患者由来胃癌幹細胞のステム関連遺伝子を研究するための条件付きノックダウンと適応球形成アッセイを組み合わせた

サマリー

本プロトコルでは、患者由来のGCSCsのステムに及ぼすクラスタリングの効果を研究するために、条件付きノックダウンシステムと適合球形成アッセイを用いた実験計画を提示する。このプロトコルは、異なるタイプのCSCにおけるステム関連遺伝子のインビトロおよびインビボ機能の両方を研究するために容易に適応することができる。

要約

がん幹細胞(CSC)は、治療後の腫瘍の開始、発達および再発に関与し、過去数十年の間に多くの研究の注目を集めています。したがって、がん細胞幹細胞に関与する重要な遺伝子の役割を調べる方法を開発することが重要です。胃癌(GC)は、最も一般的で致命的なタイプの癌の1つです。胃癌幹細胞(GCSC)は、胃癌再発、転移および薬剤耐性の根源であると考えられている。GCSCs生物学を理解することは、標的療法の開発を進め、最終的には患者の死亡率を減らすために必要である。本プロトコルでは、患者由来のGCSCsのステムに及ぼすクラスタリングの効果を研究するために、条件付きノックダウンシステムと適合球形成アッセイを用いた実験計画を提示する。このプロトコルは、異なるタイプのCSCにおけるステム関連遺伝子のインビトロおよびインビボ機能の両方を研究するために容易に適応することができる。

概要

胃癌(GC)は、癌の最も一般的かつ致命的なタイプ^{の1である}。GC療法における併用手術、化学療法および放射線療法の進歩にもかかわらず、予後は依然として悪く、5年生存率は依然として非常に低い²である。再発と転移は、治療後の死亡を引き起こす主な理由です。

癌幹細胞(CSC)は、腫瘍³を再構成する異なる細胞系統を自己更新し、生成する能力を有する癌細胞のサブセットである。CSCは、自己再生および新しい腫瘍の播種の能力と、伝統的な化学および放射線療法⁴に対する耐性のために、癌の再発および転移の原因であると考えられている。したがって、CSCを標的とし、CSCを排除することは、治療を改善し、癌患者の死亡率を減らすエキサイティングな可能性を提供する。

CSCは、多くのタイプの固形腫瘍⁵から単離されている。2009年には、ヒト胃癌細胞株から分離された胃癌幹細胞(GCSC)が、もともと高石ららによって記述^された。Chenたちの研究グループは、まずヒト胃腺癌(GAC)腫瘍組織からGCSCを同定し、精製^した7.これらの知見は、GCSCs生物学を研究する機会を提供するだけでなく、臨床的に非常に重要な役割を提供する。

CSCの特長は球^体8を形成する能力です。単一細胞は低密度で非接着条件でメッキされ、自己再生を有する細胞のみが球体と呼ばれる固体球状のクラスターに成長することができる。このように、球形成アッセイは、金標準アッセイと見なされ、インビトロで幹細胞の自己再生電位を評価するために広く使用されている。

RNA干渉(RNAi)は、特定の遺伝子9のノックダウンによる遺伝子機能を研究するための強力な研究ツール^です。しかし、長期安定遺伝子ノックダウン技術には、細胞の生存に不可欠な遺伝子の機能を探求するという課題など、一定の制限があります。条件付きRNAiシステムは、誘導剤の投与によって時間的および/または特別に制御された方法で所望の遺伝子のダウンレギュレーションに有用であり得る。テトラサイクリン(Tet)誘導性システムは、最も広く使用されている条件付きRNAiシステム¹⁰の1つである。Tet誘導可能なシステムは、外因性誘導体(優先的にドキシサイクリン、ドキックス)の添加時にshRNAの発現を制御することによって標的遺伝子サイレンシングを誘導することができる。Tet-誘導可能なシステムは、テトオンシステムとテトオフシステムの2種類に分けられます。shRNAの発現は、インデューサーの存在下でオン(Tet-On)またはオフ(Tet-Off)することができる。インデューサーを含まないTet-ON系では、構成的に発現したTetリプレッサー(TetR)は、shRNA発現に対するテト応答性ポルIII依存性プロモーターを含むTet応答性要素(TRE)配列に結合し、shRNAの発現を抑制する。Doxの添加時に、TetRはテト応答性ポルIII依存プロモーターから隔離される。これはshRNAの発現を促進し、遺伝子ノックダウンにつながる。

ここで説明するプロトコルは、機能的テトラサイクリン誘導性shRNAシステムと適応球形成アッセイを用いて患者由来のGCSCにおけるクラスタリングインの機能を研究する。¹¹我々は、GCSC自己再生におけるクラスタリングインの効果を研究するために、上記のプロトコルを使用する。この方法論は、他のタイプの癌幹細胞にも適用可能である。

プロトコル

本明細書に記載の患者由来胃癌幹細胞を用いた全ての実験は、地元の倫理委員会⁷によって承認された。

胃癌幹細胞培養

1. GCSCs完全培養培地の調製
   1. 以下の必須成分を含む新鮮なDME / F12培地を添加することにより、GCSC完全な培養培地を調製します: 20 ng /mL EGF, 10 ng /mL bFGF, 1%インスリン/トランスフェリン/セレナイトナトリウム、0.2%グルコース、0.5%B27、1%グルタマックス、1%非必須アミノ酸、10 μM₃2メルカプトエタノール、0.75 mg/mL NaHCO 3、10 μMチオグリセリン、100 IU/mLペニシリンおよび100gμM10μM10/m10g/mrepm10/m10g/mmyc0.22 μmフィルターを使用してフィルターと滅菌を行います。
      注:GGC完全培養培地は、4°Cで2週間以下で保存することが推奨される。
2. GCSCsと文化の回復
   注:GCSCは以下のように得られた:腫瘍試料は、機械的および酵素的解離を行った。単一細胞懸濁液は、よく散乱した懸濁液からナイロンネットで濾過することにより得られた。得られた癌細胞をGCSCs完全培養培地で培養し、いくつかの細胞は球体を形成するように成長した。これらの球体は、酵素解離を行い、そして、GCSCはCD44/CD54マーカーで染色された細胞集団の細胞蛍光測定による分類によって得ることができる。GCSCの詳細なプロトコルと機能アッセイは^7.
   1. 予温性GCSCは37°Cで培養培地を30分以下で完成させた。
   2. 液体窒素貯蔵からGCSCを解凍し、37°Cの水浴で凍結を急速に解凍する。全体の内容が完全に溶けるまでバイアルを渦巻き続けます。
      注:37°Cの水浴で凍結した細胞を急速に解凍(<1分)。
   3. 10 mLのGGCC完全培養培地を含む15 mL遠心分離管に、クリオシャルの全内容物を移す。800 x g で 5 分間 RT で遠心分離機。
   4. 上清を慎重に吸引し、新鮮なGCSC完全培地の10 mLに細胞ペレットを懸濁します。セルの懸濁液を100mmペトリ皿に入れます。37°Cのプレートを5%CO2インキュベーター₂でインキュベートし、3日目に5mLの新鮮な完全培地を加えます。
3. GCSCs腫瘍球のサブカルチャー
   注:腫瘍球中心のGCSCは、直径80〜100μmまで成長する球のサイズの前に十分な栄養素しか持っていません。暗くて低い屈折球が現れたら(約6日間の培養)、腫瘍球をサブ培養する必要がある。
   1. 皿を穏やかに振り、GcSCs腫瘍球培養培地(培地および非接着性腫瘍球)を無菌15 mL遠心分離管に移します。大きな中量の場合は、より大きな遠心管が必要になることがあります。
   2. 600 x g で 5 分間遠心分離し、上清を慎重に処分します。遠心分離後、オフホワイトペレットが見えます。
   3. 2 mLの細胞解離液を加えて、37°Cで機械的および酵素的解離のためにペレットを再懸濁させます。 消化手順で2〜3分ごとに10回上下に静かにピレットし、腫瘍球が単一細胞懸濁液に分散するまで球体を分解する。この全解離プロセスは15分未満にすることをお勧めします。
      メモ:顕微鏡で目視チェックを行い、大きな球体や細胞の凝集体が残っていないか確認します。
   4. 10 mLの新鮮な事前温めたGCSC完全な培養培地(細胞剥離液の体積5倍)を加えて、消化手順と遠心分離機を800 x g のRTで5分間終了します。
   5. 上清を捨て、1 mLの新鮮な温めるGCSC完全な培地で細胞を再懸濁します。10 mLの新鮮な事前温めたGCSC完全な培養培地で適切な数の細胞を新しい100mmペトリ皿に播種し、37°C、5%CO2でインキュベートする。₂
   6. 5 mLの新鮮な温め込み完了培地を加えて3日後に腫瘍球培養液を再供給する。6日後、腫瘍球が直径80〜100μmまで成長すると、通過細胞が成長する。
4. GCSCsの凍結保存
   注:腫瘍球に直接培地を加えて、GCSC細胞を凍結保存しないでください。細胞保護剤が細胞の長期安定的な貯蔵を確実にするために細胞に入ることができるように、GCSCの腫瘍球を単一細胞に消化する必要があります。細胞が健全な状況にあり、汚染がないようにしてください。
   1. GcSCs腫瘍球を収穫する。600 x g で 5 分間の遠心分離機。
   2. 上清を捨て、細胞解離液2 mLを加えて、37°CでGCSC腫瘍球を解離する。 10 mLのGMC完全培養培地を添加して消化手順を終了する。
   3. 5分間800 x g で遠心分離機を使用し、単一のGCSCsを収集します。
   4. 無血清凍結保存剤培地でGCSCを静かに中断します。推奨される最終濃度は5 x 10^5- 5 x 10⁶ 細胞/mLです。
   5. 細胞懸濁液を1 mLアリコートでマークされた極低温バイアルに分配する。
   6. すぐにイソプロパノールチャンバーに細胞を含むクリボビアルを置き、-80°Cで保存します。 バイアルを翌日液体窒素に移し、長期保存します。

2. 誘導可能なノックダウンGCSCsラインの生成

注意:組換えレンチウイルスは、国立衛生研究所と疾病管理センターによってレベル2の生物として指定されています。レンチウイルスを含む作業は、これらのレンチウイルスシステムによって生成されるウイルス上清が潜在的に危険な組換えウイルスを含むことができることを考慮して、バイオセーフティレベル2施設の維持を必要とする。

1. レンチウイルス粒子の生成
   1. 表 1 の設計に基づいて、ヒトクラスターを標的とする誘導性shRNAとGeneChem(GV307)を含む2つのレンチウイルスベクターを合成する(GV307ベクターには、TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Pomycin)。
   2. シード 4 x 10⁶ 293T レンティウイルス包装細胞を100 mmペトリ皿に、10 mLのDMEMを10%牛血清で補います。
   3. 293T細胞を37°C、5%CO2で一晩₂インキュベートする。293T細胞密度がトランスフェクションの日に約50〜80%コンフルエントであることを確認してください。
   4. 減らされた血清媒体を室温に持ち込み、 表2に記載されているようにチューブAとチューブBを準備する。
   5. チューブAをチューブBに移し、よく混ぜ、室温で20分間インキュベートし、脂質DNA複合体を調製します。
   6. 5 mLの培地を除去し、脂質DNA複合体を添加する前に、合計5 mLを残します。
   7. 培養皿に5mLの脂質DNA複合体を滴下して加え、皿をそっと渦巻いて複合体を分配する。
      注:293T細胞を乱さないように、慎重に皿の壁に液体を分配します。
   8. 37°Cで24時間、5%CO2で培養培養_皿。
   9. トランスフェクション後24時間後、トランスフェクション媒体を慎重に取り出し、10%FBSを添加した10mLの予温DMEMにそっと交換してください。37°Cで24時間インキュベート_、5%CO2.
      注:すべての上清と先端は、処分前に10%漂白剤で処理する必要があります。
   10. トランスフェクション後約48時間後、レンチウイルス含有上清の10mLを収穫する。
       注:すべての細胞培養容器および先端は、処分前に10%の漂白剤で処理する必要があります。
   11. 0.45 μmの細孔フィルターを使用してレンチウイルス上清をフィルターして、細胞の破片を除去します。
       注:すべてのフィルタと注射器は、処分前に10%漂白剤で処理する必要があります。
   12. 移動は、滅菌容器に上清を明確にし、Lenti-Xコンセントレータ(清澄上上清の1/3ボリューム)を加えて、穏やかな反転によって混合します。
   13. 4°Cで一晩インキュベートした混合物。
   14. 遠心分離機サンプルは4°Cで45分間1,500 x g で行う。 遠心分離後、オフホワイトペレットが見えます。上清を慎重に除去し、ペレットを乱さないよう注意してください。
       注:すべての上清と先端は、処分前に10%漂白剤で処理する必要があります。
   15. ウイルスストックとして10%FBSを補ったDMEMの1mLにペレットを静かに再懸濁し、-80°Cで保管してください。
2. 安定したトランスフェクト細胞株の生成
   1. シード 6 x 10⁶ GCSC は 100 mm ペトリ皿に、10 mL DMEM は 37 °C で 24 時間 10% FBS、5%_CO2 (感染前の合流点 70-80% ) を補います。
   2. 皿の中に培地を吸引し、ポリブレン試薬(5 μg/mL)を含む完全なDMEM培地の4 mLで希釈した濃縮レンチウイルス粒子を皿に加えます。37°Cで18時間インキュベート_、5%CO2.
      注:ポリブレンの最適な濃度は、細胞の種類に依存し、有効な濃度を決定するために異なる濃度でテストする必要があります。それ以外の場合は、経験的に決定され得るが、通常は2〜10μg/mLの範囲である。すべてのチューブと先端は、処分前に10%の漂白剤で処理する必要があります。
   3. 培地を交換し、10%FBS培地で10mLのDMEMに交換し、37°Cで24時間インキュベートし、5%CO2でインキュベートする。₂
      注:すべての媒体と先端は、処分前に10%の漂白剤で処理する必要があります。
   4. 上清を細胞デブリで吸引し、ピューロマイシン(2.5 μg/mL)を含む10%FBS培地で補った新鮮なDMEMと交換し、37°Cで24時間インキュベート₂し、5%CO2をインキュベートする。次に、ピューロマイシン(5 μg/mL)を含む10%FBS培地で補充された新鮮なDMEMを交換し、37°Cで₂インキュベートし、さらに24時間の場合は5%CO2をインキュベートします。
   5. カルシウムとマグネシウムを含まないDPBSの5 mLで接着性のGcSCを2回リンスします。
   6. 1 mLの予温細胞解離液でGCSCsを解離し、37°Cで2〜3分間インキュベートする。
   7. 5 mLの新鮮な事前温めたGCSC完全な培養培地を細胞懸濁液に加える。
   8. 細胞を凍結保存するための15 mL遠心管(チューブA)に3mLを分配し、他の3mLを15 mL遠心管(チューブB)に分配してドキシサイクリンを誘導する。
   9. 遠心管AとチューブBを800xgでg5分間用いた。
   10. 無血清凍結保存剤培地1 mLでチューブAのペレットを再懸濁し、バイアルを-80°Cに一晩移し、液体窒素貯蔵中に取り出します。
   11. 上清を吸引し、チューブBの細胞を1mLの新鮮な前温めたGSC完全な培養培地中に再懸濁させた。適切な数の細胞を10 mL新鮮な事前温められたGCSCの新しい100 mmペトリ皿に播種し、ドキシサイクリン(Dox)(2.5 μg/mL)を用いた完全な培養培地を、37°Cで48時間インキュベートし、5%CO2でインキュベートします。₂
       注: Dox の最適濃度は、細胞のラインによって異なる場合があります。各細胞株は、KDの有効濃度と細胞上の毒性を決定するために、異なるDox濃度でテストする必要があります。
   12. ウェスタンブロッティングにより、GCSCにおけるクラスタリングの安定的な抑制を確認する。

3. 球形成アッセイ

1. 凍結誘導可能なノックダウン GCSCs 回線を解凍します(ステップ 1.2 を参照)。
2. 自動化セルカウンターを使用して、10 μLサンプルの生存可能なセル密度を決定します。
3. 事前に温められたGCSC完全な培養培地で容積を調節して、2 x 10⁴ 個の生存細胞/mLの濃度を得る。
4. 3つの新しい96ウェル超低添付着物培養プレートウェル(0.1 mL /well)各グループに分配します。
5. 5%CO2で37°Cのインキュベーターで細胞をインキュベー₂トする。球体形成は3-10日以内に起こるべきである。腫瘍球形成の可視化を2日ごとに監視し、記録する。
   注:腫瘍球形成の障害の場合には、培地を変更することは推奨されません。これらの腫瘍球は、単一および凝集細胞から容易に区別されるべきである。
6. イメージングソフトウェアを用いて形成された腫瘍球のサイズを評価することにより、腫瘍球形成結果を決定する。

結果

原発性ヒト胃腺癌由来の胃癌幹細胞を無血清培地で培養した。6日後、単一細胞状表現型(図1A)から細胞が拡大して大きな球体を形成する(図1B)。

GCSCにおけるクラスタリングインの機能を評価するために、上述のプロトコルに従って、ジロニンおよびスクランブルに対するshRNA配列をTet-GV307-RFP-Poベクターにクローン化した。テトラサイクリン調節shRNA-クラスタイン発現ベクターを安定的にトランスフェクトしたGCSCを生成し、48時間のドキシサイクリン(図2)で処理した(そして、shRNAはコントロールとしてスクランブルした)。クラスタニンの発現レベルはウェスタンブロットで検証され、その後、濃度測定法...

ディスカッション

GCは、世界で癌関連死の第3位の原因です。GCSCは胃癌の再発、転移および薬剤耐性において重大である。胃癌患者のGCSCを使用することで、弱点を探索し、GC患者の治療のための標的薬を開発することができます。

球形成アッセイは、がん幹細胞の自己再生ポテンシャルをインビトロで調べるのに有用な方法である。結果は、形成された球の割合を、シードされた単一細胞の元の数で割って提示することができる。我々は、このアッセイの結果を改善し、他のタイプの癌幹細胞の再現性を容易にするために、いくつかの時点ですべての細胞/球の平均サイズを計算するために、独自の方法を適応させました。このアッセイの結果は、初期のシード細胞の数に大きく依存することを証明しました。これは、初期細胞の単離を維持し、球状コロニーの数を正確に測定する(細胞凝集を除く)ためのこのアッセイの重要なポイントです。また、細胞の凝集や単一の細胞から球を明確に区別するために、カウント時間を最適化することが重要です。

Tet-誘導可能なシステムは、このプロトコルのクラスタリングと同様に、インビト...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.22 以上 μ;m フィルター	ミリポア	SLGP033RB
1-チオグリセロール	Sigma-Aldrich	M6145
2-メルカプトエタノール	Gibco	2068586
アニマルフリー 組換えヒト EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 サプリメント (50X)、無血清	Gibco	17504044
Corning Costar 超低アタッチメント マルチウェルプレート	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess Cell Counting Chamber スライド	Invitrogen	C10228
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate	Gibco
ドキシサイクリン ヒクレート	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS、カルシウム不使用、マグネシウム不使用	Gibco	14190250
Fetal Bovine Serum、認定、オーストラリア	Gibco	10099141
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061
インスリン、トランスフェリン、セレン溶液 (ITS -G)、100X	Gibco
レンチウイルスベクター	GeneChem	GV307
Lenti-X 濃縮器	Takara	631232
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	Gibco	11140050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 & micro;m、PVDF、33 mm、ガンマ線滅菌	ミリポア	SLHV033RB
Nalgene 一般長期保存 極低温チューブ	Thermo Scientific	5000-1020
Nunc Cell Culture/Petri Dishes	Thermo Scientific	171099
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
pHelper 1.0 (gag/pol component)	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0 (VSVG component)	GeneChem	pHelper 2.0
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
組換えヒト FGF-basic	Peprotech	100-18B
Nadium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER 凍結保存培地	ZENOAQ	11890
StemPro Accutase 細胞解離液	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5	Invitrogen	15567027
ZEISS 倒立顕微鏡	ZEISS	Axio Vert.A1