Method Article

完全処理された組換えKRAS4b:ファルネシル化およびメチル化タンパク質の分離と特徴付け

DOI:

10.3791/60703

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January 16th, 2020

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1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

In This Article

Summary

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プレニル化は、末梢膜結合タンパク質に対する重要な修飾である。昆虫細胞を操作して、タンパク質とタンパク質と脂質の相互作用の生物物理学的測定を可能にする量でファルネシル化およびカルボキシメチル化KRAS4bを生成することができます

Abstract

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タンパク質のプレニル化は、タンパク質を細胞内膜に標的化する重要な修飾です。ヒト癌の22%で変異しているKRAS4bは、C末端に「CAAX」ボックスモチーフの存在によるファルネシル化およびカルボキシメチル化によって処理される。工学的なバキュロウイルス系は、昆虫細胞においてファルネシル化およびカルボキシメチル化KRAS4bを発現するために使用され、以前に説明されている。ここでは、タンパク質の詳細かつ実用的な精製および生化学的特性評価について説明する。具体的には、アフィニティーおよびイオン交換クロマトグラフィーを使用して、タンパク質を均質化して精製した。無傷および天然質量分析法は、KRAS4bの正しい修飾を検証し、ヌクレオチド結合を検証するために使用された。最後に、ファルネシル化およびカルボキシメチル化KRAS4bとリポソームの膜会合を、表面プラズモン共鳴分光法を用いて測定した。

Introduction

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翻訳後修飾は、タンパク質の機能活性を定義する上で重要な役割を果たします。リン酸化やグリコシル化などの改変は十分に確立されている。しかし、脂質修飾はあまりよく特徴付けされていない。すべての細胞タンパク質の0.5%が1を前もって打ち出す可能性があると推定されている。前駆処理は、CAAXモチーフ2を含むアクセプタータンパク質への15炭素ファルネシルまたは20炭素ゲラニルゲルニル脂質鎖の転写である。前駆加タンパク質は、早期老化3、アルツハイマー病4、心機能障害5、脈支痛症6、および癌7を含むいくつかのヒト疾患の進行に関与している。小型GTPPas、HRAS、NRAS、およびKRAS1、核ラミニン、およびキネトコレスCENP-EおよびFは、基底状態下でファルネシル化タンパク質である。他の小さなGTPアーゼ、すなわちRhoA、RhoC、Rac1、cdc-42、およびRRASはゲラニエルゲラニ化8であるのに対し、RhoBはファルネシル化またはゲラニエルゲラ化9であり得る。<....

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Protocol

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1. タンパク質精製

  1. 表 1に示すように、バッファー A ~ H を準備します。
バッファーソリューションバッファリング剤(全20mM) pH NaCl (mM)イミダゾール (mM)MgCl2 TCEP
AHepes7.3300-51
BHepes7.3....

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Results

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プロトコルの最大の変数の1つは、発現された標的タンパク質(His6-MBP-tev-KRAS4b)の量です。このプロトコルは、トリコプラスシアni細胞株、Tni-FNL17からの単離を用いて開発され、懸濁成長に適応し、血清から離離れた。バキュロウイルス発現系を用いて様々な昆虫細胞株にわたって報告された結果の広い範囲を考えると、Tni-FNLは、少なくとも最初は、KRAS4b-FMeを産生するために使用することをお勧めします。

~65 kDa に移行する暗いタンパク質は、透明化された溶解物と溶出画分 (図 1A)で明らかである必要があります。融合タンパク質は、溶解物中で最も顕著な2つの染色バンドの1つであり、他方は~48kDaで共移行する共発現FNTA/Bである。

精製の中で、CEXステップは2つの理由で重要である:1)超可変領域(HVR)が非常に影響を受けやすいようにタ.......

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Discussion

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代表的な結果セクションで述べたように、精製中に最も重要なステップは、より低い塩中のサンプルの取り扱いです。サンプルが200 mM未満のNaClにさらされる時間を制限することは、沈殿を減らし、サンプル収率を高めるのに役立ちます。プロファイルが期待値と一致しない場合、CEX の結果の解釈が困難になる場合があります (図 2参照)。プロトコルがルーチンになるまで、適切な材料が確実に取り出されるように、無傷の質量分析が完了するまで、前方に取り出されないCEX溶出分率を-80°Cで保存することをお勧めします。CEX ステップで上記のパラメータの外側では、プロトコルは lysis および IMAC ステップで比較的簡単に変更できます。また、プロトコルにサイズ排除クロマトグラフィー(SEX)分離ステップがないことも注目に値する。これは、初期の方法開発(未発表の結果)の間に観察された損失のために省略されます。これらの損失は、タンパク質がナノディスクと複雑である場合には観察されないことが注目に値し、脂質の存在しない場合の損失は、タンパク質と樹脂との疎水性相互作用によるものであることを示唆している.......

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Disclosures

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著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgements

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私たちは、カリッサ・グロース、ジェン・メルハルコ、マット・ドリューのクローン作成と発現支援を、フレデリック国立がん研究研究所タンパク質発現研究所で認めます。このプロジェクトは、契約番号に基づき、国立がん研究所、国立衛生研究所からの連邦資金の全部または一部に資金を提供しています。HHSN261200800001E.この出版物の内容は、必ずしも保健福祉省の見解や方針を反映したものではなく、商号、商業製品、または組織に関する言及も、米国政府による支持を暗示するものではありません。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.8 mL Safe-Lock Tubes, NaturalEppendorf22363204
11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler VialsThermo Scientific30211SS-1232
1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホコリン (POPC)AVANTI 極性脂質の液体ストックとして購入できます
。POLAR LIPIDS840034クロロホルム
5427R 遠心分離機エッペンドルフ
アセトニトリル、HPLC グレードフィッシャー ケミカルA998-1 1L
酢酸アンモニウムSigma-Aldrich09689-250g
アルゴン ガスエアガスアラップ
アッセイ プレート 384コーニング3544
Biacore T200 InstrumentGE Healthcare
Blue Snap-It Seals, T/SThermo ScientificC4011-54B
Branson 超音波浴Thermo Fisher15-336-1000
陽イオン交換クロマトグラフィー (CEX) カラムGE Healthcare Life Sciences29018183HiPrep SP セファロース 高性能
CHAPSSigmaC3023
Dyna Pro プレートリーダーWyatt Technologies
Exactive Plus EMR 質量分析計Thermo Scientific
ギ酸Sigma-AldrichF0507-500Ml試薬グレード以上の
Gilson バイアル 7x14 mm チューブGE HealthcareBR-1002-12
PTFE フォームライナー付きガラスねじガラスねじバイアルサイエンティフィック・スペシャリティーズB69302
高速/卓上遠心分離機サーモフィッシャー・サイエンティフィック05-112-114D最大4,000 xgの
能力 His6-タバコエッチングウイルス(TEV)プロテアーゼAddgene92414Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease.In:Burgess-Brown N.(編)大腸菌における異種遺伝子発現。分子生物学の方法、vol 1586。Humana Press, New York, NY
Imfixedized Metal Affinity Chromatography (IMAC) columnGE Healthcare Life Sciences28-9365-51HisPrep FF 16/10
In-House Water Supply, Arium AdvanceSartorius Stedim18 M&Omegaの抵抗率;ホルダー付き0cm
脂質押出機セットAVANTI POLAR LIPIDS
液体窒素エアガスNI-DEWAR
M110-EH マイクロフルイダイザーマイクロ流体
MabPac RP UHPLC カラム、4 um、3.0 x 50 mmThermo Scientific088645
MabPac SEC-1 カラム、5 um、300 Å、2.1 x 150 mmThermo Scientific088790
MagTran ソフトウェアThermo Scientific
メタノール、HPLC グレードVWR 化学薬品BDH20864.400
NGC クロマトグラフィー システムBioRad78880002NGC QuestTM 100 クロマトグラフィー システム
プロテアーゼ阻害剤 EDTA またはその他のキレート剤を含まないカクテルミリポア シグマP8849
ラバー キャップ タイプ 3GE HealthcareBR-1005-02
シリーズ S センサーチップ L1GE ヘルスケア29104993
分光光度計Thermo Fischer Scientific13-400-519280nm
Ultra-15 遠心フィルターユニット、10K NMWLミリポアシグマUFC901008PES メンブレン
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL 遠心分離フィルターAmiconUFC501024
超遠心分離機Beckman CoulterOptima - L80K100,000 xg
Vanquish UHPLC (ポンプ、カラムハーター、LC システム)Thermo Scientific
Vortex Genie 2Fisher12-812
水、HPLC グレードSigma-Aldrich270733-1L社内の水源を使用できます(下記参照)
Whatman GD/XP PES 0.45 mm シリンジフィルターGE Healthcare - Whatman6994-2504
Xcalibur QualBrowserThermo Scientificプロテオミクスソフトウェア
850457 クロロホルム 1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン (POPS) の液体ストックとして購入 610023

References

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  1. Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
  2. Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry.

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KRAS4b PurificationFarnesylated ProteinCation Exchange ChromatographyIntact Mass SpectrometrySurface Plasmon ResonanceBaculovirus ExpressionLiposome Binding AssayProtein DialysisIMAC ChromatographyNucleotide Binding Analysis

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