Method Article

Brainbowとタイムラプス共焦点イメージングを用いた生きているゼブラフィッシュの発達脳の可視化

DOI:

10.3791/60593

⸱

March 23rd, 2020

 ,  , 
1Biology Department, Lewis & Clark College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

インビボイメージングは、神経系の発達の根底にある細胞メカニズムを調査するために使用できる強力なツールです。ここでは、開発中のゼブラフィッシュ神経系の中で、多色Brainbow標識細胞をリアルタイムに可視化するために、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いる手法について説明する。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脊椎動物神経系の発達には、複雑な細胞行動と相互作用の正確な調整が必要です。高分解能in vivoイメージング技術を用いることは、生物におけるこれらのプロセスに明確な窓を提供することができる。例えば、細胞とその子孫の分裂は、神経系が形成するにつれてリアルタイムで追跡することができる。近年、多色技術の技術の進歩は、調査できる質問の種類を拡大しています。多色Brainbowアプローチは、細胞の間で区別するだけでなく、それぞれが1つの前駆細胞から派生する関連する細胞の複数の異なるクローンを色分けするためにも使用できます。これにより、開発中に多くの異なるクローンとその動作を同時に多重系統解析できます。ここでは、開発中のゼブラフィッシュ神経系の中で、多色Brainbow標識細胞をリアルタイムで可視化するために、タイムラプス共焦点顕微鏡を使用する技術について説明します。これは、従来のプロモーター駆動色を使用して差し分化ラベルを付け難い細胞間の細胞相互作用に従う場合に特に有用である。このアプローチは、複数の異なるクローン間の系統関係を同時に追跡するために使用できます。この手法を使用して生成される大規模なデータセットは、遺伝的または薬理学的操作全体で定量的に比較できる豊富な情報を提供します。最終的に生成された結果は、神経系がどのように発達するかについての体系的な質問に答えるのに役立ちます。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

開発の初期段階では、特殊な前駆細胞のプールが増殖ゾーンで繰り返し分裂し、多様な娘細胞を産生する。この発達期に生まれた細胞は、分化し、新生器官を形成するために移動します。神経系では、放射状グリアなどの前駆物質は、心室領域の未熟なニューロンを生じさせる。ニューロンが心室から離れて成熟するにつれて、膨張する組織は最終的に脳11、2、3、4、5、62,3,4,5の非常に複雑な構造を6形成する。ニューロンの前駆体の分裂と分化と移動との間の調整は、脳の最終的な大きさ、形状、したがって機能を決定し、行動77、8、9、108,9,10に直接影響を与える。これらのプロセスを厳しく制御することは、正常な脳の発達にとって明らかに重要ですが、これらのダイナミクスを調節するグローバルメカニズムはよく理解されていま....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

動物の被験者を含む手続きは、ルイス&クラーク大学の制度的動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. ゼブラフィッシュ胚の微小注入

  1. マイクロインジェクション39、40,40を行う前の午後、野生型、大人のゼブラフィッシュをセックス分離交配タンクに設置する。
  2. マイクロインジェクションの朝にDNA溶液を調製する。希薄hsp:ゼブラボウ11プラスミドDNAは、0.1 mM KCl中の約10ng/μLの濃度に、フェノールレッド2.5%および3.75U Creリコンビナーゼ酵素を有する。
  3. 受精39,41の45分以内に1細胞ゼブラフィッシュ胚へのDNA溶液のマイクロインジェクションを41行う。この溶液の約4.2 nLを各胚に注入し、プラスミドDNAの約42pgに相当する。
    注:Tg(ubi:Zebrabow) 15 や Tg(neurod:Zebrabow) Tg(neurod:Zebrabow)18....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このセクションは、ここで説明するin vivo多色タイムラプス撮像アプローチを用いて得ることができる結果の例を示す。我々は、開発中のゼブラフィッシュ後脳14の増殖性心室領域における細胞のBrainbow色分けクローンを示す(図1)。

通常、Brainbow標識された細胞が特定の放射状繊維に沿って配置されたとき、それらは同じ色(図1D)を共有し、これは相対的なRGBチャネルの重みとして定量化することができる(図1E)。これは、これらの放射状基が分裂細胞のクローンであり、ゼブラフィッシュ、マウス、およびひよこ14、15,15の以前の研究で観察されたように、それらの類似の色がクローン関連であると同定するために使用できることを示唆している。Brain.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコルは、開発中のゼブラフィッシュ後脳における前駆細胞およびニューロンのクローンを可視化し、Brainbowおよびタイムラプス共焦点顕微鏡11を用いて生体内でそれらに従う方法を説明する。インビトロまたはエキビボ研究と比較してこのプロトコルの主な利点は、時間の経過とともに脊椎動物の脳の増殖帯を直接観察する能力である。この技術は、レトロウイルスベクターを使用して単一のクローンを標識した以前の研究に基づいています。対照的に、hsp:Zebrabowを使用すると、多くのクローンを同時にカラーコードを構築し、多重系統トレースとクローン11のダイナミクスに焦点を当てることができます。このプロトコルは、他のシステムや細胞タイプの開発に焦点を合わせて変更できます。例えば、異なるBrainbow構築物はゼブラフィッシュ胚で発現することができる。hspでゼブラフィッシュhsp70プロモーターを使用すると、神経前駆物質やニューロン11を含む熱ショック後の様々な細胞型のモザイク.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

技術的および知的な貢献に対して、Y.A.パン、J.リベット、Z.トビアスに感謝します。この作品は、国立科学財団(賞1553764)とM.J.マードック慈善信託によって支援されました。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5mLトランスファーピペット(細先端)Globe Scientific, Inc.134020
1-フェニル-2-チオ尿素(PTU)アルファエーザーL06690胚の色素沈着を防ぐためにE3で0.2 mMに希釈
50 mLコニカルチューブコーニング352070熱衝撃胚用
6ポンドナイロン釣り糸SecureLineNMT250胚マニピュレーター7.5
mLトランスファーピペットGlobe Scientific, Inc.135010
CaCl2SigmaC3881E3
綿棒ピューリタン867-WC 接着剤なし胚マニピュレーターを作るため
Cre recombinaseニューイングランド バイオラボM0298M
デジタル ドライバスGenemate490016-616LMA を 42 °C で保存するために使用されます。C
落射蛍光解剖スコープ
ガラスキャピラリーチューブワールド精密機器TW100F-4
インキュベーターForma Scientific3158胚を28°に維持するため;C
インジェクションプレート金型適応科学ツールTU-1
Isotemp ウォーターバスフィッシャーサイエンティフィック2320熱衝撃胚用
KClAMRESCO0395E3および注射用DNA溶液用
レーザー走査型共焦点顕微鏡ツァイスLSM710
LEアガローGenemateE3120作成するアガロース注入プレート
低溶融アガロース(LMA)AMRESCOJ234
嵌合タンクAquaneering, Inc.
メチレンブルーシグマM9140E3
MgSO4Sigma9397E3
マイクロマニピュレーターワールド精密機器M3301
マイクロピペットプーラーサッター機器株式会社P-97
MS-222 トリカイン-Sウエスタンケミカル社逆浸透(RO)水で4mg/mLで調製し、その後、E3に滴下して最終濃度0.2mMまで添加し、胚を麻酔します
NaClJ.T. Baker4058-01E3
トリ皿用(90mm、60mm)ネシーサイエンティフィック32-107G胚を収容し、イメージングチャンバーを作成する(60mm)
フェノールレッドシグマP0290
ソフトステッチリングマーカークローバー・ニードルクラフト株式会社354ペトリ皿でイメージングチャンバーを作るため
瞬間接着剤(ウルトラゲルコントロール)ロックタイト1363589胚マニピュレーターを作るため
シリンジ針ベクトン・ディキンソンBD329412胚のデコレーション用
を作るため 用 ス ZHCT100用 ペジェ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
  2. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Brainbow ImagingTime lapse ConfocalZebrafish Nervous SystemNeural Progenitor CellsClonal Lineage AnalysisMulticolor FluorescenceIn Vivo ImagingCell Division TrackingApoptosis DetectionInterkinetic Nuclear Migration

Related Articles