中国ハムスター卵巣細胞培養におけるハイスループット自動マイクロバイオリアクターを用いたプロセス最適化

Summary

ここでは、自動マイクロバイオリアクターで実験計画を実行し、その後にプロテインAカラムを用いた細胞収穫およびタンパク質定量を行う詳細な手順を提示する。

Abstract

バイオプロセスの最適化は、バイオ医薬品業界において、望ましい製品の収量を増やすために重要です。これは、ひずみの選択とバイオプロセスパラメータの開発によって達成することができます。この目的のために振るフラスコが使用されています。しかし、pHや溶存酸素(DO)などのプロセスパラメータを制御する能力がありません。この制限は、自動化されたマイクロバイオリアクターの助けを借りて克服することができます。これらのバイオリアクターは、より大きなスケールでの栽培を模倣します。このシステムの大きな利点の1つは、実験計画(DOE)をソフトウェアに統合することです。この統合により、複数のプロセスパラメータを同時に変更できる設計を確立できます。重要なプロセスパラメータと最適なバイオプロセス条件は、ソフトウェア内で分析できます。ここで紹介する作業の焦点は、ソフトウェアのプロセス設計に関わるステップと、栽培の過程におけるDOEの組み込みについて、ユーザーに紹介することです。

Introduction

世界のバイオ医薬品市場は2018年に2,500億米ドル以上の価値があり、継続的に^拡大しています 1 .製薬会社は、小分子薬の製造から組み換えタンパク質などのバイオテクノロジーで製造された治療薬に移行しています。これらだけでも1,500億ドル以上の収益^が1.5億ドルを超える。哺乳動物細胞は現在、これらの医薬組換えタンパク質の生産に広く使用されている。現在の期間において、哺乳動物細胞によって産生される68の承認された製品のうち、57は中国のハムスター卵巣細胞^(CHO)2によって産生される。CHO細胞は、翻訳後修飾を必要とする組換えタンパク質の製造に特に使用されます。これらの細胞は、懸濁液中で増殖し、それによって血清フリーの化学的に定義された培地^33、44で再現可能な結果を可能にする好ましい。CHO細胞を用いるもう1つの利点は、産物のグリカン構造がヒトモノクローナル抗体(mAb)に類似しており、遺伝子増幅による組換えタンパク質収率および特異的生産性の向上^{をもたらす5。}

組換えCHO(rCHO)細胞培養の収量は、過去20年間で100倍に増加しました。この改善は、プロセスパラメータ....

Protocol

1. 前培養手順

注:このプロトコルには、生存細胞濃度が1 x 10^7セル/mLの組換えCHO DG44細胞が使用されます。

1. 細胞1.2mLを含むバイアルを室温まで解凍し、10mLのコールドシード培地を含む15mL円錐遠心管に細胞懸濁液を直ちに移す。
2. 円錐状遠心管を190xgと室温で5分間遠心しg、上清を捨てる。
3. 500mLの振れフラスコでシード培地の150mLを36.8°Cに予熱する。
4. 細胞ペレットを10mL前温めの種子培地で静かに再懸濁し、細胞をシェイクフラスコに移します。
5. フラスコからサンプルの1 mLを使用して、セルカウンターを使用して初期のVCCと生存率を測定します。
   注:成功した栽培のために解凍した後、生存率は70%を超える必要があります。
6. 36.8 °Cの軌道シェーカー(シェーカー直径19mm)と7.5%CO2の揺れフラスコを120rpmの振れ速度でインキュベートします。₂
   注:これらの条件は、細胞株および培地によって異なる。
7. 細胞を通過した3日後、シェーカーから振るフラスコを取り出し、層流キャビネットの下に置きます。1 mLのサンプルを採取し、最終的....

Results

この研究で行われた栽培の概要を図2に示す。

図2:培養局におけるpHおよび撹拌速度プロファイルを試験するための実験条件の概略表現。図はまた、船を配置するための正しいレイアウトを表しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

自動化されたマイクロバイオリアクターの細胞増殖は、多用途バイオリアクターに匹敵する。これは 図3に示し.......

Discussion

収量を増やすためにプロセスの最適化は、バイオ医薬品業界で非常に重要です。シェイクフラスコは、潜在的に株のスクリーニングに使用することができます。ただし、pH や DO などのプロセス パラメータの監視はフラスコでは使用できません。マイクロバイオリアクターは、プロセスの継続的な監視と制御を可能にする利点があります。マイクロバイオリアクターにおけるこれらの制御ループは、より大きなスケールでの条件と同様の条件を提供し、したがって、より大規模なバイオリアクターに匹敵する結果を提供する。マイクロバイオリアクターのもう一つの利点は、時間および労力^12、13,の点でベンチトップバイオリアクターと比較したときに、同じ時間枠内で低コストで試験することができる条件の広い範囲^である。小さいサイズはまた、基板の量が減少し、並列操作のためのスペースの要件を減らすことによる低ランニングコストの点でも有利です。しかし、ベンチトップ多用途バイオリアクターと比較すると、単回使用マイクロバイオリアクターで栽培を実行する方が高価である可能性があるため、船舶の.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL ディスポーザブル ピペット チップ、滅菌済み	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0040
200 mM L-グルタミン	コーニング、メルク	25-005-CV
24 ウェル ディープ ウェル プレート	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0038
5 mL ディスポーザブル ピペット チップ、滅菌済み	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0039
ambr 15 自動化マイクロバイオリアクターシステム	Sartorius Stedim Biotech GmbH	001-2804
ambr 15 細胞培養 24 使い捨てバイオリアクター - Sparged	Sartorius Stedim Biotech GmbH	001-1B86
Antifoam C Emulsion	Sigma-Aldrich, Merck	A8011
Bottle Top Sterile filter	Corning, Merck	CLS431474	0.1 μ細孔径
CEDEX 洗剤 (3% ムコゾール)	Roche Innovatis AG	05-650-658-001
セルカウンター	Roche Innovatis AG	05-650-216-001	CEDEX HiRes
CHO DG44 細胞株	Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH
CHOKO Feed Media A (FMA)	Sigma-Aldrich, Merck	CR80025
CHOKO Feed Media B (FMB)	Sigma-Aldrich,メルク	CR80026
CHOKO 生産培地	Sigma-Aldrich, メルク	CR80027
CHOKO ストックカルチャー Meium	Sigma-Aldrich, Merck	CR80028
Chromaster 高圧液体クロマトグラフィーシステム	VWR 国際
円錐遠心分離管	コーニング, メルク	SIAL0790
エタノール	メルク
Glycine	Carl Roth	56-40-6
HPLC Vials	VWR International	SUPLSU860181
PBS	Sigma-Aldrich,Merck	P4417
Protein A カラム	Thermo Fisher Scientific	1502226	POROS™A 1.7 mL
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich,Merck	7647-14-5
リン酸二塩基性無水	Sigma-Aldrich,Merck	7558-79-4
Trypan Blue	VWR International	VWRVK940
	YSI YSI Inc	2900D	YSI 2900 Select