長期経過イメージング用のショウジョウバエ幼虫の取り付け方法

タイムラプスライブイメージングは、動的細胞プロセスを研究するための強力な方法です。タイムラプス映画によって提供される空間的および時間的情報は、細胞生物学の質問に答えるために重要な詳細を明らかにすることができます。ショウジョウバエ幼虫は、その透明な体壁が内部構造^1、2の非侵襲的なイメージングを可能にするので、ライブイメージングを使用した調査のための人気のインビボモデルとなっています。さらに、ショウジョウバエでは解剖学的構造および高分子を蛍光標識する多数の遺伝的ツールが利用可能である^。しかし、ショウジョウバエ幼虫の長期経過画像化は困難である。静止した初期胚や子犬とは異なり、ショウジョウバエ幼虫は絶えず動き、ライブイメージングのために固定化が必要である。生きたショウジョウバエ幼虫を固定化する有効な方法は、クロロホルム⁴でハロカーボン油に取り付けること、イソフルランまたはジクロルボス溶液⁵を用いた麻酔、およびカバースリップと顕微鏡スライド⁶との間の圧縮を含む。これらの方法のいくつかは顕微鏡検査に使用されてきたが、いずれも長期のライブイメージングに有効ではない。他の方法は、従来の共焦点顕微鏡または光シート顕微鏡^7、8、9を用いて幼虫をクロールする際の身体壁ニューロンのイメージングのために開発された。しかし、これらの方法は、幼虫の動きによる細胞動態のモニタリングには理想的ではありません。

ショウジョウバエ幼虫の長期経過画像化を達成するための新しい方法が開発されました。ポリジメチルシロキサン(PDMS)の「幼虫チップ」を使用すると、ショウジョウバエ幼虫は麻酔なしで特殊なマイクロチャンバーで真空発生吸引を通して効果的に固定化することができる。しかし、この方法は、細胞生物学の研究のための高い時間分解能を提供していないし、それは動物のサイズ¹⁰に厳しい制限を有する。麻酔装置を用いた別の方法は、ショウジョウバエ幼虫のライブイメージングを複数の時点で達成し、神経筋接合部^{11、12、13、14、15、16}の研究に応用されている。しかしながら、この方法は、30分を超える連続イメージングを可能にせず、デスフルランを繰り返し使用する必要があり、これは神経活動を阻害し、研究された生物学的プロセスに影響を及ぼす可能性がある^17,18である。近年、微小流体装置と凍結麻酔を組み合わせた新しい方法が、短時間(分⁾¹⁹の間、様々なサイズの幼虫を固定化するために使用されている。しかし、この方法は、冷却システムなどの特殊なデバイスを必要とし、固定化の長い期間は、幼虫の繰り返し冷却を必要とします。

ここでは、10時間以上の時間経過画像化と互換性のあるショウジョウバエ幼虫を固定化する汎用性の高い方法を紹介します。この方法は「部分的な取り付けによる幼虫の安定化」(LarvaSPA)と呼び、幼虫のキューティクルをカスタムメイドのイメージングチャンバーでのイメージング用のカバースリップに付着することを含む。このプロトコルは、イメージングチャンバーを作る方法と、様々な発達段階で幼虫を取り付ける方法を説明します。LarvaSPA法では、UV反応性接着剤を使用して、所望のボディセグメントをカバースリップに貼り付けます。PDMS立方体はさらに幼虫に圧力をかけ、脱出を防ぐ。撮像チャンバー内の空気と水分は、イメージング中に部分的に固定化された幼虫の生存を保証します。他の技術よりもLarvaSPAの利点は次のとおりです:(1)それは高い時間的および空間的解像度で何時間も無傷のショウジョウバエ幼虫の連続的なライブイメージングを可能にする最初の方法です。(2)この方法は幼虫のサイズに対する制限が少ない。(3)イメージングチャンバーとPDMS立方体は、最小限のコストで製造することができ、再利用可能です。

幼虫の取り付け方法を説明することに加えて、ショウジョウバエ樹状樹状樹状樹状(da)ニューロンの樹状突起発生および樹状変性を研究するためのその応用例をいくつか紹介する。

1. イメージングチャンバーの作成

1. 金属フレームは、典型的な機械工場のアルミニウムブロックから構築することができます。フレームの仕様を図 1A に示します。
2. イメージングチャンバーを構築するには、長いカバースリップ(22mm×50mm)とUV接着剤(図1A)を使用して金属フレームの底部を密封します。手持ち型のUVランプを使用してUV接着剤を硬化させる。

2. PDMSの立方体を作る

1. PDMS立方体の金型を準備します。
   1. 長方形(80mm×55mm)のペトリ皿または丸い細胞培養板の内面に包装テープの層を取り付けます。2番目のインスター幼虫には1層(厚さ0.063mm)、3番目の星内幼虫には2層(厚さ0.126mm)、後期3番目の星幼虫には3層(0.189mm厚)を使用します(図1B)。
   2. カミソリの刃でテープを特定の幅のストリップに切ります:1層テープの場合は1.5 mm、2層または3層テープの場合は2 mmです。ストリップの幅と厚さは、最終的なPDMS立方体が保持できる幼虫の大きさを決定します。2つのストリップの間に少なくとも5つのmmのスペースを残します。スペースを覆うテープ層を取り外します (図 1B)。
   3. 粘着テープを使用してプレートの内面からほこりを除去します。金型は使用できる状態です。
2. PDMS ミックスを準備します。
   1. PDMSベース7gと0.7gの硬化剤(10:1比)を小さな容器に完全に混ぜます。
   2. 容器を真空デシケーターに少なくとも15分間入れ、混合物から空気を取り除きます。
   3. PDMS混合物を約5.5gゆっくりと金型に注ぎ、厚さ1~2mmに達します(図1B)。
   4. PDMS混合物を少なくとも15分間真空乾燥器に再び入れ、混合物から残った気泡を除去する。ピペットチップで最後のいくつかの泡を破ります。
   5. 65 °Cの熱インキュベーターで平らな表面でPDMSを2時間硬化させます。
   6. カミソリの刃を使用して、金型の端に沿って硬化PDMSを緩め、金型から取り外します。PDMS を室温で 2 枚の大きな粘着テープの間に保管します。
   7. 初期と後期の第3インスター幼虫の場合、PDMSを8mm x 2mm x 1mmの立方体に切り取り(図1Bの点線に沿って)、テープストリップ(ステップ2.1.2)によって作成された溝を立方体の長辺の中心に配置します(図1B,C)。2番目の星の幼虫の場合は、立方体を8mm x 1mm x 1mmに切ります。

3. 長期経過イメージングのための幼虫の取り付け

1. 取り付け用の上部カバースリップを準備します。
   1. 幼虫の大きさに合った溝を持つ6つのPDMS立方体を選択してください。ステップ 2.1.1、2.1.2、および 2.2.7 に基づいて、推奨される PDMS の溝とサイズに従ってください。
   2. 粘着テープでPDMSの表面からほこりを取り除きます。
   3. PDMS立方体を後で固定するために、長いカバースリップ(22 mm x 50 mm)に両面テープ(12 mm x 5mm)を4枚取り付けます。両面テープの 2 つの部分の間のスペースは、PDMS 溝の幅と同じにする必要があります。
   4. 各PDMS立方体の溝にUV接着剤の小さな滴(〜1.2 μL)を適用し、カバースリップの両面テープ間のスペースにUV接着剤の6つの小さな滴を追加します。
2. 幼虫を取り付ける準備をします。
   1. 一対の鉗子を使用して、幼虫を水できれいにして、体表面から食べ物を取り除きます。
   2. 蓋をしない小さな(35mm)ペトリ皿に湿らせたティッシュペーパーの小片にきれいな幼虫を置きます。小さなペトリ皿を、乾燥したティッシュペーパーを入れた大きな(60mm)のペトリ皿に入れます。化学フードで、プラスチック製の移入ピペットを使用して、8~12滴のイソファフルラン(160~240 μL)をドライティッシュペーパーに塗布し、大きなペトリ皿の蓋を閉めます。
   3. 幼虫を監視しながら2~3分待ちます。口のフックが動かなくなったら、大きなペトリ皿から幼虫を取り出します。
3. 動物をマウントします。
   1. 動物の後側の構造を画像化するには、カバースリップの両面テープの間のUV接着剤の上に固定された幼虫を置き、後方のキューティクルをカバースリップに向けます。
   2. 各幼虫をPDMSブロックで覆い、幼虫の幹をPDMSの溝に収めます。PDMSの溝の外に幼虫の頭と尾を残します。接着剤で幼虫の尖塔をふさぐのは避けてください。
   3. PDMSブロックの端を溝に力を加えずに両面テープに押し込みます。幼虫の尾をそっと引っ張ってPDMSの下のキューティクルを平らにします。
   4. 高い設定(約0.07 mW/mm²⁾で手持ち式のUVランプを使用して、UV接着剤を4分間硬化します。
      注意: UVランプを使用している間、安全メガネで目を保護してください。
   5. カバースリップを上下逆にして、手順 3.3.4 を繰り返します。
   6. レンズ紙(15mm×30mm)を20μL~30μLの水で湿らせた。湿ったレンズ用紙を撮像室の底部に置きます(図1A,D)。
   7. 幼虫がチャンバーの内側に面するように、カバースリップをチャンバーに置きます。UV接着剤(図1A、D)を使用して、カバースリップの両端を金属表面に接着します。幼虫の側側は共焦点顕微鏡下でイメージングの準備ができています (図 1E)。

4. イメージング

1. 適切な顕微鏡による幼虫の画像。このプロトコル (図 2、図 3、 ビデオS2、ビデオ S3、ビデオ S4) に示されているすべての結果は、40 x (1.30 NA) オイルの目的を持つ共焦点システムを使用して取得されました。

5. イメージングチャンバーとPDMS立方体の回収

1. 画像化後、レンズ用紙を使用して上部のカバースリップのオイルを取り除きます。カバースリップとカミソリの刃で金属フレームの間のスペースに切り込んで、トップカバースリップを金属フレームから取り外します。イメージングチャンバーは再利用の準備ができています。
2. PDMSの立方体を、上のカバースリップから鉗子で取り外します。粘着性のテープにPDMS立方体を転がして、接着剤の残留物やほこりを取り除きます。PDMSの立方体は再使用の準備ができている。

幼虫のイメージ投射室は、カスタムメイドの金属フレームと2つのカバースリップを一緒に接着することによって構築されます。金属フレームの設計は、図1Aに指定されています。チャンバー内のショウジョウバエ幼虫は、UV接着剤とPDMS立方体の助けを借りてトップカバースリップに接着されます。PDMS立方体の溝と、立方体が取り付けられた両面テープは、幼虫を保持するスペースを作り出す(図1B、C)。PDMSはまた幼虫の体壁を平らにし、物理的に幼虫の動きを制限するために穏やかな圧力を加える。最後に、湿ったレンズ紙の小片は湿気を提供するために部屋の底に置かれる。このセットアップは連続的なイメージ投射のために10時間より長くショウジョウバエの幼虫を固定化できる。動物のほとんどは10時間後に生きており、膿期に成長するために回復することができる。撮像室は、一度に9匹までの幼虫を収容することができる。図1Dは、チャンバーに搭載された6つの後期第3の星内幼虫を示す。幼虫の幹は固定され、頭と尾は自由に動くことができます(図1EおよびビデオS1)。この方法は、最大15時間の連続高解像度イメージングで第3のインスター幼虫をさまよう第2のインスターを撮影するために成功しました。チャンバは直立顕微鏡を使用してイメージングのために設計されているが、セットアップは、単にチャンバーを反転させることによって、反転顕微鏡のためにも動作します。

ここでは、クラスIV da(C4 da)ニューロンをモデルとして使用して、神経樹状突起ダイナミクスと樹状変性を研究するLarvaSPAの応用をモデルとして示します(図2、図3、ビデオS2-S4)。C4 daニューロンは、幼虫の体壁に位置する体性感覚性ノシセプターであり、その樹状突起は幼虫表皮1、20、21、22を内膜する。C4ダデンドライトは幼虫の発達を通して非常に動的な成長行動を示し、その結果、体表面または空間充填23の完全なカバレッジをもたらす。C4daニューロンはまた、正常に24、25、26、27の物理的損傷後の樹状変性および再生の研究に使用されています。

デンドライトダイナミクスのイメージングでは、第2のインスターでの産卵後48時間(AEL)から放浪中の第3のインスターでの120時間AELまでの範囲の幼虫を、ポイントスキャン共焦点顕微鏡を用いたタイムラプスイメージングのためにイメージングチャンバーに取り付けた。タイムラプス映画は、ppk-CD4-tdTomまたはPpk-Gal4によって駆動されるUAS-CD4-tdTomによってラベル付けされたC4 daデンドライトの成長行動をキャプチャするために3分間隔で撮影されました 6 .イメージング期間(最大12時間)を通じて、C4 daニューロンの高次樹状枝は、拡張、引き込み、分岐形成、および枝切除(図2A-2F)を含む複雑な成長行動を示し、ニューロンの健康状態を示す。私たちの映画はまた、他のデンドライトに接触した後にデンドライト先端が後退したホモタイピックデンドロデンドライト反発を捉えました(図2F)。全体として、これらの結果は、LarvaSPAを用いたタイムラプスイメージングが神経発達の研究に有効であることを示している。

デンドライト変性を画像化するために、MaiTaiレーザーを使用してC4 da神経細胞の近くの一次樹状突起を切断しました。幼虫を回収し、損傷後1.5時間(AI)から始まるイメージングのためにチャンバーに取り付けた(図3、ビデオS4)。映画は、樹状の腫れ、樹状の断片化、樹状の破片のクリアランスなど、樹状変性の間に重要な出来事を記録しました。同じ実験において、幼虫脂肪体はまた、アネキシンV−GFP(AV−GFP)を分泌するように設計され、細胞表面27に外的に付けられたホスファチジルセリン(PS)を標識するセンサーである。我々は、AV−GFPによる変性樹状突起の特異的標識を観察した(図3)、PSが退化デンドライトの表面に露出し、貪食細胞症27によるその後のクリアランスのためのイートミーシグナルとして機能することを示唆した。

図1:LarvaSPAマウント用のイメージングチャンバー。(A) 詳細な仕様を持つ画像室の図で、上部図と側面図の両方を示します。上部図の水色のシェーディングは、湿ったレンズ用紙を示しています。チャンバーは、上部カバースリップと底部カバースリップによって密封されています。取り付けられた幼虫の位置が例示される。(B) PDMSの金型(上図)とPDMS混合物(側面図)で充填した後の金型の図。グレーのストリップは、それぞれ 2 つの 1 層、2 つの 2 層、および 2 つの 3 層テープ ストリップを示します。側面図の黄色のシェーディングは、金型内の PDMS 混合物を示します。点線は、硬化したPDMSをカットする場所を示します。図の側面図は、拡大縮小に描画されません。(C) PDMS立方体の上図と側面図を示す写真。スケールバー=1mm(D)取り付け前の撮像チャンバーを示す写真、及び6個の第3の星型ショウジョウバエ幼虫を搭載した撮像室を上側に取り付けた。スケールバー = 10 mm(E) 幼虫の近い図 (D)スケールバー = 1 mm.この図の大きいバージョンを表示するにはここをクリックしてください。

図2:樹状力学のタイムラプスイメージング(A-F)IV級ニューロンデンドライトのタイムラプス動画から選択されたフレームは、画像化開始後の特定の時点で行った。幼虫の画像は48時間AEL(AおよびF)、72時間AEL(B)、96時間AEL(C)、および120時間AEL(D)で撮影された。 ニューロンは、ppk>CD4-tdTom (A、 D、 E、 F) またはppk >CD4-tdTom (BおよびC) によってラベル付けされます。青い矢印は、前の時点と比較して樹状の引き込みが示されます。黄色の矢印は、前の時点と比較して樹状の延長を示します。(E) 12時間の画像化の終わりにデンドライト形態。(F)2番目の星内幼虫の樹状枝が伸びて(黄色い矢印)、別の樹状突起に接触した後に引き込まれた(青い矢印)方法を示す映画の中で3分間隔の連続フレーム。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:デンドライト変性のタイムラプス画像化と、イートミー信号の暴露レーザー損傷後のクラスIVダニューロンのデンドライトを退化するタイムラプスムービーから選択されたフレーム。デンドライトはppk>CD4-tdTomによってラベル付けされました。退性デンドライトに関するイートミーシグナルPSは、脂肪体によって分泌されるアネキシンGFP(AV-GFP)によって検出された。黄色の矢印は、AV-GFP のラベル付けを示す分岐を指します。青い矢印は、断片化を起こしている樹状突を指します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ビデオS1:第3のインスター幼虫はPDMS立方体のノッチに固定化される。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。

ビデオS2:デンドライトは、第2のインスター幼虫に動的に伸び、引き込む。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。

ビデオS3:デンドライトは、放浪する第3の星内幼虫に動的に伸び、引き込む。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。

ビデオS4:デンドライトは、第3のインスター幼虫におけるレーザー損傷後に縮退し、ホスファチジルセリンを暴露する。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。

著者らは競合する利益を宣言していない。