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方法論記事

SNSコバルト(II)の製造用肝アルコール脱水素酵素のピンサーモデル複合体

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DOI:

10.3791/60668

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2020年3月19日

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1Department of Chemistry and Biochemistry, Fairfield University, 2Department of Chemistry, Keene State College

この記事について

サマリー

SNSピンサーコバルト(II)モデル複合体の肝臓アルコール脱水素酵素の調製をここに紹介します。この複合体は、リガンド前駆体をCoCl2・6H2Oと2反応させることで調製でき、その後、ジエチルエーテルがコバルト錯体を含むアセトニトリル溶液にゆっくりと拡散させることによって再結晶することができる。

要約

化学モデル複合体は、酵素の活性部位を表すために調製される。このプロトコルでは、三重ピンサーリガンド前駆体(それぞれ2つの硫黄および1つの窒素ドナー原子機能(SNS)を有し、ビスイミダゾールまたはビストリアゾール化合物に基づく)のファミリーは、三次元SNSピンサーコバルト(II)複合体を与えるためにCoCl2·6H2Oで金属化される。肝アルコール脱水素酵素に対するコバルト(II)モデル複合体の調製は容易である。リガンド前駆体を含むアセ2トニトリル溶液にCoCl 2・6H2Oを添加した際の迅速な色変化に基づいて、複合体が急速に形成される。2金属錯体の形成は、溶液が一晩還流することを可能にした後に完了する。これらのコバルト(II)錯体は、肝臓アルコール脱水素酵素(LADH)における亜鉛活性部位のモデルとして機能する。この複合体は、単結晶X線回折、エレクトロスプレー質量分析、紫外線可視分光法、元素分析を用いて特徴付けられる。複合体の構造を正確に決定するには、その単結晶構造を決定する必要があります。X線回折に適した複合体の単結晶は、その後、ジエチルエーテルの遅い蒸気拡散を介して、コバルト(II)複合体を含むアセトニトリル溶液に成長させる。高品質の結晶の場合、再結晶は通常1週間以上、またはそれ以上に行われます。この方法は、他のモデルコーディネーション複合体の調製に適用することができ、学部の教育研究所で使用することができます。最後に、他の人がこの再結晶化方法を見つけて、研究に有益な単結晶を得ることができると考えられています。

概要

提示された方法の目的は、金属酵素の触媒活性をさらに理解するためにLADHの小分子類似体を調製することにある。LADHは、補因子結合ドメインと亜鉛(II)金属含有触媒ドメイン1を含む二量体酵素である。LADHは、共因子NADHの存在下で、それぞれのアルコール誘導体2にケトンおよびアルデヒドを低減することができる。NAD+の存在下+では、LADHはケトンおよびアルデヒド2に対するアルコールの酸化の逆触媒を行うことができる。LADHの活性部位の結晶構造は、その亜鉛(II)金属中心が1つの窒素原子に結合し、ヒスチジン側鎖と2つの硫黄原子によって提供され、2つのシステインリガンド3によって提供されることを示している。さらなる研究は、亜鉛金属センターが不安定な水分子と結紮され、金属中心4の周囲に擬似四面体幾何学をもたらすことを示している。

我々は以前に報告し、SNSピンサーリガンド前駆体を利用しただけでなく、ZnCl2を用いたリガンド2前駆体を金属化して、三重リガンド前駆体5、6、76,7を含むZn(II)複合体を形成した。5これらのリガンド前駆体を図1に示す。これらの亜鉛(II)錯体は、電子乏しいアルデヒドの量合論的還元の活性を示し、したがってLADHの錯体をモデル化している。その後、SNSリガンド前駆体を含む一連の銅(I)および銅(II)錯体の合成と特性評価が8,8,9,1010と報告されている。9

LADHは亜鉛(II)酵素ですが、LADHのコバルト(II)類似体に関するより分光的な情報を得るために、LADHのコバルト(II)モデル複合体を調製することに興味があります。コバルト(II)錯体は着色され、亜鉛(II)錯体はオフホワイトである。コバルト(II)錯体は着色されているため、コバルト(II)錯体中のリガンド場の強度に関する情報も集められる、という錯体の紫外線可視スペクトルが得られる。ガウス計算と実験的に得られた紫外線可視スペクトルからの情報を用いることで、リガンド場の強度に関する情報を推測することができる。コバルト(II)は、両方のイオンが類似したイオン半径と同様のルイス酸性度11、12を有するので、12亜鉛(II)の良い代替品です。

提示された方法は、LADH5,6の自然な触媒行動を模倣しようとするモデル複合体の合成と特性化を6含む。我々は以前、ZnCl2を用いたリガンド前駆体の2ファミリーを金属化して、LADHの亜鉛(II)モデル複合体を形成し、LADH4の亜鉛活性部位の構造と反応4性をモデル化した。複数の実験を通じて、これらのピンサーリガンドは、異なる環境条件下で堅牢であることが証明されており、結合されたR群の多様なコレクションで安定しています。5、6

トリデンテリガンドは、トリデンテリガンドの強いキレート効果により金属化がより成功することが分かっているので、単一性リガンドに比べて好ましい。この観察は、単一のリガン酸リガンド13と比較して、三次元ピンサーリガンド形成のより好ましいエントロピーによるものである。さらに、三重体ピンサーリガンドは、金属錯体の二量化を防止する可能性が高く、これは複素子14の触媒活性を遅らせる可能性があるため好ましい。従って、三種ピンサーリガンドを使用して触媒活性および強い複合体の調製において有機金属化学で成功が証明されている。ピンサー複合体は通常、2列目および第3列遷移金属15を含むため、SNSピンサー複合体は他のピンサーシステムよりも研究が少ない。

メタロ酵素に関するこの研究は、生物学の他の分野に適用することができる酵素活性の理解をさらに助けることができます。この方法は、代替方法(LADHのタンパク質全体を合成する)に比べてモデル複合体を合成する方法が、いくつかの理由で好ましい。第1の利点は、モデル複合体は分子質量が低く、天然酵素の活性部位の触媒活性および環境条件を正確に表すことができる点である。第 2 に、モデル複合体は、信頼性の高い、関連性のあるデータを扱い、生成する作業が簡単です。

本稿では、LADHの2つのコバルト(II)ピンサーモデル複合体の合成調製と特徴付けについて説明する。両方の複合体は、硫黄、窒素、および硫黄ドナー原子を含むピンサーリガンドを備えています。第1の複合体(4)はイミダゾール前駆体に基づいており、第2の(5)はトリアゾール前駆体に基づいている。この複合体は、水素供与体の存在下における電子貧アルデヒドの量イチオメトリー低減のための反応性を示す。これらの反応性の結果は、その後の原稿で報告されます。

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プロトコル

1. クロロの合成(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-イソプロピル-N'-メチレミダゾール-2-チオーネ)ピリジン]コバルト(II)テトラクロロコバルト酸[4]

  1. 複合体4を調製するには、0.121 g (3.12 x 10-4モル) 2,6-bis(N-イソプロピル-N'-メチレネイミダゾール-2-チオーネ)ピリジン(C19H25N5S2)を100 mL底フラスコに6〜15 mL加えます。次に、この溶液に、塩化コバルト(II)六水和物(CoCl2·6H2O)の0.0851g(3.58 x 10-4モル)を加える。-4 2反応液は、塩化コバルト(II)六水和物を添加した直後に、淡黄色からエメラルドグリーンに色を変える必要があります。
  2. フラスコにかき混ぜ棒を加えます。還流し、反応を20時間攪拌して完全な反応を確実にする。減圧下でロトバップを使用して溶媒を除去する。

2. クロロの再結晶化(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-イソプロピル-N'-メチレニミダゾール-2-チロン)ピリジン]コバルト(II)テトラクロロコバルト酸[4]遅い蒸気拡散による

  1. 溶質をアセトニトリル(7.5mL)に溶かし、溶液を濾過し、溶液を1ドラムバイアルに均等に入れます。各バイアルに1.5 mLのアセトニトリル溶液を充填します。
    1. バイアルをキャップする綿を追加し、蒸気拡散を遅くします。バイアルの上部の開口部に綿をぴったりとフィットさせます。
    2. 50 mLのジエチルエーテルを含む240 mLの瓶にバイアルを入れます。キャップで瓶を閉じます。
    3. 結晶が1週間の期間にわたって成長することを許可します。
      注意:再結晶は1日以上かかる場合があります。

3. クロロの合成(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-イソプロピル-N'-メチレントリアゾール-2-チオーネ)ピリジン]コバルト(II)テトラクロロコバルト酸 [5]

  1. 複合体5を調製するには、0.183 g(4.70 x10-4モル)の2,6-ビス(N-イソプロピル-N'-メチレントリアゾール-2-チオーネ)ピリジン(C17H23 N7S2)を100 mL底フラスコに6〜15mL加えます。6この溶液に、塩化コバルト六水和物(CoCl2·6H2O)の0.223g(9.37 x 10-4モル)を加える。-4 2反応液は、塩化コバルト(II)六水和物を添加した直後に、淡黄色からロイヤルブルーに色を変える必要があります。
    1. フラスコにかき混ぜ棒を加えます。還流し、反応を20時間攪拌して完全な反応を確実にする。減圧下でロトバップを使用して溶媒を除去する。

4. クロロの再結晶化-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-イソプロピル-N'-メチレントリアゾール-2-チオーネ)ピリジン]コバルト(II)テトラクロロコバルト酸[5]遅い蒸気拡散による

  1. 溶質をアセトニトリル(9.0 mL)に溶かし、溶液を濾過し、溶液を1ドラムバイアルに均等に入れます。各バイアルに1.5 mLのアセトニトリル溶液を充填します。
    1. バイアルをキャップする綿を追加し、蒸気拡散を遅くします。バイアルの上部の開口部に綿をぴったりとフィットさせます。
    2. 50 mLのジエチルエーテルを含む瓶にバイアルを入れます。キャップでバイアルを閉じます。
    3. 結晶が1週間の期間にわたって成長することを許可します。
      注意:再結晶は1日以上かかる場合があります。

5. X線結晶学

  1. ナイロンループに4の結晶を取り付ける。リガクオックスフォード回折回折回折計でデータを収集します。ここで、X線回折データは173(2) K. 直接法を用いて、Olex216およびShelXT17構造溶液プログラムを用いて結晶構造を解く。最小二乗法を使用して、ShelXL18の絞り込みパッケージで構造を洗練します。
  2. ナイロンループに5の結晶を取り付ける。リガクオックスフォード回折回折回折計でX線回折データを収集します。ここで、X線回折データは173(2) K. 直接法を用いて、Olex216およびShelXT17構造溶液プログラムを用いて結晶構造を解く。最小二乗法を使用して、ShelXL18の絞り込みパッケージで構造を洗練します。

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結果

合成
複合体4および5の合成は、コバルト(II)塩化六水和物とビスチオンリガン酸前駆体を含むアセトニトリル溶液を反応させることで成功した(図2)。この反応は空気の存在下で還流温度で起こった。一般に、錯体4および5は、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、およびメタノールに可溶性であることが観察された。コンプレックス4は緑色で、複合体5は青色であった。複合体4と5の収率は定量的であった。

X線結晶学
複合体4および5の単結晶は、遅い蒸気拡散法を介して得られ、そこで化合物をアセトニトリルに溶解させ、...

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ディスカッション

複合体4と5の調製は簡単です。重要なステップは、それぞれのリガンド前駆体を含むアセトニトリル溶液に固体CoCl2·6H2Oを追加することです。2この溶液は、CoCl 2 ·6H2Oを2添加して複合体4を形成してから数秒以内に濃い緑色に変わる。この溶液は、CoCl2·6H2Oを添加して複合体5を形成した後、明るい青色に変わります。完全な反応を確実にするために、溶液は一晩還流に置かれる。

複合体4および5の単結晶を成長させるためには、複合体4または5を含むアセトニトリル溶液を濃縮する必要がある。複合体をできるだけ濃縮した溶液を生成するために、アセトニトリルの最小量に溶解する必要があります。...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

ジョン・ミエチニコフスキは、このプロジェクトのために以下から資金援助を受けました:コネチカットNASA宇宙交付同盟(賞番号P-1168)、フェアフィールド大学科学研究所、芸術科学大学出版基金、フェアフィールド大学学部夏期研究の給付金, 国立科学財団主要な研究計装プログラム (助成番号CHE-1827854) 400 MHz NMR分光計を取得するための資金のため.彼はまた、エレクトロスプレー質量スペクトルの獲得に協力してくれたテレンス・ウー(イェール大学)に感謝します。ジェリー・ジャシンスキーは、X線回折計を購入するための資金について、国立科学財団の主要研究計装プログラム(グラント番号CHE-1039027)を認めています。シーラ・ボニータティバス、エミルズ・アルマンザ、ラミ・ハルブーチ、サマンサ・ジグモントは、夏の研究給付金を提供したハーディマン・スカラーズ・プログラムを認めています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100 mL丸底フラスコ化学ガラスCG150691100mLシングルネック丸底フラスコ、19/22アウタージョイント
アセトニトリルフィッシャーHB9823-4HPLCグレード
チラー、roto-vapラウダL000638アルファRA8
コバルトヘキサハイドレートクロスオーガニックAC423571000アクロスオーガニックジ
エチルエーテルフィッシャーE-138-1ジエチルエーテルアンヒドロス
メスシリンダーフィッシャーS6345625mLメスシリンダー
ホットプレートフィッシャー11-100-49SHアイソテンプベーシックスターリングホットプレート
ジャーフィッシャー05-719-481250mLジャーリ
ガンド----------以前にミエチニコフスキー教授によって合成
されましたコットンボールフィッシャー22-456-80ミディアムコットンボール
1ドラムバイアルフィッシャー03-339TFEライニングキャップ
ピペットッシャー13-678-20B5.75インチピペット
ピペット電球フィッシャー03-448-21ッシャーブランドラテックス電球
浴用ピペット再結晶皿ッシャー08-741 D325mL砂浴
用再結晶皿 還流コンデンサーChem GlassCG-1218-A-22コンデンサー 19/22 インナージョイント
RotovapHeidolph Collegiate36000090Brinkmann;ハイドルフWBエコバス付きロータリーエバポレーター ハイドルフロータリーエバポレーター
サンドバス用海砂アクロスオーガニックス612355000サンドバス用洗浄海砂
攪拌棒フィッシャー07-910-23卵型マグネティックスターバー
バカムグリースフィッシャー14-635-5Dダウコーニング 高真空グリース
ロトバップ用真空ポンプハイドルフ大学36302830ハイドルフ・ロトヴァックバルブコントロール
塩化アフィフィ砂フィ

参考文献

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