この方法はユビキチン鎖トポロジーにおけるグローバルな変化の評価を記述する。この評価は、質量分析法に基づく標的プロテオミクスアプローチの適用によって行われます。
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この記事について
サマリー
要約
プロテオーム内のユビキチン鎖トポロジーのグローバルプロファイルの評価は、幅広い生物学的問題に答える上で興味深いものです。ここで概説するプロトコルは、鎖に組み込まれたユビキチンのトリプティック消化後に残されたジグリシン(-GG)修飾を利用する。これらのトポロジ特性ペプチドを定量化することにより、ユビキチン鎖トポロジーの相対的な存在量を求めることができる。これらのペプチドを並列反応モニタリング実験で定量するために必要なステップは、ユビキチン鎖の安定化を考慮して報告されている。重いコントロール、細胞の分解、および消化の準備は、適切な質量分析計のセットアップとデータ分析のワークフローと共に記述されています。ユビキチントポロジーにおける摂動を伴うデータセットの例は、プロトコルの最適化が結果に与える影響の例を伴って提示される。概説された手順に従うことによって、ユーザーは生物学的文脈の中でユビキチントポロジ景観のグローバル評価を行うことができる。
概要
タンパク質の機能と安定性の密接な調節は、生物学の表現法制御の主要な原動力であるため、最も重要です。タンパク質の機能は、その本質的なポリペプチド配列と翻訳後修飾(PTM)の2つの成分から構成されます。グリコシル化、リン酸化、アセチル化、メチル化1など、様々な化学PTMが同定されている。1975年、Goldsteinらの2 は小さなタンパク質を同定し、そのユビキタスな性質のためにユビキチンと名付けた。ユビキチンはタンパク質分解3において重要であることが判明した。しかし、それ以来、シグナル分子としてのユビキチンの機能は、タンパク質安定性の調節をはるかに超えて広がったことが確立されています。ユビキチンシグナル伝達は、タンパク質安定化、オートファジー、細胞周期制御、およびタンパク質の人身売買4のような他の生物学的機能の広い範囲に関与している。
他のPTMは一般的に、特定の部位に対してバイナリ(すなわち、タンパク質が改変または未修飾のまま)であるが、ユビキチンは単量体またはポリマー鎖の両方としてタンパク質を修飾することができ、その後ユビキチン自体はユビキチン化される。また、このポリユビキチン化鎖は、前のユビキチンのユビキチン化を伴ういくつかのトポロジーで開発することができ、8つのリンケージサイト
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プロトコル
1. 重いペプチド標準の調製
- 購入した重いペプチドのサプライヤーと品質に応じて、重いペプチドを希釈する必要があります。このプロトコルは、表1で報告されたペプチド配列を使用し、リジン(13C615N2-リジン)またはアルギニン(13C615N4-アルギニン)に修飾したC末端アミノ酸を有する。
- 重いペプチドを混合し、50%アセトニトリル(ACN)と混合して、10μMの各ペプチドとのペプチドミックスを作成する。
- ペプチドミックスのアリコートを作成し、-80°Cで保存します。
2. サンプル準備
- サンプルのリシス
注: ユビキチン鎖の安定性は、サンプル調製中に考慮する必要があります。生物学的サンプルとバッファーを 4 °C で冷やし、できるだけ迅速にユビキチン安定化バッファーにサンプルを追加します。- 水に1 M NH4HCO3( 炭酸アンモニウム)の溶液を調製し、1 M NaOHを使用してpHを8に調整します。
- 水に200 mM N-エチルマラ....
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結果
PRMによるユビキチン鎖分析の使用を実証するために、マウスメラノーマ細胞株B16と2つの一般的なヒト細胞株A549(腺癌性肺胞基底細胞)およびHeLa(子宮頸癌細胞)の3つの細胞株が選択された。これらの培養物は、収穫前に4時間0、10、または100 mM MG-132で処理される前に、適切な培地で中電関数的な相に成長した。MG-132は、プロテアソーム14によるユビキチン共役タンパク質の分解を防止するプロテアソーム阻害剤である。このような場合、ユビキチン連鎖解析を実証することは適切な試験条件である。K48鎖の増加の結果は 図3に見ることができる。プロテアソーム阻害剤治療は、K48鎖15の増加を誘発した。
導入に記載されているように、SRMまたはMRMとは異なり、PRMは前駆体イオンの選択後にフル製品イオンスキャンを行う。これは、製品イオンが実行前に指定される必要がないことを意味しますが、実行後にキュレーションする必要があります。.......
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ディスカッション
プロテオーム内のユビキチン状態の解析は、多種多様な生物学的問題に対して重要性を増している。サンプルのユビキチン化状態の記述は、ユビキチン化されるタンパク質のプロファイルだけでなく、ユビキチン化のトポロジーにも焦点を当てる必要があります。ここで説明するように、標的MSによるこのトポロジーの評価は、広範囲の生物学的調査において役割を有する。
ここで説明するプロトコルは、グローバル トポロジ プロファイルを提供することを理解する必要があります。ボトムアッププロテオミクスアプローチを使用すると、ユビキチンペプチドを含むユビキチン化されたペプチドの決定が可能になります。ユビキチンペプチドのユビキチン化の観察は、鎖位相の決定を可能にするが、ユビキチンの標的へのリンクは失われる。したがって、特定のタンパク質上の特定の連鎖トポロジーは特定できませんが、グローバルトポロジープロファイルが導出されます。このメソッドをエンリッチメント戦略と組み合わせて、よりターゲットを絞った結果を提供することもできます。このような濃縮は、チェーンの安定性とチェーンポスト濃縮の豊富さを考慮する必要があります。鎖位相の検出.......
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開示事項
著者らは競合する利益を宣言しない。
謝辞
著者らは、代表的な結果に記載されているようにMG-132の治療を伴う細胞ペレットの作成に関するセリーヌ・ジャンティの支援と、プロトコルで使用される大腸菌ペレットの提供に対するエリーゼ・モマーツに感謝したいと考えている。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アセトニトリル (ACN) | メルク | 100029 | |
| 重炭酸アンモニウム (ABC) | Fluka | 9830 | |
| 遠心分離機 | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| クロロアセトアミド (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| ギ酸 (FA) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 85178 | |
| ヘビーペプチド | JPT ペプチドテクノロジー | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC カラム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| 質量分析計 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | Q-Exactive Plus | |
| N-エチルマレイミド (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| ポジティブコントロールチェーン K48 | ボストンバイオケム | UC-240 | |
| ポジティブコントロールチェーン K63 | ボストンバイオケム | UC-340-100 | |
| ポジティブコントロールチェーン M1 | ボストンバイオケム | UC-710B-025 | |
| 水酸化ナトリウム (NaOH) | シグマ | S5881 | |
| ソニファイア | ブランソンソニファイア | SFX 150 | |
| サーモミキサー | エッペンドルフ | サーモミキサー コンフォート | |
| トリフルオロ酢酸 (TFA) | Sigam | T6508 | |
| トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン (TCEP) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 77720 | |
| トリプシン | プロメガ | V1511A | |
| 尿素 | Sigma | 51456 | |
| ウォーターズ μ溶出 C18 プレート | Waters | 186002318 |
参考文献
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90(2011).
- Goldstein, G., et al.
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再版と許可
