方法論記事

標的抗原特異的治療抗体の腫瘍と組織分布の分析

DOI：

10.3791/60727

⸱

2020年5月16日

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1Laboratory of Novel Biologics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Genetics, UVA Cancer Center, University of Virginia School of Medicine, 3Center for Comparative Medicine, University of Virginia

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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ここでは、マウス腫瘍異種移植片モデルにおける抗体のin vivo局在化を研究するプロトコルを提示する。

要約

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モノクローナル抗体は、がん細胞を排除する可変独立的な機構によって働く高親和性多機能薬である。過去数十年にわたり、抗体薬物コンジュゲート、二重特異性抗体、キメラ抗原受容体(CAR)および癌免疫療法の分野は、基礎および治療学的調査の最も有望な分野として浮上してきました。白血病と黒色腫の免疫チェックポイント受容体とCAR-T細胞を画期的なペースで標的とした数多くの成功したヒト試験により、抗体工学のバリエーションに由来する腫瘍学的治療のための非常にエキサイティングな時間です。残念ながら、腫瘍床における免疫エフェクター細胞の利用が限られているため、抗体およびCARベースの治療の有意に多数のヒト試験においても失望することが証明されている。重要なことに、腫瘍以外の組織における治療抗体の非特異的分布は、臨床的有効性の欠如、関連する毒性および臨床的障害にも寄与する。ヒト臨床トレイルへの前臨床試験の忠実な翻訳は、マウス腫瘍異種移植片の有効性および安全性研究に大きく依存しているので、ここでは、治療抗体の腫瘍および一般的な組織分布を試験する方法を強調する。これは、タンパク質A精製抗体を近赤外蛍光色素で標識し、続いて腫瘍を有するマウスのライブイメージングを行うことによって達成される。

概要

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FDAはCD3を標的とする最初のモノクローナル抗体を承認しました (OKT3, ムロモナブ)1,2.それ以来、次の20年間、免疫チェックポイント阻害剤3に対する抗体の圧倒的な成功により、抗体工学の分野で急速な爆発が起こった。免疫系の間接的な活性化に加えて、抗体は、免疫エフェクター細胞を正確に関与させるために癌細胞に直接フラグを付け、死の受容体アゴニストを介して細胞毒性を引き起こし、腫瘍細胞生存シグナル伝達をブロックし、血管新生(血管の成長)を妨害し、免疫チェックポイント調節因子を制約し、放射性同位体、化学療法薬およびsiRNAを共役剤として送達することを目的としている。また、患者由来T細胞やNK細胞(CAR-TおよびCAR-NK)の表面上の様々な抗体の単鎖可変フラグメント(scFv)を研究することは、細胞ベース療法のための臨床研究の急速な成長領域である4。

抗原発現腫瘍細胞への選択性を提供する抗体系薬物の超高親和性は、それを魅力的な薬剤にする。同様に、治療用抗体(または化学薬品)の標的送達および腫瘍保持は、毒性に対する有効性のバランスをとるための鍵である。したがって、二重特異性5

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プロトコル

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動物の取り扱いと腫瘍異種移植片の研究に関するすべての手順は、バージニア大学の制度動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって見直され、承認され、関連する規制基準に準拠しています。

1. 抗体の発現と精製

  1. CHO細胞の維持
    1. フリースタイルCHOメディアでCHO細胞を成長させます ガラスまたは使い捨てのいずれかのデロングエルレンマイヤーフラスコを使用して5%CO2 で130 rpmで揺れる37°Cで商業的に入手可能な1xグルタミンサプリメントを補います。
      注:攪拌を増加させ、揺れ状態の間にガス伝達を改善するために、ベントキャップ付きのバッフルフラスコを使用することを強くお勧めします。懸濁液培養の撹拌が限定的に起きるために、抗体収量が通常のフラスコ(非バッフル)で有意に低下した。
    2. セルの生存率が 95%の 1 ~5 x 10個のセル /mL の間でセル数を維持します。セル数が 5 x 106 セル/mL を超える場合は、セルを分割します。CHO細胞が0.2 x 106 セル/mL以下に達することを決して許しません。
  2. CHO細胞のトランスフェクション
    1. 200 mL の培地 (2 x 106 細胞/mL) のデンロン エルレンマイヤー バッフルフラスコ....

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結果

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記載された方法論では、まず、葉酸受容体α-1(FOLR1)を標的とする抗体を、ファレツズマブとレカツマブと共にファレツズマブおよびレカツマブからなるBaCaと呼ばれる二重特異性抗体と、アバゴボマブなどの対照抗体と共にクローニングした( 補助ファイル1に提供される配列)。DNAクローン中の代表的な可変重(VH)ドメインおよび可変光(VL)ドメイン(pVH,pVL)の詳細を 図1Aに示す。陽性クローンを確認するために、シグナルペプチドフォワード(SP For)およびCK Rev/CH3 Revプライマー( 補助ファイル1に提供される配列)を用いてコロニーPCRを実施した。コロニーPCRの代表的な結果は、軽鎖および重鎖の予想サイズを確認する(図1C)。陽性抗体クローンは、また、サンガーシーケンシングを用いて確認した。確認されたpVHおよびpVL DNAクローニングに続いて、CHO懸濁培養物を用いてトランスフェクションを行い、続いて4°Cでの抗体のタンパク質A.......

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ディスカッション

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抗癌治療薬の選択的および腫瘍組織特異的送達は、所定の標的治療13の有効性および安全性を測定する鍵である。ここでは、臨床、ファレツズマブおよび非臨床BaCa抗体の詳細な組織および腫瘍分布を調査するための迅速かつ効率的なアプローチについて述べた。記載されたアプローチは、新たに生成された抗体に適用可能であり、腫瘍/臓器の分布特性に臨床的に有効な抗体(所望の資質を有する)と共に使用することができる。ほとんどの抗体標的受容体(乳癌におけるHER2など)が腫瘍細胞(組織)において高過剰発現していることを考えると、その最も最適でない発現および機能は、腫瘍細胞14以外の細胞タイプにおいても重要である。例えば、大腸癌患者における臨床抗体を標的とするEGFRのかなりの割合は、皮膚組織15に対する毒性を蓄積し、生じる、成長および分化がEGFRシグナル伝達および機能を必要とする非癌性組織である。したがって、より大きな動物のコホートにおける肝毒性および組織組織化学アッセイと組み合わせた予備的組織分布調査は、新たに生成され.......

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開示事項

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著者は競合する財政的利益を持っていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

バージニア大学がんセンターコアイメージング施設、生体分子分析施設、先端顕微鏡施設、コアビバリウム支援施設に感謝しています。J. T-Sは卵巣癌アカデミー(OCA-DoD)の初期のキャリア研究者です。この研究は、J.T-Sに対するNCI/NIH助成金(R01CA233752)、米国DoD乳がん研究プログラム(BCRP)の画期的なレベル1賞によってJ.T-S(BC17097)および米国DoD卵巣癌研究プログラム(OCRP)がJ-T-Sに授与されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
FreeStyle CHO mediaGibco Life TechnologiesCat # 12651-014
Anti-Anti (100X)Gibco Life TechnologiesCat # 15240-062
Anti-Clumping AgentGibco Life TechnologiesCat # 01-0057DG
BD Insulin SyringeBD BioSciencesCat #329420
Caliper IVIS SpectrumPerkinElmerCat#124262
CHO CD EfficientFeed BGibco Life TechnologiesCat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)CorningCat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640Corning Cat# 10-040-CV
Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)Jackson ImmunoResearchCat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)Gibco Life TechnologiesCat # 35050-061
HiPure Plasmid Maxiprep kitInvitrogenCat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe ColumnGE HealthcareCat # 11-0034-93
InfusionTakara BioScienceSTO344
IRDye 800CW NHS EsterLI-CORCat # 929-70020
イソフルラン、USPCovetrusCat # 11695-6777-2
潤滑剤 眼軟膏リフレッシュ Lacri-Lube猫 #4089
マトリゲルコーニング猫 #354234
PEI トランスフェクション試薬Thermo Fisher猫 # BMS1003A
Slide-A-Lyzer 透析カセットThermo Scientific猫 #66333
ステリトップ真空フィルターMillipore ExpressCat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTAGibco Life TechnologiesCat # 15400-054
Experimental Models: Cell lines
Human: OVCAR-3American Type Culture CollectionATCC HTB-161
Human: CHO-K cellsStable私たちの研究室で変換ATCC CCL-61
マウス:4T1チップ・ランデン博士からの親切な贈り物、UVA
マウス:MC38UMBCのスザンヌ・オストランド・ローゼンバーグ博士からの親切な贈り物STRプロファイリング
されました マウス:MC38 hFOLR1私たちの研究室で生成されました(この論文)
実験モデル:Animal
マウス: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+EnvigoMultiple Orders
マウス: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJJackson LaboratoryMultiple Orders
されました によって認証

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
  2. Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 1....

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Therapeutic AntibodyAntibody PurificationProtein A ColumnFluorescent LabelingIn Vivo ImagingTumor DistributionTissue DistributionAntibody ConjugationCHO Cell CultureIVIS Imaging

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