Method Article

ラベルフリーインピーダンスベースのGPCRアッセイにおけるスループット向上のためのステップワイズドージングプロトコル

DOI:

10.3791/60686

⸱

February 21st, 2020

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1Institute of Analytical Chemistry, Chemo- and Biosensors, University of Regensburg, 2Institute of Pharmacy, University of Regensburg, 3Department of Chemistry and Pharmacy, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nuernberg, 4Fraunhofer Research Institution for Microsystems and Solid State Technologies EMFT

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、ラベルフリーインピーダンス測定を用いて単一の微小電極上で成長した単一の細胞層からのアゴニスト誘発GPCR活性化に関するフル用量応答関係のリアルタイム記録を示す。新しいドージング方式は、時間分解能を損なうことなくスループットを大幅に向上させます。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞培養実験においてリガンド誘導GPCR活性化を非侵襲的に研究するために、ラベルフリーインピーダンスベースのアッセイがますます使用されています。このアプローチは、デバイス依存の時間分解能を数十ミリ秒に抑えるリアルタイムのセル監視を提供し、高度に自動化されています。しかし、サンプル数が高くなると(例えば、さまざまな異なるリガンドに対する用量応答試験)、使い捨て電極アレイのコストと、連続したウェルバイウェル記録に対する利用可能な時間分解能が制限されることがあります。従って、ここでは、ラベルフリーGPCRアッセイの出力を大幅に増加させる可能性のあるシリアルアゴニスト付加プロトコルを紹介します。連続アゴニスト添加プロトコルを使用して、GPCRアゴニストは、サンプルのインピーダンス(アゴニストモード)を連続的にモニタリングしながら、単一細胞層に濃度を増加させながら順次添加される。このシリアルアプローチにより、1つの単一細胞層からGPCRアゴニストの完全な用量応答曲線を確立することが可能になりました。連続アゴニスト付加プロトコルは、異なるGPCRカップリングタイプ、Gq Gi/0またはGsに適用可能であり、研究中の受容体の組換えおよび内因性発現レベルと互換性がある。GPCRアンタゴニストによる受容体遮断は、同様に評価可能である(アンタゴニストモード)。

Introduction

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このレポートは、標識のないインピーダンス測定による接着性成長細胞におけるリガンド誘導Gタンパク質共役受容体(GPCR)活性化の定量化のために開発された逐次付加プロトコルの詳細な説明を提示する。Gタンパク質共役受容体(GPRS)は、多数の生理機能およびヒト疾患1に関与している。これと細胞表面での良好なアクセス性のために、GPCRsは最も重要な薬物標的の1つです。この評価は、GPCRsを標的とする700の承認された薬物の推定数に反映され、すべての市販薬の約35%のシェアに相当する2。

新薬の開発は、(i)生物学的標的分子の同定と機能的特徴付け、および(ii)新しい鉛物質の発見および管理可能な薬物への開発という2つの中心的なプロセスからなる。どちらのプロセスにおいても、薬物標的相互作用とその後の生物学的下流応答を定量的に評価するためには効率的な方法が必要である。前臨床薬の開発プロセスの異なる段階は、薬物と標的の間の生体分子相互作用研究から、培養中の細胞の機能的研究、切除臓器物質または動物全体に関する実験に至るまで、さまざまな分析方法を利用しています。いずれも、前者から後者3まで生理学的意義と生物学的複雑さが増加する。動物実験を最小限に抑えることが全体的な目標ですが、実験動物や動物全体から隔離された器官を用いた薬理学的研究は、新薬候補を包括的....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 電極アレイ上のセルシード

注: 電極レイアウトの選択は、感度と調査中のセル数のトレードオフです。電極が小さいほど、感度が高いほど測定ですが、研究中のセルの数は小さくなります。ベースライン条件下で時間の経過に伴う強いインピーダンス変動を示す細胞の場合、より大きなまたは桁間電極が好ましい。

  1. 37 °Cの水浴で標準的な細胞の継ぎ子および播種に必要なすべての解決を前暖め。ヒトU-373 MG細胞を用いたアッセイ:カルシウムとマグネシウムなしのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、0.05%(w/v)トリプシン、細胞培養培地(イーグルの最小必須培地(EMEM)を5%(v/v)胎児子牛血清(FCS)、2mM Lグルタミンおよび100μ/mLl-sllicin)で補う。
  2. 従来の細胞培養フラスコまたはディッシュの底に成長したストック培養の細胞層を2回リンスする。
  3. PBSを取り出し、トリプシン溶液(25cm2の場合は1mL)を加え、細胞を37°Cで5分間インキュベートさせる(U-373 MG細胞に適用)。
  4. 顕微鏡による成長基質の底部からの細胞の完全な剥離のための制御。
  5. 細胞懸濁液にトリプシン1mL当たり9mLの細胞培養培地を加えて、細胞が完全に剥離するとすぐにトリプシン反応を停止する。懸濁液を基板上にピペットで覆うことによって、細胞培養基質の底部から残った細胞を慎重にすすす....

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Results

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各種アゴニスト溶液を調製するための典型的なスキームは、表1-4にアゴニストとしてヒスタミンを用いた8ウェル電極アレイを用いた実験のために示されている。表1および表2は、加算モード1(図1)を用いた実験の体積および濃度を示し、表3および表4は加算モード2(図1)に続く実験の体積および濃度を示す。データは、式(1)を用いて計算された。

代表的な実験は、ヒスタミン1受容体を内因的に発現するU-373 MG細胞のコンフルエント層について、ヒスタミンをアゴニストとして使用して直径250μmの働く電極を用いて8ウェル電極アレイ上で増殖した。測定は12kHzの単一周波数で行った。アゴニ.......

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Discussion

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このプロトコルは、同じ受容体に対する特定のアンタゴニストの存在または存在しない場合のアゴニスト誘発GPCR活性化の用量応答関係を決定するためのラベルフリーインピーダンス測定の方法を記載する。この方法の概念実証は、最近の出版物12で提示されました。我々の知る限りでは、インビトロの単一細胞層を用いたアゴニスト媒介GPCR活性化の完全な用量応答曲線の確立を記述する最初の研究である。このアプローチは、必然的にラベルフリーの細胞モニタリングアプローチの使用を必要とし、エンドポイントアッセイには適用されません。

このプロトコルは、細胞のインピーダンスが連続的に記録されている間に、その内因性アゴニストヒスタミンの濃度の増加で刺激されるヒトヒスタミン1受容体(hHR1)を内因的に発現するU-373 MG細胞の例で実証されている。アンタゴニスト研究に対するプロトコルの適用性を実証するために、hH1Rに対する競合的アンタゴニストであるジフェンヒドラミンの一定濃度の1つの存在下で実験を繰り返した。インピーダンス記録はまた、他のH1Rアゴニスト(例えば、UR.......

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Disclosures

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著者たちは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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私たちは、バーバラ・ゴリクニックとナジャ・ヒンターレイターが細胞培養と実験的解決策の調製に協力してくれたことに感謝します。著者らは、ドイツ研究財団(DFG)が助成金番号222125149に基づき資金提供した研究訓練グループ1910「選択的GPCRリガンドの薬用化学」による財政的支援に感謝して認めている。JASは、バイエルン男女共同参画プログラムによって授与された奨学金に特に感謝しています。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BürkerカウントチャンバーMarienfeld(Lauda-Königshofen, Germany)640210
cell culture flasks 25 cm2Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)690175
Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)Thermo
Heraeus 1S-R)Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)\
Diphenhydramine hydrochlorideSigma Aldrich (タウフキルヒェン、ドイツ)D3630
Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3Sigma Aldrich (タウフキルヒェン、ドイツ)D5671
インピーダンス機器 (ECIS Zθ)Applied BioPhysics Inc. (米国ニューヨーク州トロイ)\
8-well electrode Arrays (8W1E PET)Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)\PETベース、0.049 mm2作動電極と~50 mm2 対電極 (金)
96ウェル電極アレイ (96W1E+ PET)Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, 米国)\PETベース、電極2個(金)、総電極面積0.256 mm2
牛胎児血清(FCS)Biochrom(ベルリン、ドイツ)S0615
Histamine dihydrochlorideCarl Roth(カールスルーエ、ドイツ)4017.1
層流フード(Herasafe、KS 12)Thermo Scientific(ダルムシュタット、ドイツ)51022515クラスII安全キャビネット
Leibovitz' L-15 mediumThermo Scientific (ダルムシュタット、ドイツ)21083-027
L-グルタミンSigma Aldrich (タウフキルヒェン、ドイツ)G7513
マイクロピペット 大 (100 - 1000 µL)ブラント(ヴェルトハイム、ドイツ)704780
マイクロピペット大(20-200&マイクロ;L)Brandt(ヴェルトハイム、ドイツ)704778
顕微鏡(位相差、Nikon Diaphot)Nikon(Dü
ニシリン/ストレプトマイシンSigma Aldrich (タウフキルヒェン、ドイツ)P0781
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Sigma Aldrich (タウフキルヒェン、ドイツ)D8537
ピペット、血清学的Greiner bio-one (フリッケンハウゼン、ドイツ)607 180
ピペット (accu-jet pro)ブラント (ヴェルトハイム、ドイツ)26300
トリプシンSigma Aldrich (タウフキルヒェン、ドイツ)T4174in PBS with 1 mM EDTA
Tube, 15 mLGreiner bio-one (Frickenhausen, Germany)188 271
Tube, 50 mLGreiner bio-one (Frickenhausen, Germany)210 261
U-373 MG cellsATCC (Rockville, MD, USA)ATCC HTB-17
ウォーターバス (TW21)Julabo (Seelbach)、ドイツ)\
Scientific ( 子ペ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
  2. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.<....

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