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方法論記事

後部皮下ポリビニルアルコールスポンジの移植と切除テール皮膚創傷モデルを用いた急性創傷治癒の評価

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DOI：

10.3791/60653

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2020年3月25日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology & Immunology, Brown University, 2Division of Surgical Research, Department of Surgery, Rhode Island Hospital and The Warren Alpert School of Medicine of Brown University

この記事について

サマリー

ここでは、2つのマウス創傷治癒モデルが記載されており、1つは細胞およびサイトカイン創傷治癒応答を評価するように設計され、もう1つは創傷閉鎖率を定量化するように設計されている。これらの方法は、糖尿病などの複雑な疾患モデルと共に使用して、創傷治癒不良の様々な側面のメカニズムを決定することができる。

要約

創傷治癒は、炎症、造粒組織形成、線維症、および分解能の整然とした進行を必要とする複雑なプロセスである。マウスモデルは、これらのプロセスに貴重な機械分析を提供します;しかし、創傷治癒応答のすべての側面に完全に対処する単一のモデルはありません。代わりに、創傷治癒のさまざまな側面に対処するために複数のモデルを使用することが理想的です。ここでは、創傷治癒応答の多様な側面に対処する2つの異なる方法について説明する。最初のモデルでは、ポリビニルアルコールスポンジはマウスのドーサムに沿って皮下に埋め込まれます。スポンジの取り出し後、細胞は機械的破壊によって単離され、液体は遠心分離によって抽出され、急性創傷環境における細胞およびサイトカイン応答の詳細な特徴付けが可能になる。このモデルの制限は、創傷閉鎖率を評価できないことです。このためには、テールスキン切除モデルが利用される。このモデルでは、尾の表面に沿って、尾の底部の近くに10 mm x 3 mmの長方形の尾の皮片が切除される。このモデルは、平面解析のために簡単に撮影して治癒率を決定し、組織学的分析のために切除することができます。両方の方法は、遺伝的に変化したマウス株、または、創傷治癒機構を解明するために、糖尿病、老化、または二次感染などの併存疾患のモデルと組み合わせて利用することができる。

概要

創傷治癒過程を調べるために利用できる多くのマウスモデルシステムがあり、それぞれが特定の利点と限界11、22を有する。以下の方法は、2つのマウス創傷モデルを提示し、それぞれが創傷治癒応答の特定の側面に対処し、傷害に対する応答における摂動の原因および影響を特定するために使用することができる。創傷治癒のプロセスは、明確な段階で起こる。第1段階は、血小板、好中球、および単球/マクロファージの急速な流入、ならびに炎症性サイトカインおよびケモカインの産生を特徴とする炎症性である。炎症の解決に続いて、環境は、前線維および前血管新生サイトカインおよび成長因子の誘導により、より修復的な状態に移行する。顆粒組織は、堆積し、新血管は、筋線維芽細胞、線維芽細胞、上皮細胞、および内皮細胞の移動と形成される。最終段階では、細胞外マトリックスが再モデル化され、瘢痕形成と創傷閉鎖が進行する2,,3,,4,,5,6,7,8.5

単一のマウスモデルは、創傷治癒2のすべての段階を研究するシステムを提供しない。ここでは、2つの外科的創傷モデルが記載されている:1つは急性細胞およびサイトカイン創傷治癒応答を解明し、もう1つは創傷閉鎖および組織学的分析の評価を可能にする。これら2つの方法は、創傷治癒応答の異なる側面に対する摂動または併存の影響を評価するために相補的な方法で採用され得る。ポリビニルアルコール(PVA)スポンジの皮下注入は、細胞および造粒組織応答の多くの側面を解明するために何十年もげっ歯類モデルで使用されてきたシステムである9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 、21,22,23,24.このアプローチはサイトカインが豊富な創傷液および細胞浸潤物の検索を可能にする。このモデルでは、PVAスポンジの1 cm x 1 cm x 0.5 cmの部分は後後の後方の正中線で作られた2cmの切開を通して皮下のポケットに置かれる。切開は外科用クリップで閉じられ、スポンジは細胞および液体の分離のための後の時点で取り出すことができる。分離されたスポンジの細胞およびサイトカインミリューは、着床後約14日までの急性創傷治癒の正常な段階を反映する。後の時点で、このモデルは造粒組織形成および異物応答1を研究する上でより有利である。このシステムを用いて、>106細胞を6 単離することが可能であり、これは表現型および機能的アッセイおよびRNA単離に対して明確な利点を提供し、他の生検ベースの方法11、22、23、25、2622,23から細胞を単離する上で。,25,26

創傷閉鎖率は、尾部皮膚切除モデルを用いて決定される。このモデルでは、最初にFalangaらによって記述され、他の人によって報告されたように27、28、29、30、,29,30尾の皮膚の1cm x 0.3 cmの完全な厚さのセクションは尾の基部の近くで除去される。27,創傷領域は容易に視覚化され、時間の経過とともに測定することができる。あるいは、尾部組織は組織学的解析のために単離され得る。このアプローチは、十分に確立された後部パンチ生検法に代わるものとして、または組み合わせて使用することができる。これら2つのモデルの主な違いは、創傷閉鎖率、毛皮の有無、および皮膚構造22、31、3231,32である。尾の皮膚の傷は、完全閉鎖が起こるのに約21日かかるため、創傷閉鎖を評価するためのより長い時間枠を提供する。これは、主にパンニクルカルノサスの作用による収縮によって、はるかに速く治癒する非スプラネートの後側パンチ生検に反対している。副生部の裏切りパンチ生検はよりゆっくりと治癒し、収縮治癒の影響を減少させるが、収縮ベースの,メカニズム1、2、27、30、31、332,27を制限するために異物の存在に依存する。,3330,311

記載された創傷モデルは摂動の不在の正常な創傷治癒過程を理解するための有益である。げっ歯類の皮膚の治癒は、緩い構造、収縮治癒への依存、およびその他の解剖学的な違いを含む人間の皮膚とは非常に重要な点で異なりますが、マウスシステムは、機械学的およびスクリーニング研究のための特定の利点を提供します。これらの中で最も重要なのは、近血種株および遺伝子変異体の入手可能性、遺伝的な難解性、および低コストである。マウス研究から得られた機械学的洞察は、ブタシステム22,3131のような人間の皮膚治癒をより密接に模倣する複雑な動物モデルに翻訳することができる。

定常状態における創傷治癒応答を調べることに加えて、これらのモデルは、細胞、サイトカインおよび総組織レベルにおける創傷治癒欠陥の基礎を理解するために、併存疾患と組み合わせることができる。この特定の設定では、2つのモデルを協調して使用して、術後肺炎などの特定の併存疾患の影響を評価し、急性細胞創傷治癒応答および創傷閉鎖率30の両方に及ぼす影響を評価することができる。

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プロトコル

ここで説明するすべての動物研究は、ブラウン大学の施設動物のケアと使用委員会によって承認され、国立衛生研究所の動物のケアと使用のためのガイドに従って行われました. 注:ビデオでは、手術ドレープはデモンストレーションのために省略されています。

PVAスポンジの皮下移植

  1. 8 mm x 8 mm x 4 mm の部分に PVA スポンジのシートをカットするはさみを使用します。PVAスポンジの破片をビーカーに無菌1x PBSに浸して水分補給します。
  2. スポンジを1x PBSでオートクレーブして滅菌し、完全に冷却します。4 °Cで無菌1x PBSでオートクレーブスポンジを保管してください。
  3. 外科的移植を行う前に、薄層流れフードで滅菌条件下で滅菌培養皿に必要な数のスポンジをアリコートする。余分なスポンジを滅菌1x PBSで4°Cで保管し、将来の使用のために保管してください。水分補給後、スポンジが1cm x 1cm x 0.5 cmに膨潤するようにしてください。脱水PVAスポンジの画像を図1Aに示します。
    注意:手術部位の無菌性を維持するために、PVAスポンジ注入手順は、マウスを処理し、手術部位を準備するために1人の個人と、移植を行うために2人目の人を必要とします。
  4. 80 mg/kg ケタミンの腹腔内注射により、8-12週齢の雄C57BL/6Jマウスを麻酔します。鎮痛のために腹腔内40mg/kgのキシラジンを投与する。 ペダル反射の喪失により麻酔の深さを確認します。バリカンでドーサムに沿って髪を取り除くことによって外科部位を準備する。滅菌ガーゼを使用し、2xの剃り領域にポビドネ-ヨウ素溶液を塗布し、続いて70%エタノールを加える。
  5. 無菌の外科用ドレープにマウスを置きます。加温パッドを外科用ドレープの下に置き、マウスのコア温度を維持します。
  6. 手術を行う場合は、無菌の外科用手袋を着用してください。下皮を鉗子で下地の組織から引き離し、生殖不能の外科用はさみを使用して、尾部の基部に約2cm前部の後回し中線に沿って2cmの切開を行う。無菌鉗子で切開を開いたままにしながら、無菌湾曲した鈍い先端の外科用はさみを使用して、図1Bに示された位置の1つにドーサムに沿って皮下ポケットを形成する。
  7. 引き続き鉗子を使用して、皮膚を下層部の組織から離します。滅菌手術用ハサミを使用して、余分なPBSを除去するために培養皿の中の1つのPVAスポンジを静かに絞ります。無菌手術用ハサミを使用して1コーナーでPVAスポンジを拾い、ハサミで保持されたコーナーでリードし、ステップ1.4で形成された皮下ポケットにスポンジを入れます。
  8. 図1Bに示すように、このプロセスを5倍繰り返し、合計6個のスポンジを皮下ポケットに入れる。
  9. 切開後の皮膚を無菌鉗子と一緒につまみ、2つのステンレススチール製の創傷クリップで切開を閉じます。
  10. 各マウスに新しい無菌手術器具を使用してください。あるいは、ビード滅菌器を使用して、マウス間の器具を殺菌する。

2. PVAスポンジからの流体の分離

  1. 急性創傷サイトカインミリューを評価するために、移植後1〜14日の間にスポンジを分離する。
  2. 5 mL シリンジのバレルを 16 mL 培養チューブに入れ子にして、流体採取チューブを準備します。
  3. CO2窒息に続いて子宮頸部脱臼によって埋め2 込まれたPVAスポンジでマウスを安楽死させる。
  4. 手術用ステープルを取り除き、歯付き鉗子で切開を開きます。はさみを使用して、後部中線に沿って切開を延長します。
  5. 鉗子を使用して、皮下ポケットからスポンジを1つ抽出し、準備されたシリンジバレルに移し、スポンジへの圧力を最小限に抑えるように注意してください。スポンジの表面に付着したままの結合組織を関連付け解除します。必要に応じて、周囲の組織からスポンジを解剖するためにはさみを使用してください。残りのスポンジでスポンジの除去処理を繰り返します。スポンジを含むチューブを氷の上に置きます。
  6. 創傷液を分離するために、5 mLシリンジを含む培養管をスポンジで700xgで10分間 g 遠心分離する。
  7. 遠心分離後、注射器とスポンジを捨てます。創傷液は16mL培養管に集められたであろう。7日目の創傷から採取された流体の代表的な画像を図1Dに示します。創傷液をクリーンチューブに移し、-80°Cで長期保存します。

3. PVAスポンジからの細胞の分離

  1. 急性創傷治癒細胞ミリューを評価するには、スポンジ移植後1〜14日の間にスポンジを収集します。移植後7日後に創傷から得られたスポンジを図1Eに示す。
  2. 1x HBSS(+カルシウム/+マグネシウム/フェノールレッド)を含む回収培地を1%FBS、1%HEPES、および1%ペニシリンストレプトマイシンで補います。
  3. 15 mL円錐管にHBSSコレクション媒体のアリコート5 mL。
  4. 2.2~2.4に記載されているように、安楽死させたマウスからPVAスポンジを抽出します。5 mLのHBSS採取媒体を含む円錐管にスポンジを入れる。
  5. スポンジとHBSS回収媒体を注ぎ込んで80mLブレンダーバッグに移します。パドルブレンダーのハッチからブレンダーバッグを掛け、パドルがスポンジとメディアに当たるように配置します。パドルブレンダーの設定を調整して、60 sで高く走ります。
  6. ブレンダーバッグからピペットで15 mL円錐形チューブにメディアを移し、スポンジを袋に残します。スポンジを絞ってメディアを徹底的に解放します。パドルブレンダーの設定を調整して、高い30 sで実行します。ブレンダーバッグに5mLのメディアを加え、合計3回のスポンジを打つ場合は2倍の胃袋を繰り返します。
  7. 円錐管を250 x gで5分間遠心します。遠心分離後、円錐管の下部に細胞と赤血球の赤いペレットが見えます。
  8. 上清を捨てて赤血球のリシスを行う:混合する細胞ペレットとピペットにdH2Oの900 μLを加える。100 μL の 10x PBS で中和します。1x PBSの4 mLをチューブに加えて、溶菌を完全に中和し、250 x gで遠心分離機を5分間加えます。
    注:リシスステップは簡潔にする必要があります。3~5s以上の細胞に水を当てはめて、非赤血球のリシスを引き起こし得る。
  9. 遠心分離後、赤血球を欠いた創傷細胞を含む白い細胞ペレットが円錐管の底に存在する。上清を捨てて、下流解析のために目的の媒体の細胞ペレットを再懸濁します。

PVAスポンジ創傷から分離された先天性白血球の任意フローサイトメトリー解析

  1. 10 μg/mL抗CD16/CD32 FcRγII/III抗体を1x PBS + 1% BSAで希釈したブロッキング抗体の2x溶液の25μLで0.5-1 x 106創傷細胞を再懸濁します。
    注: すべての抗体は、フローサイトメトリー分析に最適な濃度を決定するために滴定する必要があります。
  2. 氷上で10分間ブロッキング抗体を用いて細胞をインキュベートする。
  3. 2.5 mg/mLのPerCP-eFluor710-Ly6G、FITC-Ly6Cの5 mg/mL、APC-Fire750-CD45.2、APC-R700-シグレックF、および10mg/mLのeFluor660-F4-80を含む抗体の2倍のマスターミックスを作る+ 1BS%ブロック抗体中のインキュベートする細胞に、25 μLの抗体カクテルを直接加えます。
  4. 細胞を氷の上で20分間インキュベートし、光から保護します。
  5. 1x PBSで細胞2倍を洗浄します。
  6. 1x PBSで1:1,000希釈アミン反応性固定可能な生存率染料-eFluor506のマスターミックスを作ります。細胞ペレットを生存性染料溶液の50 μLで再懸濁します。
    注:血清は、色素と内因性タンパク質との結合を防ぐため、固定可能な生存率ステップから除外する必要があります。細胞を氷の上で20分間インキュベートし、光から保護します。
  7. 1x PBSで細胞2倍を洗浄します。1%パラホルムアルデヒドの50 μLで細胞ペレットを再懸濁します。
  8. 1%パラホルムアルデヒドを1%で、氷の上で15分間インキュベートし、光から保護します。
  9. 細胞1xを1x PBSで洗浄し、フローサイトメトリック分析のために1x PBSでペレットを再懸濁します。

5. テール皮膚切除

  1. 80 mg/kg のケタミンの腹腔内注射により、8-12 週齢の雄 C57BL/6J マウスを麻酔します。鎮痛のために腹腔内40mg/kgのキシラジンを投与する。ペダル反射の喪失により麻酔の深さを確認します。
  2. ステイルガーゼを使用してポビドンヨウ素溶液2xを適用し、続いて70%エタノールの1つのアプリケーションを使用して麻酔マウスの尾部に手術部位を準備する。
  3. テールの裏面に10mm x 3mmのセクションを定義し、尾部の底部から10mm(図1C)を、事前に作られたテンプレートからトレースする永久マーカーを使用して定義します。
  4. 無菌の外科用ドレープの上に麻酔マウスを置きます。
  5. 手術手順を実行するために無菌の外科用手袋を着用してください。無菌メスの刃で、創傷領域の右、底、および左端に沿って完全な厚さの切開を行います。
  6. 滅菌鉗子を使用して、切除された皮膚を尾から剥がし、生殖不能の外科用はさみを使用して創傷領域の上端を切り取る。
  7. 出血を止めるために滅菌ガーゼで圧力をかける。
  8. スプレーバリアフィルムを創傷床に塗布します。
  9. 一定の間隔で一定の距離から傷を撮影します。平面解析で写真を解析し、創傷面積の測定を決定します。あるいは、キャリパーを使用して、創傷の長さおよび幅の測定値を得る。

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結果

PVAスポンジ移植後の全身炎症反応
PVAスポンジ移植手術は、創傷の1日後に血漿中IL-6の誘導によって示されるように全身的な炎症反応を発生させた(図2A)。TNF-αおよびIL-1βを含む他の炎症性サイトカイン、ならびにCCL2およびCXCL1を含むケモカインの配列は、PVAスポンジ移植後の最初の7日間に全身に誘導され、他の26,30,30に記載されている。

PVAスポンジ創傷からの細胞および液体の分離
PVAスポンジ創傷モデルの主な利点は、急性細胞創傷治癒応答の表向きおよび機能的分析のための十分な細胞を回収する能力である。PVAスポンジ創傷から回収できる細胞の数は、創傷日1 x 106〜創傷7日目の6個のスポンジあたり約2 x106細胞から、時間の経過とともに...

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ディスカッション

この記事では、急性創傷治癒反応の評価を可能にする2つの難治性マウス創傷モデルについて説明する。最初の方法は、後部皮下空間におけるPVAスポンジの外科的移植を伴う。このアプローチは、単離されたスポンジから得られた多数の細胞および創傷液の量による細胞創傷治癒応答を研究するための生検ベースの創傷モデルに対して明確な利点を提供する。この処置を成功させるためには、切開の周りの皮膚を徹底的に洗浄することによって無菌の外科場を維持することが不可欠であり、傷口への細菌の転位は治癒の経過を著しく変える。ここで説明する細胞分離法を用いて、スポンジ抽出の時間に応じてPVAスポンジから少なくとも1〜10 x106個の細胞を単離することができる。PVAスポンジ創傷から分離された細胞の大部分は生存可能である(図2D)。しかし、死細胞が機械的破壊後に単離された創傷細胞の最大20%を構成することが可能であるため、フローサイトメトリーベースの分析を進める際には生存性染色剤を使用することを強くお勧めします。PVAスポンジ創傷から分離された細胞は、主にCD45陽性によって決定される造血起源であ...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者らは、ブラウン大学フローサイトメトリーとソーティング施設のケビン・カールソンに、フローサイトメトリー実験に関する協議と支援に感謝したいと考えています。図 1B と C のイメージは、BioRender を使用して作成されました。ケイラ・リーとグレゴリー・セルパは、彼らの写真の援助に感謝しています。この研究は、以下からの助成金によって支えられました:国防高等研究プロジェクト庁(DARPA)YFAA15 D15AP00100、新しい科学賞のディーンの領域(ブラウン大学)、国立心臓肺血液研究所(NHLBI)1R01HL126887-01A1、環境科学研究所(NIES)T32-ES7272(環境病理学の訓練)とブラウン大学研究シード賞

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10x リン酸緩衝生理食塩水Fisher ScientificBP3991
15 mL 遠心分離チューブ、OlympusGenesee28-103
1x HBSS (+カルシウム、+マグネシウム、–フェノールレッド)サーモフィッシャーサイエンティフィック14025076
5mlシリンジBD309646
抗マウスCD45.2-APC Fire750レジェンド109852クローン104
マウスF4 / 80-eFluor660モフィッシャーサイエンティフィック50-4801-82BM8
マウスLy6C-FITCBD Biosciences 553104クローンAL-21
抗マウス Ly6G-PerCP-eFluor710サーモフィッシャーサイエンティフィック46-9668-82クローン 1A8-Ly6g
抗マウス Siglec-F-APC-R700BD Biosciences565183クローン E50-2440
オートクリップ ステンレス鋼創傷クリップ アプライヤーブレインツリー サイエンティフィックNC9021392
オートクリップ ステンレス鋼創傷クリップ、9mmブレインツリー サイエンティフィックNC9334081
ブレンダーバッグ、80mLフィッシャーサイエンティフィックス14258201
培養チューブ、16mL、17x100ジェネシーサイエンティフィック21-130
ウシ胎児血清 - 標準サーモフィッシャーサイエンティフィック10437028
固定生存率色素 eFluor506サーモフィッシャーサイエンティフィック65-0866-14
ヘプス溶液、1Mジェネシーサイエンティフィック25-534
ImageJ SoftwareNIH
ペニシリン-ストレプトマイシン (5000 U/mL)ThermoFisher Scientific15070-063
ポリビニルアルコールスポンジ - 大孔径Ivalon/PVA Unlimitedwww.sponge-pva.com
ポビドンヨード溶液、10%Fisher Scientific3955-16
スプレーバリアフィルム、Cavilon3M3346E
ストマッカー 80 バイオマスター、110Vスワード0080/000/AJ
バイオ抗サークローン抗

参考文献

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