスカバースリップ 22 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| スライドガラス | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| グリセロール | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| ヤギ抗マウス IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES溶液 | Sigma Aldrich | H0887 | |
| 蓋付き湿潤チャンバー | Simport | M920-2 | |
| 過酸化水素、30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap ペン | Vector labs | H-4000 | |
| 昆虫ピン、サイズ00 | Stoelting | 5213323 | |
| 硫酸マグネシウム(MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| メッシュストレーナー | Oneida | 任意のブランドを置き換えることができます | |
| メタノール | Sigma Aldrich | 34860 | |
| メチレンブルー | Sigma Aldrich | M9140 | |
| マイクロチューブキャップロック | 研究製品 国際 | 145062 | |
| 電子レンジ | トーストマスター | ||
| マウス IgG | シグマ アルドリッチ | I8765 | |
| ノーマル ヤギ血清 | ミリポア シグマ | S02L1ML | |
| ナットミキサー | フィッシャー・サイエンティフィック | 88-861-044 | |
| パラホルムアルデヒド | フィッシャー・サイエンティフィ | 04042-500 | |
| パスツール・ピペット | フィッシャーScientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | フィッシャーケミカル | SP15-500 | |
| ペトリ皿 (ガラス) | パイレックス | 3160100 | |
| ペトリ皿 (プラスチック) | フィッシャーサイエンティフィ | FB0875713 | |
| 1-フェニル 2-チオ尿素 | アクロス オーガニックス 207250250 | ||
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、10x、pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、1x | 1x dH2O | ||
| 塩化カリウム (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| 水酸化カリウム (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| リン酸カリウム一塩基性 (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| 塩化ナトリウム (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| リン酸二塩基性ナトリウム (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| ふたとインサート付き産卵タンク | Aquaneering ZHCT100 | ||
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + スライド | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM トリス、pH 8.0;150 mM NaCl;0.1% トゥイーン20;dH2O | ||
| トランスファーピペット | ッシャー13-711-7M | ||
| トリクロロ酢酸(Cl3CCOOH) | シグマアルドリッチ | T6399 | |
| トリスベース | フィッシャーサイエンティフィック | S374-500 | |
| トンX-100 | グマアルドリッチ | T9284 | |
| イーン20 | ッシャーサイエンティフィック | BP337-500 | |
| 超極細鉗子 | フィッシャー・サイエンティフィック | 16-100-121 | |
| 水・超高純度/二重蒸留 | フィッシャー・サイエンティフィック | W2-20 |
参考文献
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31
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