我々は、トランスウェルフィルター上に培養された三叉(TG)ニューロンを用いた歯科パルプ(DP)一次細胞の分離、分散およびめっきについて述べた。DP細胞の細胞応答は、免疫蛍光またはRNA/タンパク質分析で分析することができる。共焦点顕微鏡を用いた神経細胞マーカーの免疫蛍光は、神経突起の成長応答の解析を可能にする。
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この記事について
サマリー
要約
歯のインナーブは、歯の内部が圧力、温度および炎症を感知することを可能にし、そのすべてが歯器官の使用および維持にとって重要である。感覚的な内膜がなければ、毎日の口腔活動は回復不可能な損傷を引き起こすであろう。その重要性にもかかわらず、歯の発達と維持における内膜の役割はほとんど見過ごされてきた。いくつかの研究は、DP細胞がTG軸索を引き付け、歯全体に導くために細胞外マトリックスタンパク質およびパラクリンシグナルを分泌することを実証している。しかし、DP間質と神経の薬効との間のクロストークに関する詳細な洞察を提供した研究はほとんどありません。この知識のギャップに対処するために、研究者は共文化と様々な技術を活用してこれらの相互作用を調査し始めました。ここでは、大口径の細孔を有するトランスウェルフィルターに分散したTGニューロンを用いて一次DP細胞を共培養し、細孔を通して軸索成長を可能にする複数のステップを実証する。loxP部位によって隣接した目的の遺伝子を有する原発性DP細胞は、アデノウイルス-Cre-GFPリコンビナーゼ系を用いて遺伝子欠失を促進するために利用された。Thy1-YFPマウスのTGニューロンを使用すると、共焦点顕微鏡によるバックグラウンドレベルをはるかに上回る発現を有する正確なアフェレントイメージングが可能となった。DP応答は、取り外し可能なガラスカバースリップにメッキされたDP細胞の免疫蛍光染色を介して、タンパク質またはRNAの収集および分析、または代替的に調査することができる。培地はプロテオーム分析などの手法を用いて分析できますが、これはウシ胎児血清の存在によるアルブミンの枯渇を必要とします。このプロトコルは、共培養アッセイの制御された環境に応答して、TGニューロンおよびDP細胞の形態学的、遺伝的、および細胞骨格応答を研究するために操作することができる簡単な方法を提供する。
概要
歯のインナーブは、歯の内部が圧力、温度および炎症を感知することを可能にし、そのすべてが歯器官の使用および維持にとって重要である。虫歯や外傷に伴う歯の痛みを感知しないと、病気の進行につながります。したがって、適切な内線は、正常な歯の成長、機能およびケアのための要件である。
ほとんどの臓器は出生時までに完全に機能し、内臓化されていますが、歯の発達は成人生活にまで及び、出生後段階1、2の間に協調して歯の内膜とミネラル化が起こる。興味深いことに、歯髄(DP)間感覚は、最初は胚発生時に反発シグナルを分泌し、発達中の歯器官への軸索の侵入を防ぎ、後に歯が噴火に近づくにつれて誘引因子の分泌に移行する3,4。出生後の段階では、象牙質沈着が始まる頃に歯牙(TG)神経から逸脱した軸索が歯に浸透する(Pagella,P.いくつかの生体内研究では、神経間葉相互作用がマウスの歯の内膜化を導く(Luukko,K.al.
細胞共培養は、研究者が神経集団と間葉集団間の相互作用を操作できる制御された環境を提供する。共培養実験により....
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プロトコル
マウスを用いた実験はすべて、UAB機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認された。
1. プレートの準備
注: カバースリップは、アッセイの終了時に DP セルをイメージするために使用できます。サンプル処理中の汚染を防ぐために、滅菌組織培養フードの外側のすべてのインキュベーションとリンスのステップ中にプレート蓋がオンになっていることを確認してください。
-
カバースリップ準備
- オートクレーブ円形カバースリップ。
- フードの下に超純水をフィルターします。
- カバースリップを24ウェルプレートに移し、400 μL 0.1 mg/mLポリDリジンでそれぞれカバーします。
- カバースリップを浸し、5分間浸し、ロッカーの12 rpmまたは40〜50 rpmの軌道シェーカーに浸します。汚れ防止のために蓋が付いてるのを確認してください。
- 12 rpmまたはシェーカーで12rpmまたはシェーカーで50rpmで約5分間、濾過された超純水でカバースリップをすすいでください。繰り返します。
- カバースリップをボンネットの下で少なくとも2時間乾燥させ、プレート蓋をオフにして蒸発を促進します。これらのカバースリップは48時間以内に使用する必要があります。
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結果
これらの結果は、TGニューライト単一培養の制御と比較して、基礎となるウェル中の一次DP細胞の存在下でTGニューライトの成長が増加したことを示している(図2A、C)。ニューライトの成長には、いくつかのアッセイ・ツー・アッセイの変動があります。したがって、TGニューロン単一培養は、神経突起の成長の基底レベルを検出するためのコントロールとして、すべてのアッセイに含まれるべきです。Ad-Cre-GFPおよびAd-eGFPの感染後にこのプロトコルで使用したTgfbr2f/fマウス由来の一次細胞は、同等の数の細胞で確認された(図2D)。Ad-eGFPは、コントロールウイルスベクターとして役立った。Ad-Cre-GFPは、半定量PCR(図2E)によって示されるように、横並び遺伝子Tgfbr2を削除した。増殖因子β受容体2(Tgfbr2)欠失を変化させる.......
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ディスカッション
口腔の日々の活動は、歯が適切な使用と維持を可能にするために外的刺激と内部炎症を感知することを必要とする。しかし、歯の内膜の発達過程を促進する信号に関する情報は限られています。このプロトコルは、2つの集団間の相互通信を研究するために、プライマリDP細胞およびTGニューロンを分離および共培養する方法を提供する。いくつかの変数が最適化され、以下に説明されるように、研究のさらなる道を開いたままにします。
このアッセイの各ステップにおいて、コントロールが重要です。基礎となるDP細胞を含まないTGニューロンを用いてトランスウェルフィルターを全てのアッセイに含めて、TG増殖のベースラインを提供する必要があります。Ad-Cre-GFPリコンビナーゼで対象の横たわった遺伝子を削除する場合、蛍光マーカーのみを発現するコントロールウイルスを使用して、同等の数の細胞が感染していることを確認する必要があります。Ad-eGFPとAd-Cre-GFPの100および200 MOIで、それぞれ最小の細胞死で高レベルの感染を実証しましたが、各ラボはこのステップを最適化する必要があります。蛍光タンパク質は異なるプロモー.......
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開示事項
著者たちは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、a)国立衛生研究所/NIAMS(助成金番号R01 AR062507とR01 AR053860からRSへ)、b)アラバマ大学バーミンガム歯科学術研究トレーニング(DART)助成金(番号T90DE022736(PI MacDougall))によって、国立歯科・頭蓋顔面研究研究所/クリオフェイシャル研究研究所/SBPに支援されました。 c) UABグローバル・センター・フォー・クラニオ顔面・口腔・歯科障害センター(GC-CODED)パイロットおよびD)国立歯科頭蓋顔面研究所SBPに対する研究/国立衛生研究所K99 DE024406助成金。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 5-フルオロ-2'-デオキシウリジン | Sigma-Aldrich | F0503 | 15 μ共培養培地中のM濃度、2 |
| 日目 24ウェル細胞培養プレート | Corning | 3524 | 共培養プレート |
| Alexa-546 抗ニワトリ | Invitrogen | A-11040 | 抗GFP抗体によって標識された神経突起伸長を染色する二次、1:500 |
| 抗GFP抗体 | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Thy1-YFPニューロンを標識する一次抗体、1:200 |
| 抗ニューロフィラメント200抗体 | Sigma-Aldrich | NO142 | モノクローナル一次抗体 ニューロンを標識する抗体、1:1000 希釈、YFP マウスが利用できない場合は代替 |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | ジャクソン研究所 | 12603 | Tgfbr2f/f/f 最適化されたプロトコルB6の歯髄細胞に使用されるマウスモデル |
| 。Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | ジャクソン研究所 | 3709 | 三叉神経細胞に使用されるThy1-YFPマウスモデル遺伝子型 |
| コラゲナーゼII | 型ミリポア | 234155-100MG | 三叉神経細胞の分散に使用 |
| シ胎児血清 | Gibco | 10437 | 共培養培地への添加物 |
| 微細鉗子 | Fine Science Tools | 11413-11 | TG解剖用微細鉗子 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | トランズウェルインサートを最終濃度 10 μg/ml、ストック溶液は1.5mg/mlと仮定 |
| 溶解バッファー(バッファーRLT) | Qiagen | 79216 | 共培養後の歯髄細胞からRNAを抽出 |
| L-グルタミン | ギブコ | 25030081 | 共培養培地への添加物 |
| マイクロ解剖ハサミ | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | 頭蓋骨を開くための解剖ハサミ |
| 顕微鏡カバー ガラス | フィッシャーブランド | 12-545-81 | オプションの細胞培養および免疫蛍光処理用の環状カバースリップ |
| 最小限のエッセンシャル培地 | ギブコ | 12571063 | 共培養培地ベース |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | ギブコ | 15070063 | 共培養培地への抗生物質添加物 |
| ホスファターゼ阻害剤 | シグマ・アルドリッチ | 04 906 837 001 | 歯髄細胞からタンパク質を抽出するためのRIPAバッファーへの添加物 ポスト共培養 |
| ポリブレン | ミリポア | TR-1003-G | 歯髄細胞のトランスフェクションに使用 |
| ポリ-D-リジン | Sigma-Aldrich | P7280 | 歯髄細胞接着を助けるカバースリップコーティング |
| プロテアーゼ阻害剤 | ミリポア | 05 892 791 001 | 培養後の歯髄細胞からタンパク質を抽出するためのRIPAバッファーへの添加 |
| RNAse/DNAseフリーのエッペンドルフチューブ | デンビル | C-2172 | アッセイ終了時のRNA、DNAまたはタンパク質収集用の滅菌済み1.7 mlチューブ |
| ThinCert細胞培養インサート | Greiner Bio-One | 662631 | 共培養アッセイにおける三叉神経ニューロン用トランズウェルインサート |
| トリプシン-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | 使用 fto 歯科歯髄細胞を分散 |
| トリプシンII型 | Sigma-Aldrich | T-7409 | 分散に使用三叉神経ニューロン |
| 超微細鉗子 | ファインサイエンスツール | 11370-40 | 解剖用超微細鉗子 |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | 1 μ共培養培地中の M 濃度、2 日目 |
| 真空ろ過システム | ミリポア | SCNY00060 | Steriflip ディスポーザブルフィルター、50 μmのナイロン網フィルター |
| バイアルの鉗子 | Fine Science Tools | 110006-15 | 円錐形への組織移動のための長い鉗子 |
参考文献
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morph....
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