バイタル顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚におけるマイコバクテリア感染時のマクロファージ溶解細胞死の可視化

マイコバクテリア感染は、宿主免疫細胞死¹を引き起こすことが実証されている。例えば、減衰した株はマクロファージ中のアポトーシスを引き起こし、感染を含む。しかし、毒性株は、溶解細胞死を引き起こし、細菌の播種^を引き起こす^1、2.これらの異なるタイプの細胞死が宿主抗抗抗抗抗抗細菌応答に及ぼす影響を考慮すると、生体内でのマイコバクテリア感染時のマクロファージ細胞死の詳細な観察が必要である。

細胞死を測定する従来の方法は、Annnexin V、TUNEL、またはアクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム染色^3、4、5などの死細胞染色を使用することです。しかし、これらの方法は、生体内での細胞死の動的過程に光を当てることができません。インビトロでの細胞死の観察は、すでに生イメージング⁶によって促進されている。しかしながら、結果が生理学的条件を正確に模倣するかどうかは不明のままである。

ゼブラフィッシュは、宿主抗抗抗抗抗抗抗菌応答を研究するための優れたモデルである。それは人間と同様に高度に保存された免疫系を有し、容易に操作されるゲノム、および初期胚は透明であり、生きたイメージング^{を可能にする7、8、9}を可能に^する。M.マリナムとの感染後、成人ゼブラフィッシュは典型的な成熟肉芽腫構造を形成し、胚性ゼブラフィッシュは構造^9、10のような早期肉芽腫を形成する。自然免疫細胞間細菌相互作用の動的過程は、ゼブラフィッシュM.マリナム感染モデル^11、12において以前に検討されている。しかし、空間的な時間分解能の要件が高いため、自然免疫細胞の死を取り巻く詳細はほとんど未定義のままである。

ここでは、生体内のマイコバクテリア感染によって引き起こされるマクロファージ溶解細胞死のプロセスを可視化する方法について説明する。このプロトコルはまた、発達および炎症の間に生体内の細胞行動を視覚化するために適用され得る。

ゼブラフィッシュは、動物福祉の倫理的見直しのための実験動物ガイドラインに準拠して標準的な条件下で飼育されました (GB/T 35823-2018).本研究におけるゼブラフィッシュ実験は全て承認され(2019-A016-01)、復旦大学上海公衆衛生臨床センターで実施されました。

1. M. マリナム単細胞接種準備 (図 1)

1. セルリアン蛍光M.マリナムグリセロールストックを-80°Cから解凍し、10%(v/v)OADC、0.25%グリセロールおよび50μg/mLハイグロマイシンを有する7H10寒天プレートを接種します。プレートを32°Cで約10日間インキュベートします。
2. 陽性蛍光を発現するコロニーを選択し、10%OADC、0.5%グリセロール、および50μg/mLハイグロマイシンを有する7H9培地の3 mLを接種する。
   1. 培養が対数相(OD₆₀₀ = 0.6~1.0)に達するまで、4~6日間、32°Cと100回転/分(rpm)で接種します。
   2. サブカルチャー(1:100)は、10%OADC、0.5%グリセロール、0.05%Tween-80、およびOD₆₀₀が約1.0に達するまで50μg/mLの新鮮な7H9培地の30 mLで。
      注: 最高のカルチャ品質を得る場合は、この時点でサブカルチャーステップをお勧めします。私たちの経験では、クローンを大量の媒体に直接添加すると、細菌塊の形成につながります。
3. 以下に説明するようにM.マリストム細胞を収集する。
   1. 3,000 x gで10分間遠心分離機を行い、M.マリナムをペレットとして回収する。上清の300°Lを除くすべてを捨て、ペレットの再サスペンドに使用します。
   2. 10%グリセロールで7H9培地の3 mLを追加し、ペレットをさらに再懸濁し、15 s ONで100 Wの水浴中の懸濁液を超音波処理し、合計2分間オフにします。
      注:超音波処理の目的は、マイクロインジェクション針の閉塞を防ぐ接種のための単一の細胞ホモジネートを達成することです。
4. 細菌懸濁液を10mLシリンジに移し、5μmフィルターを通過して細菌塊を除去します。
5. 分光光度計を用いて懸濁液の光学密度(OD)を測定し、10%グリセロールを含む7H9媒体でOD₆₀₀ = 1.0に希釈します。懸濁液を10μLのアリコートに分割し、将来の使用のために-80°Cの冷凍庫で保存します。
6. OADCの10%(v/v)、グリセロールの0.5%、ハイグロマイシンの50μg/mLを含む7H10寒天プレート上の細菌ストックの連続希釈およびめっきによって、接種液(cfu/mL)の細菌濃度を確認します。

2. ゼブラフィッシュ胚製剤

1. 産卵の前日に、飼育室にゼブラフィッシュの繁殖ペアを設置します。
   注:各繁殖室に1組のみを追加します。
2. 受精後1時間以内に翌朝胚を採取する。蒸留水で胚を慎重に洗浄し、E3培地30mLを含む100mmペトリ皿に最大100個の胚を移します。28.5 °Cでインキュベートします。
3. 12時間後、顕微鏡で観察し、受精または損傷した卵を廃棄する。
4. 24 hpfで、N-フェニルチウリア(PTU、0.2 nM最終濃度)で培地を新鮮なE3培地に変更し、顔料の発達を防ぎます。胚がマイクロインジェクションの準備ができるまで、28.5 °Cで胚をインキュベートします。

3. 細菌マイクロインジェクションによる感染

1. 前述の参照¹³に記載されているようにホウケイ酸ガラスマイクロキャピラリー注射針を調製する。
2. ゼブラフィッシュ胚感染用取り付け
   1. マイクロ波100mL1%(w/v)および100 mLの0.5%(w/v)低融解アガロースは、アガロースが完全に溶融するまでオートクレーブ化E3培地中で行う。1 mLのアリコートチューブに分け、4°Cで保存し、将来の使用のために使用します。
   2. 使用前に、アガロースを完全に溶かすまで95°加熱ブロックで加熱します。アガロースを45°Cの加熱ブロックに入れて液体の形で維持する(図2)。
   3. 幹領域における筋肉内感染の取り付け
      1. ガラスのスライドに0.5 mLの1%(w/v)アガロースを均等に注いで、底部アガロース層を作成します。氷箱または冷たい表面に3分間置いて固める。
      2. 卵水中のゼブラフィッシュ胚(48~72hpf)をトリカイン(200μg/mL)とPTUで取り付ける前に5分間麻酔します。下部アガロース層に最大60個のゼブラフィッシュ胚を配置し、慎重に2つの列にレイアウトします(図2B)。
      3. 0.5%(w/v)アガロースを加える前に、組織紙で下部アガロース層の残りの水を取り除き、上層を作成します。胚がアガロースに完全に埋め込まれていることを確認します。ガラスのスライドをもう一度アイスボックスに戻してアガロースを固め、脱水を防ぎます。
      4. 余分なE3卵の水で表面を覆うことによって、アガロースの最上層を湿らせておきます。
   4. 中脳感染症の取り付け
      1. 単一の凹面ガラス顕微鏡スライドの溝を1%(w/v)アガロースで覆い、4~6個のトリカイン麻酔胚をアガロースに移します。
      2. 各胚の頭部を10G針で慎重に上に置きます(図2C)。
      3. すべての胚の位置が固定されたら、ガラススライドを氷箱または冷たい表面に移してアガロースを固化させます。
         注:胚との卵水の移動量を最小限に抑えることによって、低融解アガロースの希釈を避けてください。
3. 感染症に対する細菌の準備
   1. 滅菌濾過フェノールレッド(10x)を細菌ストックの10μLアリコート(ステップ1で作製)に加え、ボルテックスで簡単に混ぜます。
      注:最終濃度は滅菌PBSを使用して調整することができる。
   2. 10 s ON で 100 W を使用して準備を超音波処理し、10 s OFF を 1 分間使用して^、14を形成した可能性のある塊を分割します。
4. マイクロインジェクションによる感染
   1. マイクロインジェクターとマイクロマニピュレータを、以前に報告した¹³のようにマイクロインジェクションの適切な位置と設定に調整する。
   2. マイクロローダーを用いて細菌製剤の3μLを調製針に移す(ステップ3.1参照)。ピペットは、気泡を形成しないようにゆっくりと慎重に。
   3. トランク領域の感染については、100 cfu をトランク領域に注入します (図 3A)。ノトコードに細菌を注入することは避けてください。
      注:注射用cfuは、式cfu=細菌ストック濃度x希釈係数x注入液滴体積によって推定される。実際のcfuは、OADCの10%(v/v)、グリセロールの0.5%、および50μg/mLのハイグロマイシンを含む7H10寒天プレート上に細菌接種液を1滴めっきすることによって確認されます。
   4. 中脳感染の場合は、約500cfuを中脳領域に注入する(図3B)。
   5. マイクロインジェクションの後、ゼブラフィッシュ胚をプラスチックピペットで新鮮な卵水に慎重に洗い流します。
      注:非常に初期の自然免疫細胞応答の観察をカバーするために、できるだけ早くガラス底皿に胚をマウントします。

4. 感染症の生きたイメージング

1. ライブイメージング用魚の取り付け
   1. グラス底35mm皿の真ん中に最大10個のトリカイン麻酔胚を移します。余分な E3 メディアを破棄します。
   2. 1%低融点アガロースで皿をカバーし、10 G針を使用して慎重にゼブラフィッシュ胚の向きを付けます。グラス底皿を氷の上に10s入れ、アガロースを固める。
      注:中脳注射の場合、胚は頭を上向きにアガロースに取り付ける必要があります(図4A)。体幹領域の筋肉内感染の場合、胚はアガロースに横に取り付けるべきである(図4B)。
   3. 完全に固化したら、アガロースを卵水の層(プラス1×トリカインとPTU)で覆います。
2. 3色の高解像度タイムラプス共焦点顕微鏡
   注:以下のステップは、63.0x 1.40オイルUV対物レンズを搭載した共焦点顕微鏡で操作されます。
   1. 環境室の温度を28.5 °Cに設定します。湿気を与え、卵水の蒸発を防ぐために、室内にいくつかの湿ったティッシュペーパーを置きます(補足図1)。
   2. 環境室にゼブラフィッシュと35ミリメートルのガラス底皿を置きます。
   3. 共焦点ソフトウェアを開き、ステージを初期化します。63.0 x 1.40オイルUV目的に切り替え、差動干渉コントラスト(DIC)フィルタを使用して明視野チャネルを使用してゼブラフィッシュを見つけます。
   4. 405ダイオード、アルゴン(20%パワー)、およびDPSS 561 nmレーザーを開きます。適切なレーザーパワーとスペクトル設定を設定します。
      注: セルリアン(励起 = 405 nm;放出= ~456-499 nm)、eGFP(励起= 488 nm、発光= ~500~550 nm)、DsRed2(励起= 561 nm;放出=~575~645 nm)(補足図2B)のスペクトル設定を以下に示します。
   5. "XYZ" "シーケンシャル スキャン" 取得モードを選択し、イメージ形式を "512 x 512 ピクセル" に設定します (補足図 2A)。
   6. "ライブデータ モード" に切り替えます。最初のゼブラフィッシュの位置をターゲットにし、"Begin"と"End"Z の位置をマークします。残りの胚ごとにこのプロセスを繰り返します。プログラムの最後に "一時停止" を追加できます (補足図 2C)。
   7. プログラムのループとサイクルを定義します。
   8. ファイルを保存します。

5. アポトーシスとライブイメージングを誘導する単一細胞UV照射

1. ステップ4.1の説明に従って魚をマウントします。
2. 受精後3日間の中脳領域のイメージング(dpf)マクロファージ特異的トランスジェニックTg(mfap4-eGFP)胚¹⁵
3. 1つの蛍光標識マクロファージの対象領域を選択し、400 Hz速度でスキャンし、50sの6%UVレーザーパワーをスキャンします。
   メモ:走査速度と時間は、個々の顕微鏡に基づいて最適化する必要があります。スキャン時間は、その後標的細胞アポトーシスを引き起こす広範なDNA損傷を引き起こすように最適化する必要がありますが、細胞全体をフォトブリーチすることはありません。
4. 上記の手順を繰り返して、より多くの標的細胞を照射します。
5. セクション4で説明するように中脳領域のタイムラプスイメージングを行う。

6. 画像処理

1. 取得した画像に対して「最大投影」を実行します。
2. [最大投影数] ビューで、ターゲット セルの XY 位置と時間を検索してマークします。
3. 標準ビューに戻り、ターゲット セルの Z 位置を検索してマークします。
4. ターゲット セルの単一レイヤー イメージをトリミングします。
5. オーバーレイチャンネルと明るいフィールドをビデオとしてAVI形式で書き出します。
6. ImageJ でオーバーレイ チャネルと明るいフィールドの対象領域をトリミングします。
7. 最後のステップの 2 つのビデオを垂直方向に結合し、ImageJ で 1 つの AVI 形式のビデオとして保存します。

マイコバクテリウム感染は、感染経路に基づいて異なる宿主応答を引き起こす可能性があります。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚は、蛍光標識細菌を中脳または幹に筋肉内マイクロインジェクションによって感染させ、共焦点生イメージングによって観察される。これら2つの経路を介した感染は、自然免疫細胞の募集とその後の細胞死を引き起こす感染を局所的に制限する。

自然免疫細胞死の詳細を可視化することは困難です。溶解細胞死は非常に短い時間枠で起こり、観察するために高解像度の顕微鏡検査を必要とする。また、自然免疫細胞の運動性が高いため、観察領域外に移動することができます。このプロトコルでは、複数の胚を並行して観察することでこの問題を解決します。ゼブラフィッシュ胚の配列は、感染のための単一のガラス顕微鏡スライドに取り付けることができ、最大10個の胚をライブイメージング用の同じ35mmガラス底皿に取り付けることができます(図4)。共焦点顕微鏡のライブデータモデルを利用することで、複数の胚を同時に観察することができます。これは、生きたイメージングの効率を高め、溶解細胞死プロセス全体を捕捉する確率を大幅に増加させます。

自然免疫系は、マイコバクテリア感染に対する防御の第一線であり、2つの主要なコンポーネントは、マクロファージと好中球です。ここでは、以前に報告されたTg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)とTg(mpeg1:loxP-DsRedx-loxP-eGFP;lyz:eGFP)を利用して、生体内16、17、18のマクロファージと好中球を区別します。細菌に大きく魅了されたマクロファージは丸くなり、最終的な細胞質腫脹、細胞膜の破裂、細胞質含有量の迅速な普及を伴い、運動性の低下を示した。これらの事象は、以前に報告された溶解細胞死の典型的な形態学的変化である(図5A)16。紫外線照射は、ゼブラフィッシュ20、21でアポトーシスを受ける細胞をトリガするために使用されている。この概念と一致して、UV照射マクロファージは、細胞収縮、核断片化、クロマチン縮合(図5B)22、23などの典型的なアポトーシス細胞表現型を示した。セルリアン蛍光M.マリエナム19の使用と組み合わせることで、マクロファージ、好中球、およびM.マリナム間の相互作用の3色ライブイメージングが生体内で達成された。また、マクロファージが積極的に貪食し、M.マリナムを広めることができることも観察した(補足図3A)。しかし、好中球は貪食能力が限られており、明らかな細菌のエンゴージングなしにすぐに溶解細胞死を受けた(補足図3B)。好中球は、セルリアン蛍光を発現しない少数の死んだM.マリナムの食細胞症、または単に限られた死細胞破片の貪食によって引き起こされる可能性がある。

図1:単一細胞細菌調製の概略図単一細胞セルリアン蛍光M.マリアンム株は、記載されたプロセスに従って生成された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:マイクロインジェクション用ゼブラフィッシュ胚装着の図(A) 取り付けプロセスの概略図。(B)ゼブラフィッシュ胚は、幹領域の感染のために横に取り付けられた。(C)ゼブラフィッシュ胚は、中脳の感染のために上向きに向けられた頭部で取り付けられた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:マイクロインジェクションの位置決め(A) 赤い矢印は、幹領域の感染部位を示す。(B) 赤い矢印は、中脳感染の注射部位を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:生イメージングのためのゼブラフィッシュ胚の取り付け(A) 中脳感染では、ゼブラフィッシュ胚を頭部を下方に向けて取り付けた。(B)幹領域感染については、ゼブラフィッシュ胚をガラス底皿の底部に近い注射部位で横に取り付けた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:M.マリナム感染における典型的な形態学的変化は、マクロファージ溶解細胞死およびUV誘導マクロファージアポトーシスを誘発した。(A) M.マリナムに大きく魅了されると溶解細胞死を受けるマクロファージ(Mac)のタイムラプスイメージング3 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)ゼブラフィッシュ胚の中脳は、マイクロインジェクションを介してセルリアン蛍光M.marinum(〜500 cfu)によって感染する。オーバーレイチャンネル(上パネル)とDICチャンネル(下パネル)の両方の画像が提供されます。T 00:00 は 5 h 20 分ポスト感染です。白い破線 = 細胞膜の輪郭;黒い破線=膨潤細胞質;黒い矢印=破裂した細胞膜;赤い破線 = 急速に失われた細胞質含有量。(B)UV照射マクロファージのタイムラプスイメージング。3 dpf Tg(mfap4:eGFP)の中脳領域にある1つのGFP+細胞にUVが照射され、その後タイムラプスイメージングが行われています。白い破線 = 細胞膜の輪郭;黒い矢印 =核断片化とクロマチン凝縮。スケール バー = 15 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:ライブイメージング用に設置された環境室。(A) 温度を28.5 °Cに保つようにデジタルコントローラを設定します。(B) 室内のぬれた拭き取りを設定して湿度を高め、卵水の蒸発を防ぎます。(C) チャンバーのカバーを閉じ、温度安定化のために少なくとも30分間待ってから、生きたイメージングを開始します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図2:ライブイメージング用の共焦点パネル設定(A) 取得パネル設定の表現。(B) レーザーパワーとスペクトル設定の表現(C) ライブデータモードでの複数のジョブとループ設定の表現。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図3:マクロファージは、M.マリナム感染後に溶解細胞死を受ける感染症および好中球を播種する。(A)2 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) ゼブラフィッシュ胚がセルリアン蛍光M.マリナム(〜100 cfu)に感染した2dpf Tg(coro1a:eGFP;lyz:DsRed2)の幹にM.マリナムを広げるマクロファージ。(B)好中球(Neu)は、マイクロインジェクションを介してセルリアン蛍光M.マリナム(〜100cfu)によって感染した3dpf Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)ゼブラフィッシュ胚の幹領域に明らかなM.マリナムを含まない溶解細胞死を受けている。緑色はLRLGに割り当てられ、赤い色は溶解細胞死プロセスのよりよい視覚化のためにeGFPに割り当てられる。シアンの矢印は標的細胞を示す。赤い点の矢印は、次のフレームで細胞質の内容を放出しようとしているセルを指します。緑色の矢印は、細胞質含有量を失ったばかりの死んだ細胞を指します。スケール バー = 25 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ビデオ1:M.マリナムを重く積んだマクロファージは、図5Aに関連する溶解細胞死を受ける。3 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)ゼブラフィッシュ胚がセルリアン蛍光M.marinumに感染した中脳領域の9分および18秒(fps)で9分および18秒のタイムラプスイメージング(63x対物)。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。

ビデオ2:図5Bに関連するUV照射後にマクロファージがアポトーシスを受ける。3 dpf Tg(mfap4:eGFP)ゼブラフィッシュ胚の中脳領域の 6 fps で 74 分のタイムラプスイメージング (63x 目標) .胚の中脳領域にある1つのGFP+細胞にUVが照射され、その後タイムラプスイメージングが行われた。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。

ビデオ3:マクロファージは、補足図3Aに関連するM.マリナムを広める。2 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyz:DsRed2)ゼブラフィッシュ胚がセルリアン蛍光M.マリオナムに感染した3fpsで24分のタイムラプスイメージング(63x目的)。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。

ビデオ4:好中球は、補足図3Bに関連する明らかなM.マキナムエンゴージメントなしで溶解細胞死を受ける。3 dpf Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)ゼブラフィッシュ胚がセルリアン蛍光M.マリオナムに感染した3dpf Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)ゼブラフィッシュ胚の3fpsで7分30sのタイムラプスイメージング(63x目的)。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。

著者たちは何も開示する必要はない。