方法論記事

外科用クリップを用いたマウスにおけるスリーブ胃切れ術

DOI：

10.3791/60719

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2020年11月14日

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1Cardiovascular Division, Internal Medicine Department, Min-Sheng General Hospital, 2Department of Nutrition and Health Sciences, School of Healthcare Management, Kai-Nan University, 3Institute of Clinical Medicine, National Yang-Ming University, 4Food Science and Biotechnology, College of Biotechnology and Bioresources, University of Da-Yeh, 5Department of Surgery, Min-Sheng General Hospital, 6Department of Critical Care Medicine, Taipei Veterans General Hospital, 7Division of Cardiology, Department of Internal Medicine, Taipei Veterans General Hospital, 8Division of Cardiology, Heart Center, Cheng-Hsin General Hospital, 9Taipei Medical University

この記事について

サマリー

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糖尿病と肥満の有病率は、世界的に継続的に増加しています。糖尿病、肥満、およびそれに関連する死亡率と共罹患率の間のメカニズムをさらに調査する必要があります。ここでは、肥満手術の単純な前臨床モデルとして、動物におけるスリーブ胃摘出(SG)のプロトコルを提示する。

要約

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太りすぎと肥満の人の数は、成人と思春期の両方の人口で継続的に増加しています。これは、2型糖尿病(T2D)および他の代謝問題の増加した普遍的現象と一致する。SGなどの肥満手術は、現在、肥満およびT2Dに対する最も効果的で一般的に使用される長期治療の1つですが、それらの間の関連はまだ完全には探求されていません。ヒトの肥満手術後に見られる結果の根底にあるメカニズムは、前臨床試験に基づいて調べることができる。SGは体重、グルコースレベルおよび多くの代謝パラメータを減少させ、合併症の発生率を低くして行うのは容易である。この研究の目的は、研究者のための動物のバリヤード手術の単純な方法と単純な前臨床モデルを提供することです。

概要

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肥満の有病率は1975年以来、世界中でほぼ3倍に増加しています。2016年には、18歳以上の成人19億人以上が太りすぎで、6億5,000万人以上の成人が肥満でした。成人人口におけるT2Dの罹患率も4.7%から8.5%に倍増し、1980年から2014年の間に成人1億2,200万人から4億2,200万人に増加しました。ほとんどの肥満手術は、大幅な体重減少、体脂肪の減少、および耐糖能、インスリン抵抗性および糖尿病コントロール2の改善をもたらす。T2Dの減量および寛解に加えて、肥満手術はさらに高血圧コントロールおよび肥満関連癌の発達および進行の特定のタイプの低い発生率のような付加的な健康上の利点を生み出す3。肥満手術はまた、T2Dの耐久性のある完全な部分的寛解を誘発し、10年間の主要な冠状動脈性心疾患(CHD)およびある程度の脳血管リスクのリスクを減少させる。しかし、基礎となるメカニズムは完全には理解されていません4.

肥満/代謝手術のためのいくつかの手順があります。.制限的な手術と胃腸バイパス手術の両方が代謝にプラスの効果を提供します 5.肥満手術モデルのうち、SGおよび修正されたRoux-en-Y胃バイパスは、より高い成功と死亡率の低下を有し、マウス6における信頼性の高い制限および胃腸バイパス手術モデルを実証する。胃腸バイパス手術は、長期的には制限的な処置よりも多くの体重減少とグルコース耐性および肝ステアトーシスの有意な改善を提供するが、SGはまだ体重およびグルコースレベルの良好な制御を生じ、合併症の低い発生率で行うのは容易である6。SGの割合は30%から54%に増加し、Roux-en-Y胃バイパス手術は2008年から2014年にかけて52%から32%に減少した7。現在、腹腔鏡下SGは、米国の学術センター内の国家レベルで最も一般的に行われるバリヤード手順8.肥満手術、糖尿病、肥満の間の病態生理学的プロセスに関する多くの報告が発表されていますが、未知のメカニズムをさらに探求するためには、より多くの動物実験が必要です。

このプロトコルは、ヒトの肥満手術後に見られる結果の基礎となるメカニズムを調査するための動物法を作り出すことを目的としている。現在の翻訳研究は、SGからの肥満およびT2D治療のメカニズムに関する洞察を提供するかもしれない。

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プロトコル

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動物の使用に関するすべての手順は、国立陽明大学の施設動物のケアと使用委員会によって承認され、「実験動物のケアと使用のためのガイド」を遵守しました。第 8版、2011年」。麻酔手順は、国立陽明大学、ICAUC-016、2015、第1 版からの実験動物の疼痛制御、麻酔、術前および術後ケアのためのガイドラインに従って行われた。

1. 動物の準備

  1. 約16〜18グラムの重さの国立実験動物センター(NLAC)から20 8週齢の野生型C57BL/ 6雄マウスを得る。これらのマウスをそれぞれ10匹ずつSGまたはシャム操作群にランダムに割り当てる。
  2. 肥満手術または恥の手術の前に、チャウまたは高脂肪食( 補足ファイルを参照)でマウスを開始する9.HFDの少なくとも2つの術前週で食事誘発肥満を産生する。
  3. 国立陽明大学実験動物センターのマウスを12:12の明暗サイクルで収容し、07:00 A.Mに軽い発症を起こし、標準的なげっ歯類のチョウと水に無料で給餌することができます。
  4. すべての動物を食べ物から制限しますが、手術前の夜に無料の水アクセスを許可します。

2. 一般的な術前準備

  1. 手術前に少なくとも6時間はマウスを速くする。5%のイオブルランと酸素(両方とも3-4 L/分)を有する誘導室で麻酔を誘発する。
    1. 麻酔の深さを確認して、後足、前足、耳のピンチ刺激(鈍い曲面滑らかなマイクロ鉗子)が運動反射を呼び起こさないことを確認してください。手術前に皮下注射を介して抗生物質(25mg/kgセファゾリン)を投与する。
  2. 外科的処置のための特定の作業区域を割り当てる。手術領域を清掃し、手術前に75%アルコール溶液で手術台をスプレーします。
  3. マウスを鼻コーンに入れ、2%のイオブルラン(2 L/分)と酸素(4 L/分)で麻酔を維持します。
  4. スリーブ胃切開やシャム操作では、つま先刺激により適切な麻酔深度を確認した後、0.2%のカルボマーアイジェルをマウスの目に塗布してドライアイを防ぎます。
  5. 電気カミソリを使用して、腹部から胸骨まで髪を剃ります。脱毛クリームで残りの髪を取り除き、きれいにします。手術台の上にマウスを置いて、縫合位置に固定します。
  6. 3つのアプリケーションのための75%アルコールと交互にポビドネ-ヨウ素溶液でマウスの腹壁を消毒します。

3. スリーブ胃摘出術と偽の手順

  1. 中足腔内術
    1. マイクロハサミを使用して、上部腹部に長さ1〜1.5cmの正中線切開を行います。
  2. 胃と腸の外向化
    1. 予期しない出血や低ボレミックショックを防ぐために、必要に応じて拡大解剖顕微鏡または拡大鏡の助けを借りてSG手順を実行します。
    2. 2つの湾曲した滑らかな鋸歯状マイクロ鉗子を使用して、お腹を穏やかに動かし、それを完全に外部化します。
    3. 必要に応じて、綿状のプローブと電気焼灼器を使用して左の胃と脾臓をつなぐ胃靭帯を慎重に分割し、周囲の脾臓および他の内臓から胃腸を解剖する。

4. 胃の隔離とクリップ

注: マウスの SG は、以前に公開された10と同じ新しいクリップアプライヤ技術を使用して実行されました。

  1. 胃の眼と幽ルを鉗子で優しく横に伸ばし、正中線(図1および図2)を特定し、胃食道接合部から中中線の内側側の半分に慎重に外科クリップを塗布し、下極を優れた位置に塗布する。胃の75〜80%の周りをクランプして除外し、胃の横袖全体を作成します(図1および図2)。
  2. 腸を横の素肌に移動し、温かい生理塩水湿ガーゼで覆い、必要に応じて腹腔内水分補給を行い、脱水や低体温症を防ぎます。
  3. 横切りした胃を切除し、マイクロシザーで胃の除外された袖を取り除き、ポビドンヨウ素溶液で胃の切り取り端を殺菌する。
  4. クリップラインを5-0モノフィラメント非吸収性縫合糸でオーバーシーし、漏れを防ぎます。縫合線の両端を結び、両端のクリップに固定します。
  5. 腹腔内の適切な位置に胃と腸を戻し、鼻隠れと腹壁に非吸収性の連続および不連続縫合糸を実行している5-0モノフィラメントで腹部を閉じます。
  6. ケトプロフェン(2-5 mg/kg)とセファゾリン(25mg/kg)を含む抗生物質を全手順後に腹腔内で鎮痛薬を投与する。

5. SGのシャム手順

  1. 中腹性腹腔切れで前述した同様の手順を行い、37°C湿潤暖生理食類のガーゼ被覆を用いて腸と胃を5分間外部化する。
  2. 胃と腸をこれらの内臓の適切な部位に戻します。
  3. 前に述べたように、腹壁を慎重に閉じ、遅いまたは非吸収性のモノフィラメント縫合糸を使用して、鼻隠れと皮膚に連続的かつ不連続な閉鎖の2層を使用します。ケトプロフェン(2-5 mg/kg)とセファゾリン(25mg/kg)を含む抗生物質を全手順後に腹腔内で鎮痛薬を投与する。

6. 一般的な術後ケア

  1. イオブルランを停止し、マウスが完全に目を覚ますまで3-5 L /分の部屋の空気の流れを続けます。
  2. 動きが取り戻され、ケージの周りを歩き始める間、マウスを見続けてください。
  3. 30°Cの独立インキュベーターにマウスを5日間置きます。マウスが互いに怪我をするのを防ぐために、ケージごとにマウスが1つしか存在しないようにしてください。
  4. 手術後3日間、ゲルダイエット食品(高脂肪ゲルダイエット:10%ラード、10%液体糖、57%水)への無料アクセスを復帰し、手術後3日間に割り当てられた以前の食事を再導入します。
  5. 皮下または腹腔内にケトプロフェン(2〜5mg/kg)、セファゾリン(25mg/kg)を手術後1日間注射する。
  6. 研究期間全体を通して毎週マウスの体重を評価します。動物が手術後に苦しんでいる場合、必要に応じて1日1回の疼痛制御のために腹腔内注射によってケトプロフェン(2-5 mg/kg)を提供する。
    注:ここでは、SGの生存率は学習期間の後90%であった。

7. 代謝パラメータ評価

  1. 6時間速いマウス、ベースライン血液サンプル(0分)を採取する。自由に動くマウス11,12の尾静脈の先端から全ての血液試料を12得る。
  2. グルコース耐性試験のために腹腔内注射により50%デキストロースの1mg/gを送達する。
  3. グルコメータとテストストリップを用いた重複サンプルで、グルコース投与後0、5、15、30、60、および120分で、自由に動くマウスの尾静脈の先端から血糖値を測定します。
  4. 全血サンプル(n=各グループにつき10)を、凝固して室温で30分間保管します。
  5. 血液試料を4°Cで10分間3,000xgで遠心分離する。 g
  6. 血栓を乱さずに血漿を別々のチューブに移し、-80°Cで保管してください。
  7. 研究の最後に、ヘモグロビンA1c(HBA1c)、グルコース、コレステロール、インスリンレベルの市販マウスELISAキットを使用して、製造者のガイドラインに従って血漿サンプルを研究します。

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結果

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操作の結果を図 3および図 4に示します。研究の生存率は90%であった。1つのマウスは弱さのためにシャムグループで死亡し、別のマウスは未知の理由で操作後3日目にSGグループで死亡した。HFDを与えられたマウスの操作後(第3週)の体重減少(図3A)に関して得られた結果は、ヒトで観察されたものと非常によく似ていて、最終的な体重減少は約15〜20であった。13この研究はまた、HFD供給マウスにおけるSG手術後にコレステロール値(図3B)が有意に低下することを実証した。

より良いインスリン感受性および耐糖能は、腹腔内グルコース耐性試験(IPGTT)によって手術後すぐに観察された。今回の研究では、HFDによる肥満が野生型C57BL/6マウスのインスリン抵抗性およびグルコース不耐症を誘発し、SGによって矯正でき...

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ディスカッション

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将来のコホート研究のほとんどは、体重指数を増加させることが死亡率の増加に関連していることを確認しています。.肥満は、糖尿病、心血管疾患(CVD)、および両方の男女の死亡のリスクが高いと関連しています。特定の病理過程は、糖尿病、肥満、および死亡率14との間のリンクを確立している。系統的レビューは、心室肥大回帰の証拠と同様に拡張期機能の改善を伴うCVDの危険因子を減少させるバリヤード手術の利点を示す15。肥満/代謝手術は、肥満糖尿病患者における伝統的なCVD危険因子を改善することができ、そして10年間のCHDおよび致命的なCHDリスクは、T2D4を有する肥満患者における様々な肥満/代謝外科的処置の後に最大50%減少することが示されている。

肥満の最も効果的な長期的な治療戦略である肥満手術.脂質プロファイル、炎症バイオマーカー、血圧、心不全などの肥満手術による代謝パラメータの有意な改善は、特に予期しない2型糖尿病コントロールにおいて注目されていま...

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開示事項

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著者らは利益相反を宣言しない。

謝辞

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イザベル・ルーさんに英語のナレーションに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.9%生理食塩水中国化学&塩水製薬株式会社
5-0モノフィラメント縫合糸Shineteh Inc. 台湾Ethicon
AlmShineteh Inc. 台湾ST-A072PKUNIK
動物麻酔ステップ技術0712VAP11076Matrx
Barraqer-Troutman 鉗子Shineteh Inc. 台湾ST-N309 (H-4410)UNIK
セファゾリン台湾 ベテラン薬局会社
チャウダイエット研究ダイエット
グルコースストリップとグルコースメーターBeneCheckBKM13-1BeneCheck
HbA1cキットレベルOKEH00661
血液学システム富士FUJI DRI-CHEM 4000iヨーロッパ
高脂肪ダイエット研究ダイエット1810724LabDiet
アイリス鉗子Shineteh Inc. 台湾ST-1210UNIK
アイリスハサミShineteh Inc. 台湾ST-S011UNIK
イソフルランパニオン &BFバイオテクノロジーINC8547パニオン&BF
KetoprofenSigma22071154Sigma-Aldrich
実体顕微鏡MicroTechSZ-5TMicroTech
サージカル クリップ (M)Echicon Inc., Somerville, NJSize M, 5mm
Vidisic gelDr. Gerhard Mann Chem.-pharm.Fabrik GmbH
(英語)

参考文献

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