電気刺激によるラットにおける急性ポンチン梗塞の確立

1980年代以降、シリコーンフィラメントによって誘導される中大脳動脈閉塞(MCAO)モデルは、脳卒中基礎研究¹に広く用いられている。他の方法(すなわち、MCA2の1つの分岐の縫合および²光化学的に誘発された焦点梗塞)もまた使用されている。これらのモデルはMCAベースの脳卒中モデルと呼び、脳卒中および潜在的治療の根底にある病態生理学的メカニズムの調査に大きく貢献してきた。これらの実験モデル^33、44には制限がありますが、これらの方法は多くの実習^{5、66を使用}してきました。MCA ベースのストローク モデルは、前循環のストロークを表します。しかし、後部循環⁷の脳卒中を模倣したモデルを調査した報告はほとんどない。

前循環脳卒中と後循環ストローク⁸の間には、病因、メカニズム、臨床症状、予後の間に有意な差がある。したがって、前循環ストロークモデルから得られた結果は、後循環ストロークには適用できません。例えば、前循環のための再灌流時間は6時間に拡張され、研究のごく一部は画像発見⁹に基づいて24時間まで延長された。しかし、以前の報告¹⁰ と私たち自身の臨床経験によると、後部循環の時間枠は24時間よりも長いかもしれません。この細長い再灌流時間は、実験モデルでさらに研究し、確認されなければならない。

後循環脳卒中に関しては、ポンチン梗塞が最も一般的なサブタイプであり、虚血性脳卒中症例の7%を占める^11,12例。^11,梗塞地形によれば、ポンチン梗塞は、単離および非単離のポンチン梗塞¹³に分けられる。単離されたポンチン梗塞は、大動脈疾患(LAD)、バジル動脈枝疾患(BABD)、および小動脈疾患(SAD)の3つのタイプに分類される。ポンチン梗塞のメカニズム、症状、予後の知識は、症例¹⁴の臨床調査から導き出された。しかし、ポンチン梗塞を模倣したげっ歯類モデルはあまり調査されていない。

これまでの研究では、ポンを含むびまん性脳幹損傷が⁷を探求してきた。あるグループは、バジル動脈^(BA)15の結紮を介してポンチン梗塞モデルを作成しようとしました。別のグループは、10-0ナイロンモノフィラメント縫合糸を使用して、近位BAの4点を選択的に¹⁶に選択的にリゲートした。このモデルはLADを模倣するが、ほとんどのポンチン梗塞はBABDとSADから生じる。さらに、BAの選択的な結紮は複雑な手術であり、高い死亡率を有する。

ここでは、電気刺激による急性ポンチン梗塞の容易な再現と成功ラットモデルのための詳細なプロトコルが提供されています。

このプロトコルは、AAALACiの認定機関である広州医科大学第2付属病院の施設動物ケアおよび使用委員会によって審査され、承認されました。ラットは、南部医科大学の動物センターによって提供されました.

1. 動物

1. 250±10gの体重の成人オススプレイグ・ドーリーラットを使用してください。
2. 輸送時に、25°Cの周囲温度、相対湿度65%、および12時間/12時間の明暗サイクルで、制御された環境条件下で手術前に少なくとも1週間ラットを収容します。
3. 食べ物と水 のアドリビタムを提供します。

ポンの梗塞の確立

1. 手術前にラットを計量し、後述の行動検査(セクション3)に従って神経学的性能を評価する。
2. 麻酔の直前に加熱パッドを予熱します。
3. ステレオタックスフレームのホルダーに頭蓋骨ドリルを取り付けます。
4. 腹腔内に50mg/kgケタミンと5mg/kgキシラジンを注射する。つま先ピンチ応答の欠如を確認してください。
5. ラットを立体的な位置に立ち上げます。耳の棒を外耳道の上に置き、頭を固定します。注射の歪みを避けるために、頭蓋骨を水平に保つことを確認します。
6. イオブルラン(酸素100%、イオブルラン2.5%)によるインレットと出口ポートを備えたラットのステレオタキシックな鼻コーンアタッチメントにより麻酔を維持します。加熱パッドを使用して37°Cで温度を維持し、手順全体の温度を監視します。
7. 角膜乾燥を防ぐために目の軟膏を使用してください。鉗子を使用して足をわずかにつまんで、痛みの反応がないことを確認します。
8. マイクロシャバーで頭蓋骨の毛を剃ります。クロルヘキシジン外科スクラブを、外科的切開部位から始まり、外側に回転する円形の方法で塗布する。
9. 手術マーカーペンでマークする必要があります後部フォンタネルの後ろに0.5 cmに両側側カンサスのラインからメスで3cmの正中線切開を行います。
10. 綿棒を使って血液を取り除く。
11. 皮膚のフラップの両側に置かれた外科テープを置き、頭皮を露出させます(図1)。
12. 綿棒を0.9%NaClに浸して頭蓋骨から結合組織を静かに取り除きます。除去しないと、結合組織がドリルに巻き込まれる。
13. ブレグマを識別します。原点としてブレグマの中心点を選択し、細かい先端の黒い外科マーカーペンを使用してマークします。
14. ドリルを 6.0 mm AP、2.0 mm ML(0.5 ~3.0 mm、 図 2A)に配置します。
15. 自動ドリルを使用して開頭術(直径1mm)を行います。この点は静脈静脈に近いので、慎重に進んでください。
16. ステレオタキシック フレームからドリルを削除します。
17. 絶縁シースを備えた22Gプローブを立体フレームに配置します(図3A)。プローブの先端は、シースの近位端の上に2mm配置する必要があります(図3A,B;図 2B)。
18. シースが脳に入ることを確認 7 mm (7 mm DV,図 2B;図1C)。
19. プローブの先端が脳の表面から9mm下になるまで、シース(図1D)に沿ってプローブを進めます(図2D)。
20. 電極を電気刺激装置に接続します(図3C)。図 1Dに示すように、アノードをプローブに接続します。カソードをラット(通常はラットの耳)に接続します。
21. 電気刺激装置をオンにして、次のパラメータを設定します: 単一のパルス幅 = 4,050 ミリ秒;電圧 = 50 V;電流 = 4 mA (図 3C)。電気刺激の間に、ラットは震えが出る。本研究では、行動検査、MRI、およびTTCに使用される対照群ラットに対して、この装置はオンにされなかった。
22. 刺激後5分間、プローブをそのままにしておきます。
23. プローブを脳から取り出します(図1F)。
24. 骨セメントを使用して、頭蓋切除術をカバーします。創傷縫合前にセメントを乾燥させます。
25. 創傷を4-0ポリアミド縫合糸フィラメントで縫合する。3つまたは4つのスチの後、2-1-1標準的な外科結び目を結ぶ。
26. ラットにペニシリン(0.25 mL、80 IUを生理食塩水4 mLで希釈)を注射し、腹腔内に感染を予防します。
27. 2mg /kgの用量でメロキシカムで皮下注射し、24時間ごとにそれを繰り返します。
28. 完全に目を覚ますまで15分ごとにラットを監視し、加熱パッドでケージに戻します。犠牲になるまで食料と水への無料アクセスを提供します。
    注:すべての手順は、無菌手術の原則に従う必要があります。手術の前に、手の外科的スクラブの後にスクラブトップ、外科マスク、無菌手袋を着用してください。滅菌場内の無菌縫合糸材料を常に維持する。

3. 行動テスト

1. ロンガスコア¹⁷
   1. テーブルの表面にラットを置きます。
   2. 次のようにスコアを記録: 0 = 神経学的な欠陥なし;1 = 反側前足を完全に拡張する失敗, 軽度の焦点神経学的欠陥;2 = 左に回る、 中程度の焦点神経学的欠陥;3 = 左に落ちる、深刻な焦点赤字。4 = 自発的な歩行と意識の落ち込んだレベルはありません。
2. バーダーソンスコア¹⁸
   1. ネズミの尻尾を持ち、前肢をテーブルに手を伸ばします。スコアを次のように記録します: 0 = 両方の四肢がテーブルに到達しました。1 = 1 つの四肢だけがテーブルに到達します。
   2. 動物を粗い表面に置きます。次のようにスコアを記録: 0 = 押すと良好な抵抗で粗面に強い把握。1 = 1つの足にしか見られないわずかな抵抗。2 = 一方向に押し込んだ時の抵抗無し。
   3. ラトを囲まれた領域(18 in×36 in)に入れ、自由に歩き回るようにします。スコアを次のように記録します: 0 = 囲いの全長を回らずに歩きます。1 = 囲いの全長を回る。2 = 囲いの長さを歩くことはできませんが、円を描くことができます。3 = あまり動けません。各タスクの評価スコアの合計を最終評価スコアとして使用します。
3. バランスビーム試験¹⁹
   1. 装置が幅3cm、長さ70cmのビームで構成され、床面の上に20cmであることを確認してください。細い入り口を持つ梁の端に暗いボックスを配置します。
   2. ビームの始点にホワイトノイズ発生器と明るい光源を配置します。騒音と光は、ビームを横断し、ゴールボックスに入るためにラットを動機づけるために使用されました。
   3. 動物が暗くなった箱に入ったとき、刺激を終了します。ビームを通過する際の、ゴールボックスに到達するための待ち時間(秒単位)とラットの後肢のパフォーマンスを記録します。
   4. 各パフォーマンスのスコアを次のように記録します。1 = ビームの側を把握します。2 = ハグビームと1つの手足がビームから落ちる;3 = ハグビームと2つの手足がビームから落ちるか、>60 sの後にビーム上で回転します。4 = ビームのバランスを取ろうとしますが、>40 sの後に落ちる;5 = ビームのバランスを取ろうとしますが、>20 sの後に落ちる;6 = 落ちる、バランスを取ったり、<20 sの後にビームにハングアップしようとしません。
4. 粘着除去体性感覚試験²⁰
   1. ラットを透明なプレキシガラスボックスに入れ、2分または3分間新しい環境を探索できるようにします。
   2. 親指の上および手首の各前肢の内側の表面に直径10mmの緑色の接着剤ラベルを貼ります。
   3. ネズミをプレキシガラスボックスに戻します。
   4. ラットが最初のラベルと他のすべてのラベルを削除する時間をそれぞれ記録します。最大 3 分の間隔で指定します。テストはトレーニングで2倍に行う必要があります。
5. 四肢配置試験
   1. ラットを水平位置に保持し、動きを防ぎます。
   2. ラットがテーブル表面(受動的な四肢の動き)と接触しなくなると、触覚と下肢刺激をテーブルエッジで足に当てはめます。
   3. テーブルの端への足の配置(成功または失敗)を評価します。
   4. スコアを次のように記録します: 0 = 配置なし。0.5 = 未完成および/または遅延配置;1 = 即時および完全な配置。

4. MRIによる梗塞確認

1. 手術後24時間のMRIスキャンを行う。
2. イオブルラン(誘導の場合は5%、メンテナンスでは1%~1.5%)でラットを麻酔します。
3. ラットの脳アレイコイルにラットヘッドを固定し、送信専用ボリュームコイルと組み合わせます。
4. MRIスキャナーにコイルとラットを置きます。歯と耳の棒を使用して、クレードル内のラットを固定します。
5. 閉回路サーマルジャケットを使用したMRIスキャンの際は、体温を37°C±0.5°Cに保ちます。
6. 正しいジオメトリを確保するには、パイロット シーケンスを使用します。
7. 高速スピン エコー シーケンスを使用して T2 加重スキャンを収集します。繰り返し時間 (TR) = 8,000 ミリ秒;視野= 30ミリメートルx 30ミリメートル;集録マトリクス = 512 × 512;50スライス。厚さ0.4mm。
8. 4 ショットスピン エコー平面イメージング DWI スキャンを収集する: エコー時間 = 30.5 ミリ秒;繰り返し時間 = 8000 ミリ秒行列 = 96 × 96;視野 = 25ミリメートル×25ミリメートル;3 方向 = x、y、z;B値 = 0 1,000 s/mm² および 1,000 s/mm²50連続軸スライス;厚さ0.4mm。
9. ラットをケージに戻します。

5. TTC染色による梗塞確認

1. 実験計画に従って、時点でラットを犠牲にする。この実験では、手術後24時間ラットを屠殺した。
2. 犠牲の前に2%のTTC溶液を準備する。10 mL 0.01 M PBS(pH 7.4)に0.2 gのTTC粉末を加えます。銀紙で覆われた10cmの皿に希釈を移し、水浴で37°Cに予熱した。
3. 意識が失われるまでラットを5%のイオブルランに暴露する。次に、呼吸が止まるまでラットを_CO2(1 分当たりのケージの体積の20~30%)に曝し、2分の_CO2 露光を維持します。
4. 死を確認するために次の兆候を使用してください:胸の上昇と落下、触知可能な心拍なし、粘膜の色の悪さ、つま先のピンチ、色の変化または目の不透明度に対する応答はありません。
5. 子宮頸部脱臼を行う。
6. 無菌プラットフォーム上の足をテーピングすることによって、動物を固定します。鎖骨から低ガストリウムへの中線切開部を作成し、胸部に沿ってxiphoidから左への横切開を作成します。胸部に沿って横隔膜を切り取り、胸部中線切開を行い、心臓を露出させる。
7. 針の先端(27 G)を左心室の4°Cで0.01 M PBSを含む灌流ポンプに接続します。
   注: 心室の左端に沿って先端を進め、心房に入らないようにします。灌流ポンプをオンにして、先端が左心室にあることを確認し、右心房を切断します。流体が鼻孔から排出される場合、先端は心房にあり、調整または再挿入する必要があります。
8. 0.01 M PBSの約100mLを使用し、灌流のために4°Cで維持する。肝臓が白くなるまで灌流ポンプをオフにします。
9. ラットの首を切り落とし、はさみや鉗子を使って脳全体を解剖する。ブロッティングペーパーで脳表面から水を取り除きます。
10. 脳全体を-80°Cで1分間保存します(脳の切片は凍結後に簡単です)。
    注:脳のセクションを凍結せずにうまくカットすることができる場合、このステップはスキップすることができます。
11. 脳を後側を上にしてマトリックスに入れる。
12. 図1Gに示すように、脳の表面に穴を特定し、厚さ0.21mmのステンレス鋼を挿入します。通常、梗塞の最大領域は、プローブの平面にあります。したがって、この領域にはブレードを 1 つ挿入する必要があります。
13. 他のブレードを2mmの間隔で挿入します。
14. 同時に、すべてのブレードをマトリックスから一度に取り外し、皿の中のTTC溶液中のブレードで脳全体を置きます。ブレードを慎重に取り外します。
    注:ここでは、基礎クラニーのいくつかの残留ピアマーターが断面化を妨げたため、脳のセクションは液体から容易に取り除かれなかった。マトリックスにセクションが残っている場合は、小さなへらを使用して皿に移します。
15. 37 °Cの水浴にTTC溶液と脳のセクションで皿を置きます。
16. 皿を5分ごとにチェックし、セクションの重複がないことを確認してください。
17. 4%パラホルムアルデヒド溶液の10 mLを皿に加えてTTC反応を終了させます。
18. ローストラルから尾節の向きを決め、写真を撮ります。

6. 統計

1. 統計解析ソフトウェア(グラフパッドプリズムなど)を使用して、学生の t-testを実行します。
   注: すべてのデータは平均値 ± SE で表され、グループ間の差異は、両側のスチューデントの t検定 (統計的有意性として定義された p < 0.05) で決定されます。

6匹の動物が上述の手術プロトコルに供された。 図4 に示すように対照群は6匹のラットから構成された。 図4 に示す脳スライスは、1群につき1ラットから導出された。

MRIスキャンは、梗塞がポンに基づいて位置していることを示した(図4A)。プローブを中間線の左側に2mm注入したので、梗塞は横に位置していた。この梗塞は、患者における前方のポンチン梗塞を模倣する(図4A)。絶縁鞘が使用されたため、皮質、小脳、中脳を含むプローブの先端を越えて梗塞はなかった(図4A)。DWI画像は、急性ポンチン梗塞も明らかにした(図4A)。

TTC染色は、手術後24時間梗塞を確認するために使用した(図4A)。対照群と比較して、梗塞容積は有意に高かった(図4B)。

行動スコアは手術前後に測定した。手術前後の制御および不屈のモデル群のスコアを 表1 に示す。ポンチン梗塞用に設計された特定の行動検査の欠如のために、ロンガスコア、ベルダーソンスコア、およびバランスビームテストは、神経学的欠陥を評価するために使用されました。さらに、粘着除去体性感覚試験は、知覚運動機能を評価するとともに、四肢配置試験を評価して、プロプリオセプションを評価する。

対照群と比較して、ポンチン梗塞を有するラットは左に丸で囲んだ(図4A)。ロンガスコア(2.67 ± 0.52対0、p<0.05、図4C)、バーダーソンスコア(2.67 ±0.52対0、p<0.05、図4D)、四肢配置テスト(4.67 ±0.52対p 0、p< 0.05、図4E、ビームバランス試験スコア(118.33±2.66対10.17±1.47、p<0.05、図4F)、および粘着除去体性感覚試験スコア(2.33±0.52対12.0±0、p<0.0G、p 図4G)

図1:梗塞の確立 (A) 頭蓋骨に穴が開いた。(B)鞘が穴に移動する。(C)鞘の注射。(D) プローブの射出。(E) アノード(赤い矢印)が接続されています。(F) プローブが除去されます。(G)脳表面に残された穴(赤い矢印)。 このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。

図2:プローブの位置 (A) 立体的位置の概略図:矢印は皮膚フラップの引き込み、ブレグマの部位、ドリルの位置を指しています。(B)シースとプローブの模式図。(C)ポンに入れた鞘の先端の位置。(D)ポンに配置されたプローブの先端の位置。(E) 実験計画 このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。

図3:病変生産装置。 (A) 鞘とプローブの別々。(B) 鞘内のプローブ。(C)青い電極は、尾のプローブに接続されたアノードであった。赤い電極はカソードであった。(D) 電気刺激装置。(E) 手術器具。 このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。

図4:代表的な結果。(A)梗塞は、インビボでT2およびDWI配列を用いたMRIスキャンによって評価され、手術後24時間のインビトロでTTC染色によって確認された。右前方のポンに位置する急性ポンチン梗塞 (点線).行動検査は、ラットが病変の反対側に円を描くことを示した。(B) 梗塞の容積(C)ロングスコア。(D) ベダーソンスコア.(E)四肢配置試験。(F)バランスビーム歩行試験。(G)接着剤除去体性感覚試験。バーは平均値 ± SD(p < 0.05 と制御グループ) を表します。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。

図S1:ポンにおけるラクナー梗塞プローブ先端の長さが短くなっている。MRIスキャンは右のポンにラクナー梗塞を示す。(A) T2 イメージ。(B) DWI イメージ。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。

表1:行動スコア

利益相反はありません。