Method Article

ホワイトフライ組織におけるベゴモウイルスの免疫蛍光および定量PCRによる局在化と定量化

DOI:

10.3791/60731

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February 8th, 2020

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1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

In This Article

Summary

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昆虫組織におけるベゴモウイルスの局在化および定量化のための免疫蛍光法および定量PCR法について述べている。免疫蛍光プロトコルは、ウイルスタンパク質とベクタータンパク質を共局化するために使用することができる。定量PCRプロトコルを拡張して、ホワイトフライ体全体やウイルス感染植物のウイルスを定量化することができます。

Abstract

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ベゴモウイルス(属ベゴモウイルス、ファミリーゲミニビリダ)は、ベミシアタバチ複合体の白飛によって永続的な循環的な方法で伝染する。世界中で生産されるベゴモウイルスによる大規模な被害を考慮すると、ベゴモウイルスとそのホワイトフライベクターとの相互作用を理解することが不可欠です。そのためには、ベクター組織におけるウイルスの局在化および定量化が重要である。ここでは、例としてトマト黄色葉カールウイルス(TYLCV)を用い、免疫蛍光法によるホワイトフライ中腸、一次唾液腺、および卵巣中のベゴモウイルスを局ース化するための詳細なプロトコルを記載する。この方法は、ウイルス被覆タンパク質、色素標識二次抗体、および共焦点顕微鏡に対する特異的抗体の使用に基づいている。このプロトコルは、ベゴモウイルスタンパク質とホワイトフライタンパク質の共局性化にも使用できます。さらに、定量PCR(qPCR)によるホワイトフライ中腸、一次唾液腺、ヘモリフ、卵巣におけるTYLCVの定量に関するプロトコルについて説明します。TYLCV用に特別に設計されたプライマーを使用して、定量のためのプロトコルは、ホワイトフライの異なる組織におけるTYLCVの量の比較を可能にする。記載されたプロトコルは、ホワイトフライおよびウイルス感染植物の体内におけるベゴモウイルスの定量化に有用である可能性がある。これらのプロトコルは、ホワイトフライ中のベゴモウイルスの循環経路を分析したり、ホワイトフライとベゴモウイルスの相互作用を研究する他の方法を補完するものとして使用することができる。

Introduction

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過去数十年で、ベゴモウイルス(属ベゴモウイルス、ファミリージェミニビリダ)は、世界中の多くの野菜、繊維、および観賞用作物の生産に深刻な損害を与えました1.ベゴモウイルスは、35以上の不可解な種2、3を含む複雑な種である白飛ベミシアタバチ(ヘミプテラ:アレイロジダエ)によって永続的に伝えられる。ベゴモウイルスは、直接的または間接的に、フェクンディティ4、長寿4、および宿主の好み5、6などのホワイトフライの生理学および行動に影響を及ぼし得る。さらに、与えられたベゴモウイルス種/株の伝達効率は、同じ実験条件の下でも異なるホワイトフライの不可解種に対して異なり、7,8,9,10であり、ベゴモウイルスとホワイエとの間に複雑な相互作用があることを示す。ホワイトフラ....

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Protocol

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1. ホワイトフライ、ウイルス、植物、ウイルスの獲得

  1. 綿の後部白身フライ(MEAM1)(Gosypiumhirsutum cv.Zhemian 1793)は、14:10の光:暗いサイクルと60±10%の相対湿度で26±1 °Cの温室の防虫ケージに入れた。
  2. ホワイトフライミトコンドリアシトクロムオキシダーゼI遺伝子に基づく従来のPCRを行い、ホワイトフライ集団の純度を決定する。
    1. 20個の成体白いハエを集め、30 μLのリシスバッファー(10 mMトリス、pH = 8.4、50 mM KCl、0.45%[wt/vol]Tween-20、0.2%[wt/vol]ゼラチン、0.45%[vol/vol]ノンイデトP0、60/gL)を含むPCRチューブに個別に移します。
    2. 各 PCR チューブに 5 ~7 個のセラミックビーズ(直径 2 mm)を加え、サンプルを粉砕して組織のリシスを行います。
    3. 65 °Cで1時間、100°Cで10分、遠心分離器を短時間インキュベートします。PCR 増幅のテンプレートとしてこの上清を使用します。
      注:65°Cでのインキュベーション時間は、必要に応じて増加させることができます。
    4. PCR反応を、Taq DNAポリメラーゼの1U、10xバッファーの2μL(Mg 2+)、1.6μLのdNTP混合物(2.5mM)、各プライマーの0.5μL(各プライマー(それぞれ10μM)、2μL....

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Results

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ここでは、B.タバチ複合体とTYLCVのMEAM1ホワイエを例として、手順を説明するために使用しました。本稿に記載されている免疫蛍光およびウイルス定量手順の概要を図1に示す。図2は、PSG、中腸、および卵巣におけるTYLCVおよびDAPI染色の免疫蛍光検出の代表的な結果を示し、TYLCVがPSGおよび中腸においてより多く蓄積し、卵巣に少ないことを示している。図3は、TYLCV感染トマトに24、48、および72時間のホワイタルを与えた後のホワイトフライPSG、中腸、ヘモリオン、および卵巣中のウイルスの相対量を示し、取得アクセス期間の増加に伴い異なるホワイトフライ組織においてウイルスの量が増加したことを示す。

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Discussion

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ここでは、免疫蛍光およびqPCRによるホワイトフライベクターの組織におけるベゴモウイルスの局在化および定量化のためのプロトコルについて説明する。解剖は、ホワイトフライ組織におけるウイルスを局所化し、定量化するための最初のステップを表す。ホワイトフライの体は長さが約1mmで、組織が非常に小さく、解剖することが困難であることを意味します。その上、組織間には強いつながりがあります。例えば、卵巣は細菌と密接に結びついているので、単離が困難である。ここでは、異なる組織の特徴と位置を考慮して、解剖のための異なるアプローチについて説明する。しかし、これらの組織を迅速かつ正確に解剖するには多くの練習が必要です。また、死んだ昆虫は解剖の難しさを増加させるので、新鮮な白飛びを使用するのが最善です。さらに、後の解剖は、組織が汚染を避けるために洗浄されなければならない。

免疫蛍光技術は、特異的抗体の使用に基づいている。抗体の高濃度は、シグナルとバックグラウンドの比率を減少させ、低濃度では十分なシグナルを提供できない可能性があるため、各抗体に適した働き濃度はイメージングにおいて非常に重要です。ここでは、一次.......

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Disclosures

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著者たちは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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この研究は、国家主要研究開発プログラム(助成金番号:2017YFD0200600)、中国農業研究システム(助成金番号:CARS-23-D07)とビル&メリンダ・ゲイツ財団(投資ID OPP1149777)の目印基金によって支援されました。).TYLCV CP抗体を提供してくれたジャンシャン・ウー教授に感謝します。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4% パラホルムアルデヒドマルチサイエンシズF0001
4',6-ジアミジノ-2-phénylindole (DAPI)Abcamab104139
ウシ血清アルブミン (BSA)MultiSciencesA3828
CFX Connect Real-Time PCR Detection SystemBio-RAD185-5201
共焦点顕微鏡ZeissLSM800
Dylight 549-ヤギ 抗マウスEarthoxE032310-02二次抗体
モノクローナル抗体 (MAb 1C4)一次抗体
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Sangon BiotechB548119-0500
実体顕微鏡ZeissStemi 2000-C
TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)TaKaRaRR820AqPCR master mix
ThermocyclerThermofisherA41182
TissuelyzerShaghai jingxinTissuelyser-48
Triton-X-100BBIライフサイエンス9002-93-1
Tween 20BBIライフサイエンス9005-64-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
  2. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).

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