Method Article

フローサイトメトリーを用いた赤血球補体受容体1の測定

DOI:

10.3791/60810

⸱

May 19th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oncogeriatric Coordination Unit, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform, University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology, Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この方法の目的は、赤血球CR1密度が知られている3人の被験者と比較することによって、任意の被験体の赤血球中のCR1密度を決定することである。この方法は、フィコエリスリン(PE)を用いて増幅系に結合した抗CR1モノクローナル抗体による被験者の赤血球の免疫染色後のフローサイトメトリーを使用する。

Abstract

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CR1(CD35、C3b/C4b用補体受容体1型)は、約200kDaの高分子膜糖タンパク質であり、補体活性化を制御し、免疫複合体を輸送し、体液性および細胞性免疫応答に関与する。CR1は、赤血球を含む多くの細胞型の表面に存在し、長さ、構造(Knops、またはKN、血液群)、および密度において多型を示す。赤血球当たりのCR1(CR1/E)の平均密度は、赤血球当たり500分子である。この密度は、ある個体(100~1,200 CR1/E)、同一個体の赤血球から別の赤血球へと変化する。ここでは、増幅免疫染色システムの助けを借りて、低密度を発現する被験者を含むCR1/Eの密度を測定する堅牢なフローサイトメトリー法を提示する。この方法により、アルツハイマー病(AD)、全身性エリテマトーシス(SLE)、エイズ、マラリアなどの疾患におけるCR1赤血球発現の低下を示す。

Introduction

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CR1(補体受容体型1、CD35)は、赤血球1、Bリンパ球2、単球細胞、一部のT細胞、濾胞樹状細胞3、胎児アストロサイト4、および糸球体ポドサイト5のような多くの細胞型の表面に存在する200kDa膜貫通糖タンパク質である。CR1は、そのリガンドC3b、C4b、C3bi6、7、8、9、第1の補体成分のサブユニット、C1q6,7,8,910およびMBL(マンナン結合レクチン)11は、補体の活性化を阻害し、体液性および細胞性免疫応答に関与する。

ヒトを含む霊長類において、赤血球CR1は、肝臓および脾臓への免疫複合体の輸送に関与し、血液を浄化し、皮膚または腎臓12、13、14,13

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Protocol

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ヒトの採血と取り扱いの議定書は、地域倫理委員会(CPP Est II)によって審査され、承認され、プロトコル番号は2011-A00594-37です。以下のプロトコルは、ヒトの血液の取扱いについて説明しているので、生体有害物質の廃棄に関する制度上のガイドラインに従うべきである。ラボコートや手袋などの実験室の安全装置を着用する必要があります。

1. 赤血球洗浄

注意:取り扱い前日に、ウシ血清アルブミン(BSA)の0.15%を含むリン酸緩衝生理食塩分(PBS)を用いてPBS-BSAバッファーを調製し、4°Cで冷蔵庫に入れます。このバッファーは、洗浄バッファーとして、希釈バッファーとして使用されます。

  1. ピペット20 mLのPBS-BSAを50 mLチューブにします。
  2. 250μLのナトリウムエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)の吸入体は、血液貯蔵管から全血を抗凝固し、20mLのPBS-BSAを含むチューブに添加した。キャップをねじ込んでチューブを閉じます。管2倍を反転してやさしく混ぜます。
  3. 430 x gで4°Cで10分間チューブを遠心分離します。10 mLピペットを使用して上清を取り出し、廃棄します。優しく慎重なピペット処理により、上清の残留体積中のペレットを再懸濁します。
  4. ペレットを含むチューブに20 mLの冷たいPBS-BSA....

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Results

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CR1の密度が知られている3人の被験者の赤血球("低"被験者[180 CR1/E]、中型の被験者[646 CR1/E]、および「高」被験者[966 CR1/E])、およびCR1密度を決定する必要がある2つの被験者の赤血球は、フィロクロム系を用いて免疫染色された。初めに、低い高い範囲からの被験者のCR1密度は、放射線標識抗体を用いてScatchard法29によって決定された。測定された基準(低、中、高)は、較正曲線に使用され、サイトメトリー30の方法によって新しい基準または副標準を定量化することを可能にした。フローサイトメーターで免疫染色赤血球を通過した後、標識の強度を観察し、各被験者の平均蛍光強度(RBC MFI)として測定した(図3F、I;I図 4B,D,F,I,

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Discussion

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赤血球CR1(CR1/E)の密度を決定するためにいくつかの技術が利用可能です。第1の技術は、抗CR1抗体31による赤血球の凝集と、C3b32でコーティングされた赤血球の存在下でのロゼットの形成であった。32これらの初歩的な技術は、放射性標識抗CR1抗体11、3333を用いた免疫染色法によって迅速に置換された。また、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)34による膜抽出物中のCR1の濃度を測定することもできる。34正確ではあるが、これらの技術はCR1/E密度の平均値のみを提供する。赤血球集団全体にわたるCR1/E密度の分布は、免疫染色後のフローサイトメトリック分析によってのみ利用可能です。この技術はCR1/Eの低密度のため困難である。しかし、増幅法により、CR1/E30の密度を容易に測定することが可能になった。30

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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URCACyt、フローサイトメトリー技術プラットフォームのメンバー、免疫学科のスタッフ、およびプロトコルの最適化と検証に貢献した内科学・老年医学省のスタッフに感謝します。この研究はランス大学病院(助成金番号AOL11UF9156)によって資金提供されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1000Eバリアチップモフィッシャーサイエンティフィック、F-67403イルキルヒ、フランス2079Eサンプルピペッティング
1-100µL 面取り、フィルターチップStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1120-1840sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)Home production of noncommercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cookimmunostaining
Blouseprotection
Bovin serum albumin (7,5%)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France15260037サイトメトリー
Centrifuge ThermoFischer Scientific , F-67403 Illkirch, France11176917 Centrifugation
Clean SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340345サイトメトリー
Comorack-96Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath944060Prack
Cytometer Setup &トラッキングビーズキットBD、F-38801 Le Pont de Claix、フランス655051サイトメトリー
ホルムアルデヒド溶液36.5%Sigma Aldrich、F-38070 Saint Quentin Fallavier、フランスF8775-25MLFixation
10 µL 卒業、フィルターチップStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1121-3810sample pipetting
LSRFORTESSA Flow CytometerBD, F-38801 Le Pont de Claix, France647788サイトメトリー
Microman Capillary PistonsDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath067494sample pipetting
Micronic 1.40 mL 丸底チューブDominique DUTSCHER SAS, F-67172 BrumathMP32051mix
マイクロピペット Microman - type M25 -Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath066379sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10010031cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mLDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath391952sample pipetting
powder-free Nitrile Exam手袋Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA486802sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000024sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000059sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000083sample pipetting
Rinse SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340346サイトメトリー
丸底チューブSarstedt, F-70150 Marnay, France55.1579サイトメトリー
Safe-Lock Tubes, 1.5 mLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France0030120086
ストレプトアビジン R-PETebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, FranceAS-60669免疫染色
Tapered Centrifuge Tubes 50 mLThermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, France10203001mix
Vector anti streptavidin biotinEurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, FranceBA-0500immunostaining
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USASI-0236ミックス
サー

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
  2. Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T.

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Erythrocyte Complement Receptor 1Flow Cytometry AnalysisCR1 Density MeasurementImmunostaining ProtocolAntibody Amplification SystemBlood Cell PreparationFluorescence DetectionReceptor QuantificationDisease Biomarker AnalysisCell Surface Markers

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