蛍光顕微鏡によるせん断流下の単分子の立体構造変化の特徴

Summary

マイクロ流体デバイス内の単一の高分子を固定化し、せん断流下での立体構造の変化を定量化するプロトコルを提示する。このプロトコルは、流れ環境におけるタンパク質やDNAなどの生体分子の生体力学的および機能的特性を特徴付けするのに役立ちます。

Abstract

機械的摂動下における単一分子挙動は、多くの生物学的プロセスを理解することが広く特徴付けられている。しかし、原子間力顕微鏡法は時間分解能が限られているのに対し、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は立体構造の推測しか認めることができない。一方、蛍光顕微鏡法は、様々な流れ条件下での単一分子のリアルタイム可視化を可能にする。我々のプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いて異なる剪断流環境下で単一の生体分子の立体構造変化を捉えるステップを記述する。剪断流はマイクロ流体チャネルの内部に作成され、シリンジポンプによって制御される。この方法のデモンストレーションとして、フォン・ヴィルブランド因子(VWF)とラムダDNAをビオチンとフルオロフォアで標識し、チャネル表面に固定化する。それらの立体構造は、全内部反射(TIRF)および共焦点蛍光顕微鏡を用いて可変剪断流下で連続的にモニタリングされる。VWFの可逆的な解明ダイナミクスは、その機能がヒト血液中でどのように調節されているかを理解するのに役立ちますが、ラムダDNAの立体構造は高分子の生物物理学に関する洞察を提供します。プロトコルはまた、様々な流れの条件でポリマー、特に生体高分子の挙動を研究し、複雑な流体の流動を調査するために広く適用することができる。

Introduction

生体分子が環境刺激にどう反応するかのメカニズムが広く研究されている。特に流れ環境では、せん断と伸びの力が、立体構造の変化を調節し、生体分子の機能を制御する可能性があります。代表的な例としては、ラムダDNAおよびフォン・ヴィルブランド因子(VWF)の剪断誘発解明が挙げられる。ラムダDNAは、個々の、柔軟なポリマー鎖の構造ダイナミクスとポリマー溶液^{1、2、3、4}の流動を理解するためのツールとして使用されている。VWFは異常な剪断速度および流れのパターンの血管の傷ついた場所で血小板を凝集する自然な流れセンサーである。VWFの解明は、A1ドメインへの血小板の結合とA3ドメインへのコラーゲン結合を活性化するために不可欠である。さらに、高剪断誘導A2ドメイン展開は、循環中の分子量分布を調節するVWFの切断を可能にする^5、6。したがって、これらの分子が流動下でどのように振る舞うかを直接視覚化することで、バイオメカニクスと機能に関する基本的な理解が大幅に高まり、新しい診断および治療用途が可能になります。

単一分子の立体構造を特徴付ける一般的な方法論には、光/磁気ピンセット、原子間力顕微鏡(AFM)および単分子フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)7が含まれる。単一分子力分光法は生体分子の立体構造変化に伴う力と運動を調べる強力なツールです。しかし、それは全体的な分子構造⁸をマッピングする能力を欠いている。AFMは、高い空間分解能でイメージングが可能であるが、時間分解能^9、10に制限されている。また、先端と試料との接触は、流れによって誘導される応答を混乱させる可能性がある。FRETやナノポア分析のような他の方法は、分子内距離と除外された体積の検出に基づいて、単一分子タンパク質の折りたたみおよび展開状態を決定します。しかし、これらの方法は、まだ初期段階にあり、単一分子立体構造^{11、12、13、14}の直接観察において制限されている。

一方、蛍光顕微鏡下で高い時間的および空間的分解能を有する高い時間的および空間的な高分子を直接観察することは、多くの生物学的プロセス^における単一分子ダイナミクスの理解を改善した^15,16。例えば、Fuら最近、初めてVWF伸長と血小板受容体結合の同時可視化を達成した。その研究では、VWF分子をビオチン-ストレプトアビジン相互作用を介して微小流体チャネルの表面に固定化し、様々な剪断流環境で全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡下で画像化した^17。Fuと同様の方法を用いて、ここでは、VWFとラムダDNAの立体構造をTIRFと共焦点蛍光顕微鏡の両方で直接観察できることを実証します。図1に示すように、マイクロ流体デバイスを使用してせん断流を作成および制御し、生体分子をチャネル表面に固定化します。せん断速度の変化を適用すると、同じ分子の立体構造が記録され、伸長長を測定し、図1にも示される。この方法は、レオロジー研究と生物学的研究の両方のために複雑な流れの環境下で他のポリマー挙動を探求するために広く適用することができる。

Protocol

1. VWF の準備

1. ヒトプラズマVWFを再構成し、標識反応のためにそれを調製する。100 μLの脱イオン(DI)水を100μgの凍結乾燥VWFに加え、1mg/mL VWFストック溶液を作成します。
2. ダイアレーズVWFストック溶液は、過剰グリシンを除去するために、ビオチンおよびフルオロフォア標識効率を高める。
   1. VWFストック液50μLを0.1mL透析ユニットに移し、10,000個の分子量カットオフを行い、キャップで密閉します。残りのストック液を-20 °Cに保存します。VWFの在庫は-20 °Cで最大1年間安定します。
   2. 1x滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の500mLで透析を実行し(0.01Mリン酸二ナトリウム、リン酸一酸化カリウム、0.0027M塩化カリウム、0.137M塩化ナトリウム、25°CでpH 7.4 at 25°C)を1時間遅く攪拌します。500 mLの新鮮なPBSを使用して、さらに1時間透析を繰り返します。
3. ビオチン標識反応を開始します。反応の直前にDI水に固体を溶解することにより、NHS-PEG4-ビオチンの2mM溶液を調製する。NHS-PEG_4-ビオチンが長期間水中にとどまることを可能にすると、NHSエステル群は加水分解し、それによって標識効率が低下する。
   1. VWFストック溶液を含む透析ユニットに2mM NHS-PEG_4-ビオチンの2.5 μLを加えます。これにより、VWFモノマーと比較して20倍のモル超過のビオチンが得られます。VWFの一次アミンはNHSエステル基と反応し、それによってアミド結合を介して_PEG4-ビオチン基に共有結合する。
   2. 透析ユニットを1.5mLマイクロ遠心チューブの内側に入れてください。透析ユニットを対応するキャップで密封します。パラフィルムでチューブ透析アセンブリを固定します。直立して、室温で40分間放置します。
4. 蛍光素標識反応を開始します。アレクサ488テトラフルオロフェニルエステル(TFPエステル)蛍光色素(励起_最高度=498nm、発光_最大=519nm)の2.8mM溶液をDI水中にフルオロフォア固体を溶解して調製する。反応の直前にこれを行い、TFP-エステル基が加水分解するのを防ぎます。
   1. 透析装置に2.8 mM 488フルオロフォアの2.9μLを加えます。これにより、VWFモノマーと比較して34倍のモル超過の蛍光色素が得られます。VWFの残りの一次アミンはTFPエステル基と反応し、それによってアミド結合を介して蛍光体に共有結合する。
   2. 透析ユニットに1M重炭酸ナトリウム(DI水に溶解)の2.0μLを加えます。これは、8.0に近い反応のpHを調整します, これは、TFPエステルと一次アミン反応の効率を増加させます.
   3. 透析ユニットは、ステップ 1.3.2 と同様にマイクロ遠心チューブに固定します。暗い所に保管して、光の漂白を防ぎ、室温で1時間30分放置します。
5. 透析ユニットを1x滅菌PBSの900mLに入れ、4°Cで一晩透析します。これは、0.71 mg/mLまたは2.84 μM(モノマー濃度)の濃度で標識されたVWFの約70 μLを生成します。
6. 標識されたVWFをマイクロ遠心管に移す。チューブをアルミ箔で覆い、光から保護します。4°Cで保管してください。長期保存の場合、0.02%(w/v)の最終濃度に抗菌剤アジドナトリウムを加えます。
   注: ここでプロトコルを一時停止できます。

2. ラムダDNAの準備

1. ビオチエン酸リニアラムダDNAは、その凝集末端部位(cos部位)を標準プロトコルに従ってビオチン-14-dCTPヌクレオチドで充填することにより、ここでステップ2.1¹⁸で繰り返される。残りのcos部位にdATP、dTTPおよびdGTPヌクレオチドを記入する。
   1. dATP、dTTP、dGTPおよびビオチン-14-dCTPの1mM溶液を10x反応バッファー(500mM塩化ナトリウム、100mMトリス塩酸塩、100mM塩化マグネシウム、10mMジチオトレイトール、25°CでpH 7.9)で調製する。
   2. 48 μL の 500 ng/μL ラムダ DNA を PCR チューブに入れ、65 °C で 5 分間加熱します。円形ラムダDNAのcos部位は熱の下で分離し、分子を直線化し、ビオチン化の準備ができている一本鎖の突出を作る。直後に氷の上に置き、コスサイトが再アニールするのを防ぎます。
   3. ラムダDNAに1mM dATP、dTTPおよびdGTPの5μLおよび1mMビオチン-14-dCTPの4 μLを加える。また、DNA合成を触媒するために、5 U/μLクレノウフラグメント(3'à5'exo-)の2.5μLを加えます。
   4. 37°Cで1時間反応混合物をインキュベートする。
   5. 0.5 M EDTA の 1.2 μL を追加します。次いで、70°Cで5分間反応混合物を加熱する。これはクレノウフラグメントとビオチン化反応を非アクティブ化します。
2. ラムダDNAから過剰なヌクレオチドを除去するには、10~70μLを保持でき、分子量6,000個のカットオフを有するスピンカラムを使用します。
   1. 柱を2mLマイクロ遠心チューブの内側に置きます。柱とチューブを1000 x gで2分間遠心分離します。
   2. ステップ 2.1.1 から同じ反応バッファーの 1x 溶液でカラムバッファーを交換します。これを行うには、500 μL の 1x バッファーをカラムに追加します。1000 x gで1分間の遠心分離機。フロースルーを破棄します。合計 1500 μL がカラムに追加されるように、さらに 2 回繰り返します。
   3. 柱を1.5mLマイクロ遠心チューブに入れる。ステップ 2.1.5 のソリューションを列の最上層に慎重に追加します。1000 x gで4分間の遠心分離機。
   4. マイクロ遠心チューブからフロースルー(40~70 μL)を集め、PCRチューブに入れます。これには、精製されたビオチン化ラムダDNAが含まれています。
3. 標識ラムダDNAを蛍光YOYO-1色素(励起_最大=490nm、発光_最大=509nm)を標準プロトコルに従って、ここで繰り返すステップ2.3.1^20。
   1. YOYO-1色素とラムダDNAの溶液を、塩基対モル比1:10の色素と共に調製する。ラムダDNAの塩基対濃度を計算する精製工程でDNAが失われなかったと仮定します。完全長ラムダDNAは48,502塩基対を有する。
      注:例えば、ステップ2.2.4から50μLの溶液を回収した場合、500μM YOYO-1色素の7.4μLを加えます。
   2. 溶液を暗闇の中で50°Cで2時間加熱して反応を完了させる。
   3. チューブをアルミ箔で覆い、光から保護します。4°Cで保管してください。このソリューションは、マイクロ流体デバイスに注入する準備が整いました。
      注: ここでプロトコルを一時停止できます。

3. シリコンウェーハでのマイクロ流体チャネル金型の作成

1. フォトリソグラフィを使用して、標準プロトコル¹⁹に従ってマスター シリコン ウェーハ上に適切な寸法 (図 2)を持つマイクロ流体チャネルを作成します。

4. ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体装置の製造

1. 5部シリコーンエラストマーベースを1部硬化剤(質量)に加えます。内容物を1分間十分かき混ぜ、硬化PDMS溶液を作成します。
2. プラスチック製のペトリ皿にマスターシリコンウエハを入れます。5 mmの層を作成するために、ウェーハの上にPDMS溶液を注ぎます。皿を覆い、空気泡を取り除くために1時間真空の下でデシケーターに残します。
3. インキュベートは、PDMSを柔軟な固体に治すために一晩60°Cでペトリ皿を覆った。硬化は、PDMS-ウェハー界面で PDMS に成形されたマイクロ流体チャネルになります。
4. カミソリを使用して、各マイクロ流体チャネルの周りにPDMSに20 x 10 mmの長方形をカットします。ピンセットを使用して、長方形の PDMS ブロックを取り外します。
5. エッジを鋭くした25Gの鈍い端針を使用して、チャネルの一端に直径0.5mmの穴を開け、穴がPDMSブロックを完全に通過することを確認します(図2)。薄い針を使ってPDMSを穴から抜き出します。チャネルの反対側でこれを繰り返します。これにより、チャネルを流れる流入口と出口が作成されます。
6. PDMSブロックの表面をビニールクリーンルームテープでクリーニングします。圧縮窒素ガスを1号機1/2号、22 x 50mmカバースリップで吹き飛ばして、デブリを除去します。
7. PDMS ブロックをチャネル側を上に、カバースリップをプラズマボンディングマシンのチャンバーに入れます。治療を開始します。
8. 治療が完了したら、チャネルがスリップに接触するように、PDMSブロックをカバースリップに素早く置きます。ブロックのエッジに沿って圧力を適用します。カバースリップPDMSアセンブリを115°Cのホットプレートに15分間置き、永久結合を補強します。
9. PDMSブロック上部の出口穴に、長さ10cm、内径0.25mmのチューブを挿入します。これにより、流体がチャネルから簡単に流出できます。これでデバイスが完成しました。

5. マイクロ流体デバイスの表面の処理

1. VWF実験用マイクロ流体装置の入口に、10 μg/mL ビオチン化ウシ血清アルブミン(BSA-ビオチン)を無菌1x PBSに溶解した10μg/mLの<10 μLを注入する。ラムダDNA実験のために1mg/mL BSA-ビオチンの<10 μLを注入する。注射後のピペットチップにBSA-ビオチンの数マイクロリットルを差し控え、チップが入り口に埋め込まれたままにします。
   1. 常に先端の周りにDI水の液滴を保ちます。これにより、気泡がチャネルに入るのを防ぎます。新しいソリューションがチャネルに注入されるたびにこの手法を適用します。
   2. BSA-ビオチンが2時間デバイス内でインキュベートできるようにします。BSAはカバースリップ面に特異的に結合しない(図3A)。
2. ピペットの先端を取り外します。チャネルに<10 μLのカゼイン遮断溶液を注入し、30分間インキュベートします。カゼインは自由な部位を遮断し、生体分子の表面への非特異的結合を減少させる(図3B)。
3. 先端を取り外し、滅菌1x PBSに溶解した10μg/mLストレプトアビジンの<10 μLをVWF実験用のチャネルに注入します。ラムダDNA実験には100 μg/mLストレプトアビジンを使用します。10分間インキュベートします。ストレプトアビジンはBSA-ビオチンのビオチン基に結合します(図3C)。
4. 先端を取り出し、1x洗剤溶液の<10 μL(PBSで0.05%Tween 20)をチャネルに注入して、余分なストレプトアビジンを洗い流します。
5. チップを取り出し、ステップ2.3.3から、カゼイン溶液またはラムダDNAで希釈した28.4 nM VWFの<10 μLを注入します。VWFを3分間インキュベートします。
6. 先端を取り出し、カゼイン溶液で希釈した5mMフリービオチンの<10 μLを注入します。遊離ビオチンはチャネル表面上の過剰なストレプトアビジン結合部位を遮断します(図3E)。

6. 蛍光顕微鏡によるVWFとラムダDNAの可視化

1. 2.2 mMプロトカテクチン酸と37 nMプロトカテキエート-3,4-ジオキシゲナーゼ(光滅を最小限に抑えるため)を用いてカゼインブロッキング溶液の1 mLを調製する。シリンジに積み込み、シリンジポンプで固定します。長さ30cm、内径0.25mmのチューブを取り、シリンジ針に一端を取り付けます。気泡を除去する溶液中の流れ。マイクロ流体デバイスの入口にチューブのもう一方の端を取り付けます。ステップ 5.6 の 3 分後に行うことをお勧めします。
2. 全内部反射(TIRF)または共焦点蛍光顕微鏡の最も高い倍率目標(すなわち、60-100X)を選択してください。必要に応じて、その目的に浸漬油のドロップを追加します。マイクロ流体デバイスを顕微鏡のステージに置き、カバースリップが目的と一緒に洗い流されるようにします。
3. 明視野顕微鏡を開始します。デブリや気泡などのフィーチャが表示されるように、フォーカスを調整します。次に、マイクロ流体チャネルのエッジが可視になり、フレームを二分化するまで、ステージを X 方向と Y 方向に調整します。
4. 488 チャンネル(FITC)に切り替えます。個々の緑、球状分子が区別できるまで、必要に応じてZレベルおよびTIRF角度を調整します。これらは、VWFまたはラムダDNA分子のいずれかである。
5. 露光時間とレーザー強度を調整して、蛍光分子をあまりにも早く光色化することなく可視化します。また、より明確に分子を視覚化するためにコントラストを調整します。
6. シリンジポンプから流れを開始し、カゼインブロッキング溶液がチャネルに流れ込み、出口から出るようにします。ステップ 5.6 のちょうど 5 分後にこの操作を行います。分子の立体構造の変化を観察するために流れを停止し開始する。流れを適用する場合、5,000~30,000 μL/hの間の速度を使用します。このプロセスを続行して、流れを停止および開始する複数のサイクルで伸び、リラックスできる分子を見つけます。
7. 分子が最大伸長に達し、完全に球状にリラックスするのにかかる時間に注意してください。せん断流下の分子の連続挙動のビデオを録画し、最高の露出時間、露出頻度、ビデオの持続時間を選択し、拡張行動の全範囲をキャプチャし、フォトブリーチを最小限に抑えます。
8. ビデオを として保存します。スケールバーを持つAVIファイル。
   注: ここでプロトコルを一時停止できます。

7. 立体構造変化の画像解析

1. 長方形のマイクロ流体流路の流量 ( Q ) と高さ (h) と幅 (w) を使用して、高さ(Q)に適用される壁せん断速度 ( ) を計算します。次の式を使用してこれを行います。
   
2. カスタマイズされた MATLAB コードを使用して、さまざまなせん断速度での生体分子の長さを決定します (補足ファイルを参照)。次の MATLAB コードを含むビデオ分析というタイトルのフォルダーを作成します: main.m, save_each_frame.m, get_length.mとget_length.fig.ビデオ分析のタイトル付きビデオ内にサブフォルダを作成し、追加します。それに解析されるAVIファイル。
3. MATLAB 2019a を使用してmain.mを開き、コードを実行します。コマンド ウィンドウの [分析するデータ ファイルを入力してください] の下に、分析するビデオ ファイルの名前を入力します。
4. 開いているグラフィカルユーザーインタフェース(GUI)で、しきい値(ウィンドウ右上のボックス内のテキスト)を20に設定し、[しきい値の設定]ボタンをクリックして確認します。
5. ウィンドウの上部のツールバーにあるデータカーソルを使用して、スケールバー上の任意の場所で 1 ピクセルを選択します。ウィンドウの右側にある[縮尺] セクションで [開始点] をクリックします。選択したピクセルの(x,y)位置がボタンの右側に表示されます。ピクセルサイズ(μm)ボタンをクリックします。ピクセル サイズは、各ビデオで 1 回だけ測定する必要があります。
6. 目的の分子上の任意のピクセルを選択します。VWFセクションの開始ポイントをクリックします。選択したピクセルの位置が右側のテキストボックスに表示されたら、画像の分子長さを取得するために、左端、右端、文字列の長さをクリックします。
   注: このステップは、コードがVWFという特定のセクションを持っているにもかかわらず、生体分子の立体構造の変化を分析するために使用できます。
7. 分子の左端と右端を再確認します。データ カーソルを拡大して使用して、目的のピクセル位置を確認します。手動でピクセルを終わりとして選択し、必要に応じて長さ (ピクセル単位) を再計算します。
8. ピクセルサイズをμm単位、文字列長をピクセル数でExcelシートに記録し、文字列の長さをμmで計算します。
9. すべての画像について上記の手順を繰り返します。GUI の右下隅にあるLastボタン、次へボタンを使用して、同じビデオ ファイル内の画像を切り替えます。[閉じる]をクリックして GUI ウィンドウを閉じます。

Results

VWFやラムダDNAなどの生体分子の動的挙動を観察することは、デバイス表面への結合を最適化することに大きく依存しています。マイクロ流体デバイスの推奨時間に対する表面処理のインキュベートは、いくつかのアンカレッジポイントとの結合を得るために重要であり、分子が流れの変化に伴って自由に伸びてリラックスできるようにします。タンパク質またはDNAが複数のリンケージと強く結合しすぎると、限られた長さにまで伸びるか、まったく伸びないかのどちらかになります。これは、特にVWFがフリービオチンブロッキングの前に3分以上デバイス表面に流れずに残っている場合に発生します。VWFが表面に停滞している時間が長ければ長いほど、VWFビオチン群が表面ストレプトアビジン群に結合し、分子が解明する柔軟性が低くなります。分子が弱く結合しすぎると、流れに際して切り離され、視界から消えます。これは、VWFまたはラムダDNAがあまりにも短い期間インキュベートされ、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用が形成されない場合に発生する可能性があります。分子は、非常に高いせん断速度(>200,000 s^-1)が適用されると、ビオチンとストレプトアビジンの相互作...

Discussion

この方法で説明したように蛍光顕微鏡を用いて単分子の立体構造変化の高品質なデータを得るためには、適切な時間のために分子をインキュベートし、表面との非特異的相互作用を最小限に抑えることが重要であるそして、フォトブリーチを減らす顕微鏡の設定を確立します。この分子が自由に立体構造を変化させる能力は、分子と表面の間に形成されるビオチン-ストレプトアビジン相互作用の数に関連している。前述のように、これは適切な時間の流れなしに分子をインキュベートすることによって制御されなければならない。さらに、タンパク質またはDNAは、カバースリップが効果的に遮断されない場合、カバースリップに非特異的に結合する可能性がある。推奨ブロッキング溶液がなければ、分子はガラスに非特異的に付着し、適用される流量に反応しない可能性があります。早期表面処理時にカゼインブロックを適用し、流れの間にその存在を維持することは、これらの非特異的相互作用を低減するために不可欠である。最後に、単一分子の連続的で動的な挙動を捕捉するには、画像キャプチャ中に頻繁に蛍光素素興奮が必要です。レーザー強度、露光時間、露光周波数が高すぎると、急速な光の色素化が発生する可能性があります。したがって、これら...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 ラベリングキット	Invitrogen	A30006
Bio-Spin P-6 ゲルカラム	Bio-Rad	7326221
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501	ステップ5.6で遊離ビオチンとして使用
Biotin-14-dCTP	AAT Bioquest	17019
BSA-Biotin	Sigma-Aldrich	A8549
Coverslips	VWR	48393-195	No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP Set	Invitrogen	10297018
Float Buoys for Mini Dialysis Device	Thermo Scientific	69588
Klenow Fragment (3'→5' exo-)	New England BioLabs	M0212S	ステップ 2.1.1 の 10X 反応バッファーとステップ 2.2.2
ラムダ DNA	ニューイングランド バイオラボ	N3011S
ミニ透析装置	Thermo Scientific	69570	10K MWCO、0.1 mL
容量 NEBuffer 4	ニューイングランド バイオラボ	B7004S
NHS-PEG4-ビオチン	サーモサイエンティフィック	21330
プロトカテキエート 3,4-ジオキシゲナーゼ	Sigma-Aldrich	P8279
プロトカテク酸	サンタクルス バイオテクノロジー	sc-205818
PDMS 製造用シリコーン エラストマー キット	ダウ ケミカル カンパニー	4019862
ストレプトアビジン	Sigma-Aldrich	85878
ブロッキング ソリューション	CANDOR バイオサイエンス	110 050	カゼインブロッキングソリューションとして使用
プロトコル ビニール クリーンルームテープ	フィッシャーサイエンティフィック	19-120-3217
フォン Willebrand 因子、ヒトプラズマ	ミリポア シグマ	681300
YOYO-1 染料	AAT Bioquest	17580
0.25 mm 内径チューブ	コールパーマー	EW-06419-00
25 ゲージ針	トーマス・サイエンティフィック	・JG2505X