レーザーキャプチャー微小解剖とマイクロ流体qPCRを組み合わせて単一細胞の転写プロファイルを解析する:オピオイド依存へのシステム生物学アプローチ

サマリー

このプロトコルは、レーザーキャプチャマイクロ解剖を使用して、扁桃体の中心核から単一のニューロン、ミクログリア、およびアストロサイトを高精度かつ解剖特異性で収集する方法を説明します。さらに、これらの細胞のトランスクリプトームのサブセットを測定するためのマイクロ流体RT-qPCRの使用について説明する。

要約

解剖学的に隣接する単一細胞における深い転写ヘテロジニティは、細胞表現型多様性によって堅牢な組織機能が達成される可能性があることを示唆している。生体系のネットワークダイナミクスを調べている単細胞実験は、生物学的に意味のある分解能で様々な条件に対する細胞および組織応答を実証する。ここでは、解剖学的に特定の場所から単一細胞を収集し、その遺伝子発現プロファイルのサブセットを正確に測定する方法を説明する。レーザー捕捉マイクロディスセクション(LCM)とマイクロ流体逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)を組み合わせたものです。また、この微流量RT-qPCRプラットフォームを使用して、腸内含量の微生物の存在量を測定します。

概要

単一細胞の遺伝子発現プロファイルを測定すると、組織内で広範な表現型ヘテロジニティが実証されています。この複雑さは、組織機能を支配する生物学的ネットワークの理解を複雑にしています。私たちのグループと他の人々は、多くの組織や条件^{1、2、3、4、5、6}でこの現象^を探求してきました。これらの実験は、遺伝子発現ネットワークの調節がそのような不均一性の根源であることを示唆するだけでなく、単細胞分解能が組織レベルの分解能が理解できない組織機能の複雑さを明らかにすることを示唆している。実際、少数の細胞が特定の状態や課題に反応するかもしれませんが、それらの細胞が全体的な生理学に与える影響は大きいかもしれません。さらに、多変量法を複数の細胞タイプおよび組織からの高次元データセットに適用するシステム生物学アプローチは、システム全体の治療効果を解明することができる。

LCMとマイクロ流体RT-qPCRを組み合わせて、そのようなデータセットを取得します。ここでは、蛍光活性化細胞選別(FACS)を介して単一細胞を収集し、RNAシーケンシング(RNA-seq)を使用してトランスクリプトームを測定する方法とは対照的に、このアプローチを取ります。FACSに対するLCMの利点は、単一細胞の正確な解剖特異性をLCMで比較的絶対的に文書化できることです。また、RNA-seqはRT-qPCRというより多くの特徴を測定できるが、マイクロ流体RT-qPCRは安価であり、感度と特異性^{が高い7。}

本代表的な実験では、扁桃体の中心核におけるラット神経、ミクログリア、およびアストロサイト遺伝子発現に対するオピオイド依存性およびナルトレキソン沈殿したオピオイド離脱の影響を調^べた。4つの治療群を分析した:1)プラセボ、2)モルヒネ、3)ナルトレキソン、および4)離脱(図1)。我々は、オピオイド依存性が遺伝子発現を実質的に変化させなかったが、オピオイド離脱が炎症性遺伝子、特にTnfの発現を誘発することを発見した。アストロサイトは最も影響を受けた細胞型であった。腸内微生物叢は、腸内ジスビオシス^8,9の確立されたマーカーであるバクテロイデス比に対するフィルミキュートの減少によって示されるように、オピオイド離脱によって深く影響を受^けた。

プロトコル

この研究は、トーマス・ジェファーソン大学とドレクセル大学医学部の動物ケアと使用委員会(IACUC)の勧告に従って行われました。このプロトコルは、トーマス・ジェファーソン大学とドレクセル大学医学部IACUCによって承認されました。

1. 動物モデル

1. 成人オスのスプレイグ・ドーリーラットに2つの75mgの徐放性モルヒネ硫酸ペレットまたは2つのプラセボペレットを皮下に挿入する。
   1. 軽い無菌手術のために適切にガウンと手袋を使用してください。必要に応じて、ラットのドーサムをバリカンで剃ります。
   2. 動物の目に獣医の軟膏を適用します。イオブルラン吸入でラットを約20s吸入して麻酔をする。麻酔は意識喪失によって確認される。
   3. ビーズ滅菌鈍いはさみでラットドーサムに中線切開を行い、ビーズ滅菌プローブで真皮を体壁から分離します。真皮の下にペレットをビーズ滅菌鉗子で挿入します。切開を無菌針で閉じた縫合部。
      注:全体の手順は、ラットあたり約5分かかります。新鮮な滅菌手袋は、各ラットに使用されます。
   4. ラットを隔離ケージに入れて術後回復を行います。心拍と規則的な呼吸リズムを確認してください。意識が回復するまで、ラットを観察します。術後の痛みを評価する。
   5. ラットを評価 8 h 術後と回復および感染の後 12 時間ごとに.ラットは手術から完全に回復したら、コホートの残りの部分とケージに入れます, 約 24 時間手術後.
2. 6日間のモルヒネ暴露の後、Gおよび離脱コホートに腹腔内ナルトレキソン注射(75mg/kg)を与える。
   注: この代表的な実験には、4 つのラット コホートがありました (図 1を参照)。

2. サンプル採取

1. 脳を収穫 6 日後ペレット挿入または 24 ナルトレキソン注射後 24 時間.
   1. 動きの欠如と呼吸数の低下によって示される約30秒間、または意識の喪失が起こるまで、イオフルランチャンバーに動物を置く。
   2. 急激なギロチンを使用して、動物の首を切り落とします。
   3. 動物の頭蓋骨から脳を解剖する。
   4. 鋭いハンドヘルドカミソリを使用して、取り除かれた脳に次の総切開を行います:まず、小脳をスライスして捨てます。第二に、脳幹を脳を脳の前脳から横断切開で分離する。第三に、中線矢状切開で前脳および/または脳幹を半球化する。
   5. 前脳と脳幹を、金型の底部に3〜4 cmの最適な切断温度化合物(OCT)を含むプラスチック組織埋め込み型に入れます。サンプルの残りの部分を OCT でカバーします。
   6. すぐに、OCTで覆われたサンプルとプラスチック組織埋め込み型をドライアイスとメタノールを含む浴に入れます。メタノールを組織埋め込み型にこぼれさせないでください。組織の採取が終了するまで、メタノールアイス浴中に脳サンプルと埋め込み型を保持します(最大10〜15分)。
   7. 脳サンプルを-80°Cの冷凍庫にできるだけ早く入れる。
2. 腸のサンプルを同時に収穫する。
   1. 急速な切断の後、メスで動物の腹部に正中線の切開を行います。
   2. cecumを見つけて、上向きの結腸への接続を切断します。
   3. 15 mL円錐形チューブにセカール内容物を絞ります。
   4. 直ちに円錐形チューブをドライアイスの上に置き、できるだけ早く-80°Cの冷凍庫に入れます。
      注:小腸の内容物は、陰性コントロールと同じ方法を使用して収集することもできます。

3. スライス

1. 凍結スタットを使用して、片分のラットの前脳をスライスします。
   1. -80°C冷凍庫から前脳を備えたプラスチック埋め込み型を取り除き、-20°Cのクライオスタットに入れます。
   2. 埋め込み型から、OCT埋め込まれたヘミセクトされた前脳サンプルを取り除きます。必要に応じて、プラスチック埋め込み金型の角を縦にスライスするためにカミソリを使用します。10月を使用してクライオスタットチャックに尾動脈の前脳を取り付けます。
      注:CeAを識別するための解剖学的ランドマークは、視管とストリア端子部を含む(図2B)。視管は視性気膜から分岐し、脳が尾部を尾にスライスすると、後頭横を追跡する。光学路がラットの脳アトラスブレグマ-2.12 mm¹⁰に見られるものと同様の形態を有する場合、テストスライスは顕微鏡で見ることができる。視管およびストリア末端の形態は、ラット脳アトラス¹⁰で確認して、ブレグマを同定し、CeAがストリア末端を取り囲むかどうかを確認することができる。
   3. CeAを含むセクションに達するまで、ヘミセックされた前脳のロストラルから尾大に10μmの厚いコロナルセクションをスライスします。
      メモ:セクションの幅と高さは約200mmです。
   4. 10 μmセクションを平滑ガラススライドに解凍して、CeAまたは好ましい脳領域を含む10 μmのセクションを収集します。すぐにドライアイスの上に置いた金属鍋の上にガラススライドを置きます。脳の切片を含むスライドを-80 °Cの冷凍庫にできるだけ早く入れます。
      注:同じスライドに複数のスライスを配置できます。同じスライド上のスライスに異なる細胞型染色を使用する場合は、スライス間に約100mm放置して、疎水性ペンを使用してスライド上の細胞型特異的抗体溶液を分離できるようにします。スライドの端から約20mm離します。

4. 免疫蛍光染色

1. 免疫蛍光を用いて、選択した脳細胞(例えば、ニューロン、ミクログリア、アストロサイトなど)の前脳切片を染色する。
   1. -80 °C冷凍庫からCeAの10μmセクションのスライドを1つ以上取り外します。
   2. スライドを30sの75%エタノールで固定します。
   3. 1xリン酸緩衝液生理食塩(PBS)で2%ウシ血清抗原(BSA)で30sのスライスをブロックします。PBSで1倍洗います。
   4. 2分間のスライドに一次抗体溶液を追加し、2%BSA溶液で1xを洗浄します。
      注:一次抗体溶液は、上記のブロッキングステップに対して2%の一次抗体、1%RNase Out、および同じBSA PBS溶液の96%で構成されています(ステップ4.1.3)。代表的な実験では、抗NeuN抗体、抗Cd11β抗体、抗GFAP抗体を次の量で使用しました:3 μLの一次体原、1.88 μLのRNA阻害剤、および145.12 μLのBSA溶液を使用しました。
   5. 2次抗体溶液をスライドに3分間追加し、PBSで1xを洗浄します。
      注:二次抗体溶液は、1 μLのヤギ抗マウス 488 nm蛍光タグ(1:500)、2.5 μLのRNA阻害剤、1.3 μLのDAPI(1:10,000)、2%BSAの196.5 μLから構成されています。

5.エタノールおよびキシレン脱水シリーズ

1. スライドを30秒間75%エタノールに浸し、その直後に95%エタノールに30秒浸し、その直後にスライドを30秒間100%エタノールに浸し、30秒間100%エタノールを含む第2の容器にスライドを浸す。
2. エタノール脱水シリーズに続いて、スライドを1分間注ぎたばかりのキシレンに浸し、スライドを2番目の容器に4分間浸します。
3. キシレンバスからスライドを取り出し、暗闇の中で空気を5分間乾燥させます。
4. さらに乾燥するために5分間乾燥剤にスライドを置きます。

6. レーザーキャプチャマイクロディシブ

1. 染色した場合は、顕微鏡にスライドを入れ、解剖学的ランドマーク(すなわち、視性チアズムおよびストリア末端)を使用して関心領域(CeA)を見つける。
2. 蛍光を使用して、対象領域の染色された細胞の種類とその核を特定します。単一セルのプールされたサンプルを実行する場合は、1 つまたは複数のセルを選択します。LCM ソフトウェアを使用して、対象のセルをマークします。
3. LCM キャップを対象領域のスライスの上に置きます。
4. 赤外線 (IR) レーザーのテスト ショットを使用して、選択した単一セルの領域上でのみ LCM キャップ接着剤が溶けないように、IR レーザーの強度、サイズ、および持続時間を調整します。これにより、選択したセル以外のセルが収集されません。
   注:この代表的な実験では、同じ細胞タイプの10個の細胞プールを単一のサンプルとして使用し、同じ治療を行うサンプル間の遺伝子発現における細胞間の変動を制限しました。しかし、この方法は、真の単一細胞実験^1,3に使用することができる。
5. LCMソフトウェアツールを使用して、分析のために収集する個々のセルを選択します(図2C)。選択された細胞は、ラット脳アトラスとブレグマ¹⁰に基づいて、CeA(または選択した脳領域)の解剖学的領域内になければなりません。細胞は、隣接する染色された核から少なくとも3μmであるべきである。
6. IRレーザーを発射して、同定された単一細胞を収集します。
7. キャップを品質管理(QC)ステーションに配置し、目的のセルのみが選択されていることを確認するためにそれを表示します。他の細胞が誤って選択された場合、キャップがQCステーションに残っている間、紫外線レーザーを使用して不要な細胞を破壊することができます。
8. 細胞が採取された組織セクションの写真を撮り、解剖学的特異性を文書化する。ラット脳アトラスを基準¹⁰として使用して適切であればブレグマからのスライスの距離を記録する。
9. LCMキャップをQCステーションから取り外し、サンプル抽出装置と5.5μLのリシスバッファーをサンプルに取り付けます。
   注:溶解バッファーソリューションは、0.5 μL の溶解エンハンサーと 5 μL のリサスペンション バッファーから構成されています。
10. ExtracSureデバイスを0.5 mLマイクロ遠心分離チューブに取り付け、ホットプレートの上に75°Cで15分間置きます。
11. サンプルとリシスバッファーを低速(0.01-0.02 x g)で30 s回転させ、収集したサンプルを-80°Cの冷凍庫に入れます。

7. 単細胞マイクロ流体RT-qPCR

1. 96.96ダイナミックアレイチップ用シングルセルmRNAの事前増幅
   1. 事前および逆のmRNA qPCR遺伝子プライマーを組み合わせて、プリアンプ(プライマー濃度500nM)を事前に測定するためにプライマープールでアッセイされるすべての遺伝子について、例えば、100 μM プライマーの 1 μL を 80 μL に加えて、120 μL の DNA 懸濁液バッファーを使用します。
      注:代表的な実験に使用されるプライマーシーケンスは、O'Sullivanら 4.^{にあります。}
   2. 新しい96 x 96 PCRプレートで、1 μLの5x VILOを各ウェルに追加します。
   3. -80 °Cで保存されたサンプルからLCM単細胞サンプルを取り除き、短い間に、遠心分離機を低速(0.01-0.02 x g)で短時間に解凍し、5.5 μLの単細胞サンプルをPCRプレートに加えます。各サンプルは、独自のウェルに追加されます。
   4. サンプルとVILOを入れ、熱を65°Cで1.5分間加熱し、1,300 x gで1分間回転させ、プレートを氷の上に置きます。
   5. 10x cDNA合成マスターミックスの0.15 μL、0.12 μL T4遺伝子32タンパク質、および0.73 μLのDNA懸濁液バッファーを各ウェルに追加します。
   6. PCRプレートをサーモサイクルに入れ、25°Cで5分間、50°Cで30分間、55°Cで25分間、60°Cで5分、70°Cで10分間、4°Cで終了します。
   7. 各ウェルにTaqポリメラーゼマスターミックス7.5 μLを加えます。
   8. 各ウェルにプライマープール(上記参照)の1.5 μLを追加します。
   9. PCRプレートをサーモサイクラーに入れ、次のプリアンプ化プロトコルを実行します:95°C 10分間、96°Cの22サイクルを5秒間、60°Cで4分間実行します。
   10. エキソヌクレアーゼI反応バッファー10x、1.2 μLエキソヌクレアーゼI、および4.2μLのDNA懸濁液バッファーを各ウェルに加えます。
   11. PCRプレートをサーモサイクラーに入れ、30分間37°C、80°Cで15分間、プロトコルを実行します。
   12. 各ウェルに54 μLのTEバッファを追加します。PCR プレートを 5 分で 1,300 x gで回転させます。次のステップのために12時間以上待っている場合は-20°Cで保管してください。
2. 96.96ダイナミックアレイチップ用サンプルプレートを用意します。
   1. 新しい96ウェルPCRプレートで、20x DNA結合色素の0.45 μLと低ROXマスターミックスの4.55 μLを各ウェルに追加します。
   2. 各ウェルに3μLのプリアンプサンプルを加え、PCRプレートを1,300 x gで回転させ、プレートを氷の上に置きます。
3. 96.96ダイナミックアレイチップ用のアッセイプレートを準備します。
   1. 新しい96ウェルPCRプレートに、2x GEアッセイローディング試薬3.75 μLと1.25μLのDNA懸濁液バッファーを各ウェルに加えます。
   2. 対応する各ウェルに2.5 μLの10 μM qPCRプライマーを加えます。PCRプレートを1,300 x gで5分間回転させます。
4. 96.96ダイナミックアレイチップをロードして実行します。
   1. チップに制御線の流体を盛り付けろ。
   2. IFCコントローラHXにチップを配置し、プライム(136X)スクリプトを実行します。
   3. PCR サンプルプレートからサンプルの 6 μL を 96.96 ダイナミックアレイチップの対応するサンプルウェルに追加します。
   4. PCRアッセイプレートからサンプルの6 μLを96.96ダイナミックアレイチップの対応するアッセイウェルに追加します。
   5. 96.96ダイナミックアレイチップの井戸に気泡をポップするために針を使用してください。
   6. 96.96 ダイナミック・アレイ・チップを IFC コントローラー HX に配置し、ロード・ミックス (136x) スクリプトを実行します。
   7. IFCコントローラHXからチップを取り外し、保護ステッカーを剥がし、96.96ダイナミックアレイチップをマイクロ流体RT-qPCRプラットフォームに配置します。GE Fast 96 x 96 PCR プロトコル(30 サイクル)を実行します。
      注: RNA の品質と結果の有効性は、ゲル電気泳動によるアッセイ検証、溶融温度曲線、サンプルおよびアッセイ複製、および標準的な希釈系列プロットを含む、複数の方法で評価されます。さらに、転写結果は、ウェスタンブロットおよび免疫蛍光アッセイを含む脳の固血切りに関する独立した方法によって検証することができる。

8. マイクロ流体RT-qPCRによる細菌量の測定

1. スツールDNA抽出キットの指示に従って細菌DNAを抽出します。
2. qPCRを用いて細菌DNA濃度を推定する。
3. 抽出した細菌DNAを新しいPCRプレートに追加します。抽出した細菌DNA 1 μL と 9 μL の DNA 懸濁液を加えます。
4. 48.48ダイナミックアレイチップ用のアッセイプレートを準備します(ステップ7.2.1~7.2.2を参照)
5. 48.48ダイナミックアレイチップ用サンプルプレートを準備します(ステップ7.3.1~7.3.2を参照)
   1. 新しい96ウェルPCRプレートで、20x DNA結合色素の0.45 μLと4.55 μLの低ROXマスターミックスを48ウェルに加えます。
   2. 細菌DNAを含むPCRプレートからサンプルの3μLを48ウェルに加え、PCRプレートを1,300 x gで5分間回転させます。
6. 48.48 ダイナミックアレイチップをロードして実行します(ステップ7.4.1~7.4.7を参照)。

結果

単一細胞の選択は、視覚的および分子的に検証された。視覚的には、細胞形態は細胞コレクションの前に見られた。次にQCステーションで採取した細胞を見て、細胞核染色(DAPI)を単一細胞選択マーカー蛍光と重なった。図2Aは、CeAを含むヘミセックラット前脳を有するスライドの代表的な画像を示す。その後の画像(図2B-D)は、単一細胞の選択と、転写分析のための組織からの除去を示す。分子的に、細胞型特異的マーカーは、その細胞型における発現の増加を示した(図1C)。ニューロン、ミクログリア、アストロサイトを調べ、それぞれNeuN、Maf、Gfapの発現を測定しました。 その数字はもともとオサリバンら⁴社に掲載さ...

ディスカッション

単細胞生物学は、細胞の発現型の不均一性と組織機能の堅牢性を実証した。これらの知見は、マクロおよびマイクロスケールの両方で生物学的システムの組織に関する洞察を提供してきた。ここでは、LCMとマイクロ流体qPCRの2つの方法の組み合わせを説明し、比較的低コストで解剖特異性および転写精度を提供する単細胞転写法を得る(図1)。私たちのグループは、システム生物学のアプローチを取り、多くの場合、同じ動物の複数の組織を測定します。これらの方法は、転写レベルでの様々な課題に対する生物学的システムの対応方法を決定する上で、柔軟かつ実りあるものであると考えています。また、これらの方法は、ベースライン条件における細胞型の解剖学的マッピングに用いられます。

私たちは、CeAがオピオイド依存と離脱に対してどのように反応するかを探る最近の出版物からのデータと修正された数字を提供します⁴.この例では、同じマイクロ流体qPCRプラットフォームを使用して、腸内微生物叢の相対的な存在量を測定しました。方法とワー...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
20X DNA結合染料	Fluidigm	100-7609	NA
2x GE Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000802-R	NA
48.48 遺伝子発現用ダイナミックアレイIFC	Fluidigm	BMK-M-48.48	NA
96.96 遺伝子発現用ダイナミックアレイIFC	Fluidigm	BMK-M-96.96	NA
Anti-Cd11β抗体	Genway Biotech	CCEC48	ミクログリア染色
抗NeuN 抗体、クローン A60	EMD ミリポア	MAB377	ニューロン染色
ArcturusXT レーザーキャプチャ マイクロダイセクションシステム	Arcturus	NA
NA Biomark HD	Fluidigm	NA	RT-qPCR platform
ウシ血清抗原	Sigma-Aldrich	B4287
CapSure Macro LCM Caps	ThermoFisher Scientific	LCM0211	NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit	ThermoFisher Scientific	11753500	Lysis Buffer solution
components DAPI	ThermoFisher Scientific	62248	Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer	TEKnova	T0221
Exonuclease I	New Englnad BioLabs, Inc.	M0293S	NA
ExtracSure サンプル抽出装置	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	LCM0208	NA
フィッシャーブランド スーパーフロストプラス 顕微鏡スライド	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	22-037-246	プレーンガラススライド
GeneAmp 薄肉反応チューブ	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	N8010611
GFAP モノクローナル抗体	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	A-21294	アストロサイト染色
ヤギ抗マウス IgG (H+L)、スーパークローナル&トレード;リコンビナント二次抗体、Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A28175	Seconadry 抗体
IFC Controller	Fluidigm	NA
NA RNaseOut	ThermoFisher Scientific	10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox	Bio-Rad	PN 172-5211	Rox Master mix
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	ThermoFisherScientific	Labs	、VILOとSuperScript
T4 Gene 32	科学11754250 New Englnad BioLabs, Inc.	M0300S	NA
TaqMan PreAmp Master Mix	ThermoFisher Scientific	4391128	NA
TE Buffer	TEKnova	T0225	NA