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1. 電極アレイ上のセルシード
注: 電極レイアウトの選択は、感度と調査中のセル数のトレードオフです。電極が小さいほど、感度が高いほど測定ですが、研究中のセルの数は小さくなります。ベースライン条件下で時間の経過に伴う強いインピーダンス変動を示す細胞の場合、より大きなまたは桁間電極が好ましい。
- 37 °Cの水浴で標準的な細胞の継ぎ子および播種に必要なすべての解決を前暖め。ヒトU-373 MG細胞を用いたアッセイ:カルシウムとマグネシウムなしのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、0.05%(w/v)トリプシン、細胞培養培地(イーグルの最小必須培地(EMEM)を5%(v/v)胎児子牛血清(FCS)、2mM Lグルタミンおよび100μ/mLl-sllicin)で補う。
- 従来の細胞培養フラスコまたはディッシュの底に成長したストック培養の細胞層を2回リンスする。
- PBSを取り出し、トリプシン溶液(25cm2の場合は1mL)を加え、細胞を37°Cで5分間インキュベートさせる(U-373 MG細胞に適用)。
- 顕微鏡による成長基質の底部からの細胞の完全な剥離のための制御。
- 細胞懸濁液にトリプシン1mL当たり9mLの細胞培養培地を加えて、細胞が完全に剥離するとすぐにトリプシン反応を停止する。懸濁液を基板上にピペットで覆うことによって、細胞培養基質の底部から残った細胞を慎重にすすする。
- ピペットで細胞懸濁液を回収し、遠心管(15 mLまたは50 mLチューブ)に移します。
- 室温で10分間110 x gで遠心分離して細胞をスピンダウンします。
- 細胞をカウントする前に、細胞ペレットを慎重に取り除き、細胞ペレットを培地に再懸濁してから、細胞をカウントします(例えば位相差顕微鏡や手動計数用のヘリコトメーターを使用)。
- セル懸濁液を目的のセル密度に調整します。U-373 MG細胞を用いた実験では、100 000個の細胞/cm2を使用して、48時間以内にコンフルエントな細胞層を増殖させます。これは、成長面積が約0.8cm2、ウェル体積が400μLの8ウェル電極アレイの場合、200,000セル/mLの細胞密度に変換されます。
注:再現性のあるGPCR活性化実験では、細胞を電極アレイ上の単層に集結させる必要があります。細胞表面上の適切な受容体発現を確実にするために、細胞は実験を行う前に少なくとも36時間播種されるべきである。細胞の播種に関して異なる細胞密度を試験することは、多くの場合、最良の実験条件を特定するのに意味がある。
- セル懸濁液を電極アレイの井戸に加え、ウェルの底部のセルの均一な分布を確保するために、セルを室温で10~15分間落ち着かせます。
- 37°Cで5%CO2(培地タイプに依存)と加湿雰囲気で標準細胞培養インキュベーターで少なくとも36時間細胞を成長させます。実験前に細胞培養培地24時間を変更した。
- 実験当日、(位相コントラスト)顕微鏡で電極アレイ上の細胞層を検査し、細胞を用いた電極の完全な被覆を確実に行います。
2. 無血清培地中の細胞の平衡化
- この研究で、予め温かい無血清培地:ライボヴィッツのL15培地。
- 電極アレイ上で増殖した細胞から細胞培養培地を除去し、予め温めた無血清培地に置き換えます。8 ウェル形式の電極アレイには 200 μL、96 ウェル電極アレイには 150 μL を使用します。
- 細胞を少なくとも2時間37°Cで無血清培地で平衡させる。平衡時間は、セルの種類によって大きく異なります。例えば、U-373 MG細胞は2時間必要、CHO細胞は4時間必要であり、BAECはL-15培地での一晩の平衡化を必要とし得る。
注:L-15培地はCO2独立であり、CO2フリー雰囲気を必要とします。L-15での平衡化のために、インキュベーターを0%CO2に設定する。平衡はインピーダンスの測定値によって監視することができ、最初の実験のために行うことをお勧めします。
3. インピーダンス測定値による細胞平衡のモニタリング
- 電極アレイをインピーダンスアナライザの接続アレイホルダーに入れます。
- 電極とインピーダンスアナライザの間に適切な低インピーダンス接触を確保します。このチェックは、異なる楽器のために個別に異なります。
メモ:器具が電極に接続できない場合は、再度コンタクトクランプを開き、ホルダー内の正しい位置に電極アレイを再び再処理して、再試行してください。
- ソフトウェアのユーザーインターフェイスから電極タイプおよび/またはマルチウェル形式を選択します。
- 測定パラメータを設定します。さまざまなオプションが利用できます。
注:最も感度の高いAC周波数を選択するには、研究中の電極レイアウトとセルタイプに依存するため、文献および機器のマニュアルを参照してください。通常、センシング周波数は4kHz~50kHzの範囲です。ここで、U-373 MG細胞を直径250μmの円形の電極上で成長させ、12kHzの交流周波数でモニタリングした。
- 単一および複数の周波数データ取得モードが使用可能な場合は、単一周波数モードを選択して最大時間分解能を確保します。測定は、この単一周波数で行われます。最も広く普及した器械のために、利用できる頻度の窓に沿って多数の事前に設定された頻度がある。
- 調査中のウェルの数が低いか、または時間分解能が重要でない場合は、代わりに複数の周波数記録を選択します。指定した周波数数でのインピーダンス測定値は、後で詳細な分析のためにすべてのウェルに記録されます。
注: 時間分解能は、ウェルあたりに記録される周波数の数が増加し、ウェルの数が増加すると減少します。周波数とデータ取得モードの選択オプションは、計測器のタイプやバージョンによって異なります。
- 時間コースデータの取得を開始します。
- 細胞層インピーダンス(少なくとも2時間)に従って、インピーダンスが安定するまで続きます。その間、アゴニストのソリューションを準備します。
- 細胞層が安定したインピーダンスレベルに達した場合、(i)同じ実験内で連続アゴニスト付加に進むか、(ii)データ取得を終了し、アゴニスト誘発受容体活性化をモニタリングするための新しいデータセットを開始する。
4. アゴニストモードでの実験のためのアゴニスト溶液の調製
- 式(1)に従って、シリアル・ドージングの各ステップに必要なアゴニスト解の濃度を計算します。nの範囲は、1から連続加算の総数i.xは、ステップn.yでウェル内の濃度および体積を示し、ステップnにおける「溶液を加える」の量を示す。
注: 反復の数を考慮し、各濃度ステップの「溶液を追加する」の総体積を計算します。一般的な計算の結果は、表 1-4に示されています。この範囲は、連続添加時に投与される部分の濃度と数を定義するので、研究されるアゴニスト濃度範囲についての一般的な考え方が必要です。連続アゴニスト付加プロトコルを使用して、アゴニスト濃度が段階的に増加する。したがって、次の用量が加えられるときにすでにウェルに存在するアゴニストの量を考慮に入れねばなっている。ウェルにすでに存在するアゴニスト分子の数がnx =c x (現在の濃度xおよび体積V X)であり、次の加算後のウェル内の分子数が nx+yである場合、nyを加える分子の数は、溶液に適用される溶液の濃度 cyと体積 V y (ny = c yy)によって決まります。アゴニストの一部を添加した後、ウェル内の新しい量のアゴニスト分子は:cx+y∙V+y =c×××××c∙V+cy y. この計算は、後続の各ステップに適用されます。各工程で添加する部分のウェルとアゴニストの量のウェルとアゴニストの量の相互依存性のため、各ステップの後の最終濃度を事前に定義することが重要である。
モード 1:液体が連続的に加えられているので、ウェル内の体積は各ステップで増加します。
このモードと 8 ウェル形式を使用して、Vx1 = 200 μL および Vy1 . V yi = 30 μL を使用します。
モード 2:各ステップで追加されたボリュームが、後続の追加の直前に削除されるので、ウェル内のボリュームは一定です。
このモードと 96 ウェル形式を使用して、Vx1 = 150 μL および Vy1. Vyi = 75 μL を使用します。
- 濃度あたりの総容積とピペット処理の詳細な手順を含むデータシートを印刷します。
- 必要な量ですべてのソリューションを準備します。細胞の平衡化に使用されるのと同じ無血清培地ですべてのアゴニスト溶液を作る。
注意: ヒスタミンジドロクロリドは、2012 OSHAハザード通信規格(29 CFR 1910.1200)によって危険と考えられています。ヒスタミンは、皮膚刺激、重篤な眼刺激、アレルギー、アレルギー、喘息症状、呼吸困難を引き起こす可能性があり、吸入すると呼吸刺激を引き起こす可能性があります。安全データシートをご検討ください。
注:アゴニストソリューションを可能な限り新鮮にしてください。溶液中のアゴニストの安定性はかなり異なる場合がある。実験に使用するまで溶液を4°C以下に保存してください。一部の分子に対しては、ペプチド系または脂質ベースの分子を使用する場合のBSAのような追加の安定化添加剤は、ウェルおよびチューブの壁への吸着を防ぐために考慮され得る。
- 実験を96ウェル形式で行う場合は、溶液を従来の96ウェルプレート(無電極)に移し、8-(または12)チャンネルピレットを使用して電極アレイに素早く液体を転送します。
5. アンタゴニストモードでの実験のためのアゴニスト溶液の調製
注:全体に適用される濃度でアンタゴニスト溶液を準備します。アンタゴニスト溶液の体積および濃度は、アゴニスト添加のモード(1または2)に依存する。8 ウェル形式または 96 ウェル形式での実験例 2: (A) 8 ウェル形式 (Vx1 = 200 μL, Vアンタゴニスト= 200 μL);(B) 96 ウェル形式 (Vx1 = 150 μL, Vアンタゴニスト= 75 μL).
- 手順 4.1 で説明されているように、シリアル・ドージングの各ステップに必要な各アゴニスト溶液の濃度を計算します。
- 細胞の平衡化に使用されるのと同じ無血清培地ですべてのアゴニスト溶液を作り、実験でそれぞれの井戸について計画された同じ最終濃度でアンタゴニストを加える。
注:この場合、ヒスタミンストック溶液(10 mM)はL-15培地で調製されます。アゴニストが他の溶媒(例えば、ジメチルスルフォキシド(DMSO))に溶解される場合、溶媒制御は、添加の各ステップで増加する溶媒負荷を考慮して含まれるべきである。
6. アゴニストモードでシリアル加算プロトコルを実行する
- ステップ 3.1 ~ 3.5 で説明されているように、データの取得を開始します。
- アゴニスト溶液を使用前に温めるには、添加前に約10〜15分前にインキュベーターに入れることで、使用前にアゴニスト溶液を温めます。
注:熱陰性物質を使用する場合、溶液は37°Cに長く保たれるべきではありません。10~15分間のプレウォーミングが重要と考えられる場合は、水浴に添加する直前に37°Cに溶液を持参してください。
- 選択した追加モードに応じて、アゴニストのシリアル・ドージングを実行します。次モード1次用量の添加ごとにウェルの総体積が増加する。モード2では、各ステップで追加される同じ体積も、次の高用量を追加する直前に再び除去される。
注:2つの後続のアゴニスト用量の間の細胞層の平衡化に必要な時間は、細胞の応答時間に依存する。並列モードでの最初の実験(1つのウェル - 1つの濃度)は、異なるアゴニスト濃度の(i)細胞応答時間と(ii)最も敏感な曲線パラメータ(例えば、インピーダンス最大、時間xの後のインピーダンス)を明らかにします。
A:モード1 / 8ウェルフォーマット
- 無血清培地200μLで平衡化した細胞に、アゴニストの最も低濃度の溶液の30μLを加える。
- 細胞が応答し、事前に定義された期間(例えば、15分)に対して平衡化させます。
- 次に高濃度の2番目の溶液の30μLを加えます。
- 3 番目、4 番目のアゴニストソリューションを使用して、手順 6.3.1-6.3.3 を繰り返します。
注:10の濃度ステップで作業すると、実験の最後に合計500μLの結果となり、これは〜550 μLのこれらの井戸の最大適用体積をわずかに下回ります。
B:モード2 / 96ウェルフォーマット
メモ:96ウェル形式の実験を実行する際に、インピーダンス計測器のソフトウェアを介して各液体処理ステップ(追加/除去)中にデータ取得を一時停止します。より精巧な液体処理は、データ収集を妨げる可能性があります。マルチチャンネルピペットを使用します。
- データ取得を一時停止します。
- 無血清培地の150μLで平衡化した細胞に、アゴニストの最も低濃度の溶液の75μLを加える。
- データの取得を再開します。
- 細胞が応答し、事前に定義された期間(例えば、15分)に対して平衡化させます。
- 通常の平衡時間が終了する前に約1〜2分、測定を一時停止し、各ウェルから75 μLを取り除きます。
注:ソリューションを削除する必要がある時間ポイントは、並行して監視されるウェルの数とピペットの速度によって異なります。ソリューションの削除に必要な時間は、後続の手順の間の時間を超えないようにする必要があります。
- 次の高濃度で2番目の溶液の75 μLを加え、測定を再開します。
- 3 番目、4 番目のアゴニストソリューションを使用して、手順 6.3.8-6.3.10 を繰り返します。
7. アンタゴニストモードでのシリアル加算プロトコルの実行
- ステップ 3.1 ~ 3.5 の説明に従って測定を開始します。
- 細胞層の平衡化の際に、アンタゴニスト溶液(例えば、L15培地中で1.5μMジフェンヒドラミン塩酸塩の200μL)を調製する。
注意: ジフェンヒドラミン塩酸塩は潜在的な急性の健康影響を持っています..飲み込んだり吸入すると有害で、眼や皮膚に刺激を与える可能性があります。呼吸器および消化管の刺激を引き起こす可能性があります。安全データシートをご検討ください。
- アンタゴニストおよびアゴニスト溶液を、細胞培養物に加える前に約10〜15分前にインキュベーターに入れることで、前温め(cf. 6.2)。アンタゴニストフリーのウェルがアッセイにも含まれている場合は、プレウォーム無血清培地も含まれます。
- 指定された井戸にアンタゴニスト溶液を追加します。細胞をアンタゴニストと15~20分間平衡させます。アンタゴニストフリーのウェルが含まれている場合は、これらのウェルに同じ量の無血清培地を追加します。
- モード2のアンタゴニストの追加によると、井戸から溶液を削除
(A) 8ウェル形式(200 μL)
(B) 96ウェル形式(75 μL)
- ステップ 6.3 で説明されているように、アゴニスト加算シーケンスを実行します。
8. データのエクスポートと分析
- インピーダンス計測器のソフトウェアを使用してデータをエクスポートし、記録されたすべてのデータを独自のデータ形式から共通のデータ形式(例えば、csv)に変換します。この手順により、データの再構成と他のソフトウェア パッケージとの表示が可能になります。
- CSV 形式のデータを科学的なデータ分析ソフトウェアに読み込みます。
- アゴニスト解法の最初の加算前の最後のデータポイントのインピーダンスを減算し、t = 0に加算する時間を設定して、インピーダンス値を正規化します。正規化インピーダンスの時間経過をプロットします。
- 個々の時間コースをプロットし、各加算ステップの後にインピーダンスの最大値を識別します。これらの値を使用してデータ シートを作成します。
- アゴニスト濃度の関数として、インピーダンスの変化の最大値(または適用可能な場合は最小)をプロットします。これは、個々の井戸または平均(平均±SD)のために行うことができます。
- データフィッティングルーチンを使用して、4つのパラメータロジスティックモデル(式2)を使用して、半最大有効濃度(EC50)と最大応答(EMax)を決定します。
注:cはアゴニスト濃度を示し、A1は最小であり、A2はシグモイダル用量応答曲線の最大漸近距離(A2 = EMax)である。EC50は曲線の変曲点における濃度であり、nは丘斜面に対応する。