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FLAG-ビオチンタンデム精製による架橋と免疫沈降によるタンパク質RNA相互作用のトランスクリプトーム全体プロファイリング

DOI:

10.3791/60730

⸱

May 18th, 2020

 ,  , 
1Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, School of Medicine and School of Life Sciences, Tsinghua University, 2Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

In This Article

Summary

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ここでは、哺乳類細胞におけるRNA結合タンパク質(RRB)のRNA標的を決定するために、フラグビオチンタンデム精製を用いて 、FbioCLIP-seqと呼ばれる改変CLIP-seqプロトコルを提示する。

Abstract

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RNAおよびRNA結合タンパク質(RRP)は、複数の生物学的プロセスを制御します。RNAとRRPの空間的および時間的な配置は、これらのプロセスの繊細な規制の根底にある。CLIP-seq(架橋と免疫沈降)と呼ばれる戦略は、内因性タンパク質とRNAの相互作用をUV架橋と免疫沈降と捉え、免疫沈降を伴って開発されました。RBP研究では従来のCLIP-seq法が広く使用されているにもかかわらず、CLIP法は、高品質の抗体の入手可能性、精製されたRBPからの潜在的な汚染物質、同位体操作の要件、および退屈な実験手順中の情報の潜在的な損失によって制限されています。ここでは、FLAG-ビオチンタグタンデム精製を用いた 、FbioCLIP-seqと呼ばれる改変CLIP-seq法について説明します。タンデム精製と厳しい洗浄条件により、相互作用するRNA結合タンパク質のほとんどすべてが除去されます。したがって、これらの共精製されたRRPによって間接的に媒介されるRNAも減少する。当社 のFbioCLIP-seq法は、同位体を含まない、タンパク質特異的抗体フリーの方法で、SDS-PAGEおよび膜移動手順を伴わない直接タンパク質結合RNAを効率的に検出することを可能にします。

Introduction

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RNAおよびRNA結合タンパク質(RRP)は、スプライシング、翻訳、リボソーム生物形成、エピジェネティック調節、および細胞運命遷移1、2、3、4、5、6を含む多様な細胞プロセスを制御する。これらのプロセスの繊細なメカニズムは、RNAとRRPのユニークな空間的および時間的配置に依存する。したがって、分子レベルでのRNA調節を理解するための重要なステップは、RRPの結合部位に関する位置情報を明らかにすることです。

架橋と免疫沈降(CLIP-seq)と呼ばれる戦略は、目的のタンパク質の免疫沈降に続いてUV架橋とタンパク質RNA相互作用を捕捉するために開発された。方法論の主な特徴は、UV照射によるRNA結合タンパク質とその直接結合RNA分子(〜1Å内)との間の共有結合架橋の誘導である。RBP フットプリントは、CLIP タグ クラスタリングとピーク コールによって決定できます。あるいは、CLIPの逆....

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Protocol

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1. セルラインの構築

  1. 目的の遺伝子をピギーバクトベクターpPiggyBac-FLAG-bio-[対象のcDNA]-(ハイグロマイシン耐性)、FLAG-ビオチンエピトープ13、21を運ぶプラスミドにクローン化し、FLAG-ビオチンタグ融合RBP(FB RBP)を発現させる。
  2. pBaseベクターを用いて発現ベクターを 持つFBRBPを、ビラ酵素22を発現する細胞株にコトランスフェクトする。
    注:本研究では 、FBRBP遺伝子を、統合されたBirA発現ベクター21を持つマウス胚性幹細胞(mESC)にトランスフェクトした。あるいは 、FBRBP発現ベクターをpBaseとpPiggyBac-BirA-V5を一緒に細胞にコトランスフェクトすることができる。
  3. ゼラチン化した皿上でmESCで細胞を成長させ、37°Cで5%CO2でmES培地(材料表)に維持する。 ハイグロマイシンb(100 μg/mL)を1週間用いてトランスフェクトした細胞を選択します。
  4. 薬物選択後、SDSローディングバッファー(

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Results

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FbioCLIP-seq プロシージャの概略図を図 1に示します。FLAG媒介性またはストレプトアビジン媒介性ワンステップアフィニティー精製と比較して、FLAG-ビオチンタンデム精製は、ほとんどすべての精製タンパク質を除去し、間接的なタンパク質とRNA相互作用の汚染を回避する(図2)。LIN28 および WDR43 のFbioCLIP-seq の代表的な結果を図 3および図 4に示します。LIN28またはWDR43 FbioCLIP-seqをmESCで行いました。図3Aは、LIN28とWDR43 FbioCLIP-seqのトラックビューをプレレット7gで示しています。報告されたGGAGモチーフを、7g前およびFbioCLIP-seqに.......

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Discussion

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ここでは、FLAG-ビオチン二重タグ付けシステムを利用してタンパク質RNA複合体のタンデム精製を行う改変CLIP-seq法を紹介します。FLAG-ビオチン二重タグ付けシステムは、タンパク質とタンパク質とDNA相互作用を同定する上で強力であることが示されている13,21.ここでは、タンパク質と相互作用するRNAを同定する際のこのシステムの高い特異性と利便性を示す。タンデム精製と厳しい洗浄条件を通じて、我々はより多くのタンパク質とRNAの相互作用が保存され、同じ複合体内のRRPによって媒介される汚染されたRNA信号を避けるために、挑戦的なSDS-PAGEおよび膜伝達ステップをスキップした。また、これらのステップのバイパスは、放射標識ATPでRNAの標識を回避します。これにより、手順がはるかに簡単になります。なお、出版の準備中に、uvCLAPと呼ばれる同様の方法も24を提案されている。

プロトコルの成功.......

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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中国国立基礎研究プログラム(2017YFA0504204、2018YFA0107604)、中国国立自然科学財団(31630095)、清華大学生命科学センターからの支援を受けています。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
装置
UV架橋剤UVPHL-2000 HybrilLinker
affinity 精製ビーズ
ANTI-FLAGビーズSigma-AldrichA2220
ストレプトアビジンビーズInvitrogen112.06D
Reagents
10x PBSGibco70013032
3 M NaOAcAmbionAM9740
3 x FLAGペプチドSigma-AldrichF4799
ATPSigma-AldrichA6559
塩化カルシウム(CaCl2)Sigma-AldrichC1016
CIPNEBM0290SCIPバッファーは同じパッケージに入っています。
DTTSigma-AldrichD0632
EDTASigma-AldrichE9884
EGTASigma-AldrichE3889
ゲル精製キットQIAGEN28704
グリコーゲンAmbionAM9510
塩化マグネシウム (MgCl2)Sigma-Aldrich449172
MNaseNEBM0247S
NP-40AmrescoM158-500ML
PMSFSigma-Aldrich10837091001
Porteinase KTAKARA9033
プロテアーゼ阻害剤カクテルSigma-AldrichP8340
Q5 High-Fidelity 2X Master MixNEB0492S
逆転写酵素 (SupperScriptIII)Invitrogen18080093
RNA 単離試薬 (Trizol)Invitrogen15596018
RNase InhibitorThermoFisherEO0381
RNaseOUTInvitrogen10777019
DnasePromegaM6101
SDSSigma-Aldrich1614363
塩化ナトリウムSigma-AldrichS9888
デオキシコール酸ナトリウムSigma-AldrichD6750
T4 PNKNEBM0201SPNKバッファーは同じパッケージに入っています。
T4 RNA ligaes、ThermoFisherEL0021T4 RNA リガーゼバッファー、BSA は同じパッケージに入っています。
T4 RNA リガーゼ2、切断されたNEBM0242ST4 RNA リガーゼバッファー、および 50% PEG は同じパッケージに入っています。
トリプシン-EDTAサーモフィッシャー25200072
尿素Sigma-Aldrich208884
mESC 培地
DMEM (80%)Gibco11965126
2-メルカプトエタノールGibco21985023
FCS (15%)Hyclone
Glutamax (1%)Gibco35050061
LIF精製組換えタンパク質; 10,000倍希釈
NEAA (1%)Gibco11140050
Nucleoside mix (1%)MilliporeES-008-D
Penicillin-Streptomycin (1%)Gibco15140122
キット
DNAゲル抽出キットQIAGEN28704
、

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
  2. Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin....

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FLAG Biotin CLIP seqProtein RNA InteractionsCross Linking ImmunoprecipitationTandem PurificationRNA Binding ProteinsUV Cross LinkingStreptavidin BeadsFLAG BeadsRNA IsolationMotif Analysis

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