Method Article

蛍光顕微鏡によるせん断流下の単分子の立体構造変化の特徴

DOI:

10.3791/60784

⸱

January 25th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マイクロ流体デバイス内の単一の高分子を固定化し、せん断流下での立体構造の変化を定量化するプロトコルを提示する。このプロトコルは、流れ環境におけるタンパク質やDNAなどの生体分子の生体力学的および機能的特性を特徴付けするのに役立ちます。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

機械的摂動下における単一分子挙動は、多くの生物学的プロセスを理解することが広く特徴付けられている。しかし、原子間力顕微鏡法は時間分解能が限られているのに対し、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は立体構造の推測しか認めることができない。一方、蛍光顕微鏡法は、様々な流れ条件下での単一分子のリアルタイム可視化を可能にする。我々のプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いて異なる剪断流環境下で単一の生体分子の立体構造変化を捉えるステップを記述する。剪断流はマイクロ流体チャネルの内部に作成され、シリンジポンプによって制御される。この方法のデモンストレーションとして、フォン・ヴィルブランド因子(VWF)とラムダDNAをビオチンとフルオロフォアで標識し、チャネル表面に固定化する。それらの立体構造は、全内部反射(TIRF)および共焦点蛍光顕微鏡を用いて可変剪断流下で連続的にモニタリングされる。VWFの可逆的な解明ダイナミクスは、その機能がヒト血液中でどのように調節されているかを理解するのに役立ちますが、ラムダDNAの立体構造は高分子の生物物理学に関する洞察を提供します。プロトコルはまた、様々な流れの条件でポリマー、特に生体高分子の挙動を研究し、複雑な流体の流動を調査するために広く適用することができる。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生体分子が環境刺激にどう反応するかのメカニズムが広く研究されている。特に流れ環境では、せん断と伸びの力が、立体構造の変化を調節し、生体分子の機能を制御する可能性があります。代表的な例としては、ラムダDNAおよびフォン・ヴィルブランド因子(VWF)の剪断誘発解明が挙げられる。ラムダDNAは、個々の、柔軟なポリマー鎖の構造ダイナミクスとポリマー溶液1、2、3、4の流動を理解するためのツールとして使用されている。VWFは異常な剪断速度および流れのパターンの血管の傷ついた場所で血小板を凝集する自然な流れセンサーである。VWFの解明は、A1ドメインへの血小板の結合とA3ドメインへのコラーゲン結合を活性化するために不可欠である。さらに、高剪断誘導A2ドメイン展開は、循環中の分子量分布を調節するVWFの切断を可能にする5、6。したがって、これらの分子が流動下でどのように振る舞うかを直接視覚化することで、バイオメカニクスと機能に関する基本的な理解が大幅に高まり、新しい診断および治療用途が可能になります。

単一分子の立体構造....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. VWF の準備

  1. ヒトプラズマVWFを再構成し、標識反応のためにそれを調製する。100 μLの脱イオン(DI)水を100μgの凍結乾燥VWFに加え、1mg/mL VWFストック溶液を作成します。
  2. ダイアレーズVWFストック溶液は、過剰グリシンを除去するために、ビオチンおよびフルオロフォア標識効率を高める。
    1. VWFストック液50μLを0.1mL透析ユニットに移し、10,000個の分子量カットオフを行い、キャップで密閉します。残りのストック液を-20 °Cに保存します。VWFの在庫は-20 °Cで最大1年間安定します。
    2. 1x滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の500mLで透析を実行し(0.01Mリン酸二ナトリウム、リン酸一酸化カリウム、0.0027M塩化カリウム、0.137M塩化ナトリウム、25°CでpH 7.4 at 25°C)を1時間遅く攪拌します。500 mLの新鮮なPBSを使用して、さらに1時間透析を繰り返します。
  3. ビオチン標識反応を開始します。反応の直前にDI水に固体を溶解することにより、NHS-PEG4-ビオチンの2mM溶液を調製する。NHS-PEG4-ビオチンが長期間水中にとどまることを可能にすると、NHSエステル群は加水分解し、それによって標識効率が低下する。
    1. VWFストック溶液を含む透析ユニットに2mM NHS-PEG4-....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VWFやラムダDNAなどの生体分子の動的挙動を観察することは、デバイス表面への結合を最適化することに大きく依存しています。マイクロ流体デバイスの推奨時間に対する表面処理のインキュベートは、いくつかのアンカレッジポイントとの結合を得るために重要であり、分子が流れの変化に伴って自由に伸びてリラックスできるようにします。タンパク質またはDNAが複数のリンケージと強く結合しすぎると、限られた長さにまで伸びるか、まったく伸びないかのどちらかになります。これは、特にVWFがフリービオチンブロッキングの前に3分以上デバイス表面に流れずに残っている場合に発生します。VWFが表面に停滞している時間が長ければ長いほど、VWFビオチン群が表面ストレプトアビジン群に結合し、分子が解明する柔軟性が低くなります。分子が弱く結合しすぎると、流れに際して切り離され、視界から消えます。これは、VWFまたはラムダDNAがあまりにも短い期間インキュベートされ、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用が形成されない場合に発生する可能性があります。分子は、非常に高いせん断速度(>200,000 s-1)が適用されると、ビオチンとストレプトアビジンの相互作.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この方法で説明したように蛍光顕微鏡を用いて単分子の立体構造変化の高品質なデータを得るためには、適切な時間のために分子をインキュベートし、表面との非特異的相互作用を最小限に抑えることが重要であるそして、フォトブリーチを減らす顕微鏡の設定を確立します。この分子が自由に立体構造を変化させる能力は、分子と表面の間に形成されるビオチン-ストレプトアビジン相互作用の数に関連している。前述のように、これは適切な時間の流れなしに分子をインキュベートすることによって制御されなければならない。さらに、タンパク質またはDNAは、カバースリップが効果的に遮断されない場合、カバースリップに非特異的に結合する可能性がある。推奨ブロッキング溶液がなければ、分子はガラスに非特異的に付着し、適用される流量に反応しない可能性があります。早期表面処理時にカゼインブロックを適用し、流れの間にその存在を維持することは、これらの非特異的相互作用を低減するために不可欠である。最後に、単一分子の連続的で動的な挙動を捕捉するには、画像キャプチャ中に頻繁に蛍光素素興奮が必要です。レーザー強度、露光時間、露光周波数が高すぎると、急速な光の色素化が発生する可能性があります。したがって、これら.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは競合する利益を宣言していない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、国立科学財団助成金DMS-1463234、国立衛生研究所助成金HL082808とAI133634、リーハイ大学の内部資金によって部分的にサポートされました。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 ラベリングキットInvitrogenA30006
Bio-Spin P-6 ゲルカラムBio-Rad7326221
BiotinSigma-AldrichB4501ステップ5.6で遊離ビオチンとして使用
Biotin-14-dCTPAAT Bioquest17019
BSA-BiotinSigma-AldrichA8549
CoverslipsVWR48393-195No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP SetInvitrogen10297018
Float Buoys for Mini Dialysis DeviceThermo Scientific69588
Klenow Fragment (3'→5' exo-)New England BioLabsM0212Sステップ 2.1.1 の 10X 反応バッファーとステップ 2.2.2
ラムダ DNAニューイングランド バイオラボN3011S
ミニ透析装置Thermo Scientific6957010K MWCO、0.1 mL
容量 NEBuffer 4ニューイングランド バイオラボB7004S
NHS-PEG4-ビオチンサーモサイエンティフィック21330
プロトカテキエート 3,4-ジオキシゲナーゼSigma-AldrichP8279
プロトカテク酸サンタクルス バイオテクノロジーsc-205818
PDMS 製造用シリコーン エラストマー キットダウ ケミカル カンパニー4019862
ストレプトアビジンSigma-Aldrich85878
ブロッキング ソリューションCANDOR バイオサイエンス110 050カゼインブロッキングソリューションとして使用
プロトコル ビニール クリーンルームテープフィッシャーサイエンティフィック19-120-3217
フォン Willebrand 因子、ヒトプラズマミリポア シグマ681300
YOYO-1 染料AAT Bioquest17580
0.25 mm 内径チューブコールパーマーEW-06419-00
25 ゲージ針トーマス・サイエンティフィック・JG2505X

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
  2. Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
  3. LeDuc, P., Haber, C.,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyShear FlowSingle MoleculeMicrofluidic ChannelsTotal Internal ReflectionConfocal MicroscopyVon Willebrand FactorLambda DNABiotin StreptavidinSyringe Pump

Related Articles