乾燥した後のヒト角膜上皮細胞の代謝活性に及ぼす人工涙液製剤の効果

サマリー

このプロトコルの目的は、異なる人工涙液製剤が、インビトロモデルを用いてヒト角膜上皮細胞を乾燥から保護できるかどうかを評価することです。人工涙液製剤および乾燥液への曝露後、ヒト角膜上皮細胞は代謝活性について評価される。

要約

人工脂質含有涙液製剤は、欠損した涙液脂質層の回復によって涙液蒸発を低減するために開発される。細胞乾燥を防ぐ人工涙液製剤は、眼表面保護および細胞代謝活性の維持をもたらす。脱水の間、細胞は代謝活性の喪失と、その後の細胞死の過程を受ける。本研究は、人工涙液製剤の有効性を評価する方法を説明する。代謝色素(すなわち、alamarBlue)は、低蛍光分子レサズリンから生細胞における蛍光分子再ソルフィンに変化する。人工涙液製剤の生物学的性能は、(a)細胞生存能を維持する製剤の能力として測定され、(b)乾燥から細胞保護を提供する。増殖培地と生理乾燥は、細胞の生存率/乾燥試験のコントロールとして使用されます。細胞は30分間の試験溶液でインキュベートされ、37°Cおよび45%の相対湿度で0または5分間乾燥する。最初の曝露後および細胞乾燥後の細胞代謝活性が決定される。結果は、細胞代謝活性および乾燥保護に対するアイドロップ製剤の比較効果を示す。この方法は、蒸発ドライアイで個人を治療するように設計されたドライアイ製剤をテストするために使用することができます。

概要

複数用量の眼科溶液中の多くの異なる成分は、安定性、pH、浸透性、および有効性を維持するために必要とされる。しかしながら、眼溶液中の防腐剤や界面活性剤のようないくつかの化学物質は、角膜上皮^1、2に損傷を与える可能性がある。ヒト角膜上皮細胞(HCEC)を用いた細胞生存率試験は、眼科製剤中のこれらの様々な成分によって引き起こされる潜在的な損傷を評価するために行うことができる。細胞損傷を評価するのに特に有用であるインビトロアッセイの1つは、alamarBlueアッセイ³である。このアッセイでは、代謝染料(すなわち、alamarBlue)は、細胞生存率指標として機能するレサズリンを含有する。細胞呼吸中、レサズリンは電子⁴を受け入れることによってレゾルフィンに還元される。レソルフィンの還元は、非蛍光分子から分光フルオロメーター⁵を用いて検出できる蛍光分子への変化を引き起こす。

この調査は、角膜上皮細胞の2つの異なる治療法を使用して、ドライアイ製品がインビトロモデルでどのように行われるかを決定する。最初の評価では、細胞は30分間これらの製品で処理されます。治療後、細胞はドライアイ製品への暴露直後および回復時間間隔の後に代謝活性について評価される。この評価は、湿度チャンバ内の乾燥前の細胞に対するこれらの製品の効果を決定します。これらの溶液中の溶液保存剤、界面活性剤または緩衝剤は、代謝染料を用いて検出することができる細胞に対して何らかの細胞毒性作用を有し得る。

第2の評価は、ドライアイ産物および乾燥物への曝露後の細胞の代謝活性を決定する。この評価では、製品治療が乾燥障害から細胞に保護を提供する場合、細胞の代謝活性が維持される。乾燥の有害な影響からの細胞保護は、ドライアイ製品が脂質で細胞をコーティングすることができる場合、または製品が細胞に水分を加える周囲から液体を吸収する可能性がある場合に発生する可能性があります。

このプロトコルは、細胞の環境ストレスの厳しい条件をシミュレートするように設計されています。他の研究では、この外部応力を作成するためにさまざまなモデルを使用しています。いくつかの研究は、層流フード^6、7、8の細胞を乾燥させたが^、他の研究は室温および様々な相対湿度(RH)値^9、10、11を使用している。ドライアイ条件をシミュレートする方法は、インキュベート溶液^12,13の浸透率を高めること^である。有害な環境条件をシミュレートするためのもう一つのin vitro方法は、乾燥眼患者¹⁴の涙液をシミュレートするために細胞培地にサイトカインを添加するものである。これらのテストは、化学物質が浸透ストレスを軽減したり、免疫系を刺激したりする方法を評価できる興味深いモデルですが、これらのモデルは、化学製剤が乾燥ストレスから細胞を保護する方法を直接示していません。

乾燥モデルは温度/湿気の部屋37 °Cおよび45%RHを使用する。これは、眼表面からの蒸発を引き起こす可能性のある環境条件をシミュレートします。航空機のキャビン¹⁵ や冬季¹⁶ の屋内環境で見られる低湿度などの他の極端な環境条件のシミュレーションもこの方法を使用して行うことができる。

細胞培養モデリングは、乾燥ストレスがヒト角膜に及ぼす影響をシミュレートするために使用されます。細胞ストレスを検出するために、細胞の生存率試験を行い、細胞の健康への影響を判断します。細胞に対していくつかの異なる生理学的検査を行い、ストレス^が17個あるかどうかを判断することができる。この試験手順で行った分析は、市販の代謝色素(材料表)を使用する。それは、非毒性であり、増殖培地に可溶であり、細胞固定¹⁸なしで細胞を評価できるという点で、他の多くの細胞ストレス試験に対して利点を有する。この手順では、細胞は各処置の直後に代謝活性について試験され、2番目のセットの細胞は成長培地に戻され、18時間の回復後に評価される。直ちに、そして回復期間の後にテストする理由は、代謝活性および遅延効果を引き起こす細胞損傷に即時の影響を引き起こす細胞損傷を特定することです。また、これらの製剤が短期的な損傷と長期的な損傷に及ぼす影響、および製剤が最初の侮辱から回復/回復しない能力を評価する機会を提供する。

この調査は、乾燥の有無にかかわらずHCEC代謝活性に及ぼす影響について、様々な脂質含有ドライアイ製品を比較するために使用されます。テストしたドライアイ製品の成分は、 材料表に記載されています。溶液中の#1成分は、カルボキシメチルセルロースナトリウム(0.5%)、グリセリン(1%)、ポリソルベート80(0.5%)、溶液中の軽い鉱物油(1.0%)#2そして、ミネラルオイル(4.5%)、および溶液中で脂質#3は、鉱油およびプロピレングリコールがデマルセントである。これらの脂質は、脱湿からHCECの保護を提供することが期待される製剤成分である。

プロトコル

1. ヒト角膜上皮細胞培養

1. コラーゲンコーティングされた75cm²フラスコで不死化HCEC¹⁹を成長させ、ダルベックの修飾イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM/F12)の10%の胎児血清(FBS)と1%のペニシリン/ストレプトマイシンを5%CO2で37°Cで含有する。
   メモ:振る必要はありません。
2. メディアを 2~3 日ごとに変更します。

2. 検査用細胞の調製

1. 細胞がほぼコンフルエント除去培養培地後。
2. 各75 cm² フラスコに4-6 mLの細胞の解離液を加えます。細胞が剥離するまで(約20〜30分)、顕微鏡で定期的にチェックするまで、細胞を37°Cでインキュベートします。
3. 10% FBS を含む DMEM/F12 の 2-6 mL を各 75 cm² フラスコに追加します。
4. フラスコの内容物を50 mL遠心管に移します。
5. 450~500 x g で5分間遠心分離します。上清をパイプアウトし、事前に温められた媒体で細胞を再中断します。
6. ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。合計 1 x 10^{5 個} のセルを含むメディアの量を計算します。
7. 48ウェルコラーゲン-1コーティングされた培養プレートの各ウェルに1 x 10⁵ 細胞を加えます。井戸内のメディアの最終容積が10%FBSで培養DMEM / F12の0.5 mLになるように十分なメディアを井戸に追加します。
   注:人工涙液製剤は、HCECの代謝活性の低下によって測定することができる細胞毒性を引き起こす可能性があります。データの整合性は、シード時に各ウェルに同じ数の HCEC を追加することに依存します。48ウェルプレートに推奨される培養濃度は1 x 10^5です。哺乳動物細胞は再懸濁後に遠心分離管に沈着する可能性があるため、細胞懸濁液が均一に分布するようにプレートに細胞を播種しながら、頻繁に撹拌することによって細胞を再懸濁することが推奨される。
8. 細胞を37°Cで_、CO2 を24時間5%インキュベートします。

3. 乾燥プロトコルなし

1. 制御手順
   1. 24時間インキュベーション後、プレートから培養培地を取り出す。
   2. 150 μLの試験製剤およびメディア制御ソリューションですぐに処理します。
   3. 37°Cで細胞をインキュベートし、30分間_CO2 を5%で培養します。
   4. セルからテスト ソリューションを削除します。
   5. 代謝活性をテストするために10%の代謝染料溶液の0.5 mLを加えます。37°Cおよび5%CO2で細胞を別の4時間インキュベートする。
   6. 4時間のインキュベーション期間の後、各ウェルから100μLの代謝染料溶液を取り除き、各100 μLを96ウェルプレートのウェルに入れる。
   7. 蛍光プレートリーダー(材料表)を用いて各ウェルの蛍光を測定する。励起波長を540nm、発光波長を590nmに設定します。
2. デシケーションプロトコルなし(回復手順)
   1. ステップ 3.1.1-3.1.4 を繰り返します。
   2. 各ウェルに0.5 mLのDMEM/F12メディアを追加します。
   3. 37°Cおよび5%CO2で18時間培養1セットをインキュベートする。
   4. 培地を取り除き、10%の代謝染料溶液の0.5 mLを加えます。ステップ 3.1.6 と 3.1.7 を繰り返します。

4. デシネーションプロトコル

1. 制御手順
   1. 24時間インキュベーション(ステップ2.8)後、プレートから培養培地を取り出す。
   2. 150 μLの試験製剤およびメディア制御ソリューションですぐに処理します。
   3. 37°Cで細胞をインキュベートし、30分間_CO2 を5%で培養します。
   4. セルからテスト ソリューションを削除します。
   5. 細胞を37°Cおよび45%RHチャンバーに5分間置き、細胞を脱生物する。
   6. 代謝活性をテストするために、10%の代謝染料溶液の0.5 mLを加えます。37°Cおよび5%CO2で細胞を別の4時間インキュベートする。
   7. 4時間のインキュベーション期間の後、各ウェルから100μLの代謝染料溶液を取り除き、各100 μLを96ウェルプレートのウェルに入れる。
   8. 蛍光プレートリーダーを用いて各ウェルの蛍光を測定します。励起波長を540nm、発光波長を590nmに設定します。
2. 回復手順
   1. 手順 4.1.1~4.1.5 を繰り返します。
   2. 各ウェルに0.5 mLのDMEM/F12メディアを追加します。
   3. 37°Cおよび5%CO2で18時間培養1セットをインキュベートする。
   4. 培地を取り除き、10%の代謝染料溶液の0.5 mLを加えます。ステップ 4.1.7 と 4.1.8 を繰り返します。

5. データ分析

1. メディアコントロールの平均蛍光を計算します。次の式を使用して、サンプルの生存率の割合を計算します。
   サンプルの生存率=蛍光/培地制御のサンプルの蛍光/培地制御 x 100
   注: メディア制御の平均は 100% 実行可能性です。代謝染料自体は、それに関連する少量の蛍光を有する。代謝色素試薬の蛍光は、培地制御に対する試験試料の生存率を計算する前に、コントロールおよび試験サンプル蛍光から差し引くことができる。
2. コントロールとテストサンプルで正規性検定と等分散検定を実行します。
3. 正規性検定が合格し、分散が等しい場合は、一方向の分散を実行します。特定のグループ間の有意な違いを特定するために、ペアワイズ比較後のテスト(すなわち、TukeyまたはDunnettの複数比較検定)を実行します。
4. 正規性検定が合格し、分散が異なる場合は、ウェルチのANOVAを実行します。特定のグループ間の有意な違いを特定するために、臨時テスト(つまり、ダネットまたはゲームハウエルの複数比較テスト)をペアワイズ比較を行います。
5. 正規性検定が失敗した場合は、ノンパラメトリック検定(つまり、クルスカル-ウォリス検定)を使用します。特定のグループ間の有意な違いを特定するために、ペアワイズ比較後のテスト(すなわち、ダンの検定)を実行します。

結果

3つのドライアイ製剤を比較した研究の結果を 図1に示す。この図は、3つの製品、溶液#1、ソリューション#2、ソリューション#3(材料表)がHCECの実行可能性に及ぼす影響に違いがあることを示しています。溶液#1および溶液#2は、乾燥前のHCECの代謝活性に有意な影響を及ぼした。これは、HCECの代謝活性を破壊することができるこれらの製品に製剤成分があることを意味します。溶液#1にさらされた細胞の18時間の回復後に起こった細胞代謝活性のさらなる低下は、HCECが最初に負傷し、18時間後に傷害が修復されないことを示している。それに比べて、溶液#3 HCECの代謝活性に軽度の影響しか及ぼしていなかった。

図2 は、これらの脂質含有ドライアイ製剤が細胞保護に及ぼす影響を示す。18時間の回復間隔で約0%HCEC代謝活性を有し、溶液#1および溶液#2は、乾燥ストレスから細胞を保護しなかった。しかし、#3解決策は、乾燥ストレスに対してある程度の保護を提供した。

図1:ドライアイ脂質強化産物が細胞生存率に及ぼす影響 脂質含有ドライアイ産物による治療後のHCEC代謝活性により測定された相対的な生存率。* = #3 適切な回復期間のメディア制御に対するΔ=統計的有意性(p<0.05)に対する統計的有意性(p<0.05)。バーの高さは平均値を表し、誤差範囲は SD です 。

図2:乾燥防止に対するドライアイ脂質増強製品の効果 細胞保護に対する脂質含有ドライアイ製剤の効果溶液#1および溶液#2は、乾燥ストレスから細胞を保護しておらず、時間の経過とともに乾燥効果から回復しなかった。対照的に、溶液#3は、乾燥ストレスに対するいくつかの保護を提供した。* = p <溶液#3に対して 0.05、Δ = p < 0.05 を適切な回復時間に対して未処理(制御)メディアと比較して行います。バーの高さは平均値を表し、誤差範囲は SD です 。

ディスカッション

このプロトコルは、細胞乾燥に対する人工涙液の保護効果を決定するように設計されています。最初に、細胞は、細胞をコーティングするためにドライ点眼薬にさらされます。次に、細胞を乾燥させ、代謝活性をモニタリングして、製剤が乾燥ストレスの有害な影響を軽減できるかどうかを評価する。これらのステップは、ドライアイ製剤が角膜上皮細胞の全体的な生存率に及ぼす全体的な影響を理解するために重要である。

ドライアイ製剤の大部分が培養井戸から除去された後、細胞と接触している残りの分子の化学は細胞乾燥に影響を与える。一部の製品には、細胞の蒸発を最小限に抑える油のマイクロエマルジョンが含まれています²⁰.リンス後の摩擦分析を評価した研究では、ドライアイ製剤²¹の滞留時間の向上を示す指標となり得るドライアイ製剤の低摩擦の維持を示した。このアッセイの限界の1つは、乾燥保護は他の眼球低下製剤と比較して評価することができるが、この保護の持続時間は評価された短い乾燥時間のために決定することができないということである。このインビトロアッセイにおける乾燥時間が長い場合、細胞単層よりも全体的に多くの水分含有量を有する多層培養物の使用が必要となる。

細胞上の製剤の特定のインキュベーション時間と乾燥時間の持続時間は、温度および湿度値が変化した場合に調整する必要があります。乾燥した眼に寄与できる環境ストレス条件をシミュレートするための温度、RHおよび空気流量を選択することは、季節的および局所的な環境条件が非常に可変的である²¹となって困難であり得る。人間の研究のための現代の環境室は5°Cと35°Cの間の温度を変えることができる、および5%と^95%22の間のRH。気化計としっかりと取り付けられたゴーグルを使用して、40-45%のRHで角膜からの蒸発速度は0.037 μL/cm²/minであり、20-25%のRHでは蒸発速度は0.065 μL/cm²/分²³であると判断した。in vitroモデルが飛行機^15、砂漠、乾燥室内環境¹⁶のような極めて低いRH条件下での製剤の保護効果を見ている場合、細胞からの蒸発速度の向上に対応するためにインキュベーション時間を短縮する必要がある。ヒトの涙液中には、涙を蒸発から守る、マイボミアンや他の腺に由来する様々な脂質が存在する。これらの脂質は、融点が異なって^24.温度変化は涙液の流動性に影響を与える可能性があるため、周囲温度で行われたテストは37°Cで行われたテストとは大幅に異なる蒸発速度を持つことができます。 平均眼表面温度範囲は32.9~36°C25であるため、この温度範囲付近で試験を行うことをお勧めします。

このプロトコルで使用される代謝色素(alamarBlue)に加えて、細胞代謝活性に対する製品製剤の効果を評価するために使用できる他の化学試薬があります。テトラゾリウム塩(MTT、XTT、MTS、WST)は、使用することができる代替化学物質です。テトラゾリウム塩の違いは、MTTが正に荷電した分子であるため、生細胞²⁶の細胞質に入ることができる点である。MTTはNAD(P)H²⁷による減少後に不溶性になる。プレートリーダー上の吸光度を読み取る前に可溶化する必要があります。他のテトラゾリウム塩は負に帯電する^28.それらは細胞に入ることができず、細胞内分子²⁹と直接相互作用できないため、生細胞外の二次分子によって減少しなければならない。XTT、MTS、およびWST-1アッセイに関しては、電子カップリング剤1-メトキシフェナジンメトサルフェート(PMS)を添加することで、アッセイ³⁰の性能を向上させることができる。テトラゾリウム塩を使用する代謝アッセイとは対照的に、alamarBlueは追加の可溶化剤または電子結合剤を必要としない。また、XTT、MTSまたはWST-1とは異なり、alamarBlueは細胞膜に浸透し、細胞酵素^27、29によって直接減少させることができる。alamarBlueとテトラゾリウム塩を直接比較すると、alamarBlueはHCEC^{3、27、31、32}を含む様々な細胞株の代謝活性を評価する場合に感度が高いということが示されている。

他の生化学的エンドポイントは、乾燥によるヒト角膜上皮細胞の保護を評価するためにも考慮することができる。蛍光色素は、細胞膜透過性および細胞エステラーゼ活性¹を検出するために使用することができる。また、アポトーシスは、細胞表面上のアポトーシスマーカーの染色またはカスパーゼ活性^1,33の測定によって検出できる。他のアッセイは、HCECタイトジャンクション³⁴に対する眼科製品の影響を決定している。これらのアッセイは、本稿に記載されている乾燥手順を利用した将来の評価に組み込まれる可能性がある。

ドライアイの原因はたくさんあります。ドライアイは、涙の分泌の減少、眼表面の炎症の増加、または眼表面での脱水の増加によって引き起こされる可能性があります。乾燥状態の間に細胞が乾燥するのを防ぐドライアイドロップの蒸発ドライアイ使用を有する個人のために、ドライアイの症状を緩和することができる。いくつかのドライアイ製剤の問題の1つは、眼表面に害を与える可能性のある防腐剤の存在である。負傷細胞は、負傷した細胞が乾燥ストレス³⁵の影響を受けやすいため、より多くの細胞が死滅する可能性があり、ドライアイ患者には役に立たない。

Garrigueら³⁶ の最近のレビュー記事は、脂質ベースの製品が蒸発ドライアイを緩和するためにどのように作用するのかの現在の知識の評価を提供する。脂質欠乏性涙に脂質を加えることは、蒸発を防ぎ、細胞を乾燥から守ることができる。また、保湿剤は、眼表面³⁷で水を引き付け、保持する分子である。溶液中のグリセリン#1と溶液中のプロピレングリコール#3はいずれも保湿剤である。溶液#3は、製剤成分の脂質および保湿特性に起因する可能性のあるHCECのより大きな保護効果を示した。

このプロトコルは、ドライアイ製剤への暴露後のHCECの代謝活性と乾燥ストレスを評価するように設計されています。この記事で説明した方法を使用することで、蒸発ドライアイに苦しむ人々のために新しい非刺激性および保護点眼薬を開発することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
75 cm2 ベントフラスコ	コーニング	354485	これはBioCoatブランドのコラーゲンコーティング
96ウェルプレート	共演者	3370
alamarブルー	フィッシャーサイエンティフィック	ダル1025
コーニング48ウェルプレート	コーニング	354505	これはBioCoatブランドのコラーゲンコーティング
Cytation 5	BioTek	CYT5MPVです	280 - 700 nm (アッセイ 540/590)
DMEM/F12 と L-グルタミンと 15 mM HEPES	Gibco	11039-021	このメディアにはフェノールレッドはありません
胎児ウシ血清	Hycone	SH30396.03
ヒト角膜上皮細胞	オタワ大学	N/A	M. Griffith博士(オタワ眼研究所、オタワ、カナダ)のSV40不死化ヒト角膜上皮細胞は、Griffith M、Osborne R、Munger R、Xiong X、Doillon CJ、Laycock NL、Hakim M、Song Y、Watsky MAによって特徴付けられています。細胞株から構築された機能的なヒト角膜同等物。科学。1999;286:2169–72.
湿度/温度チャンバー	関連環境システム	LH-1.5	エコノミーライン 湿度チャンバー
ペニシリン ストレプトマイシン	Gibco	15140-122	100倍の濃度なので、メディアの各99mlに1mlを追加
リフレッシュオプティブアドバンスド(ソリューション#1)	アラガン株式会社		カルボキシメチルセルロースナトリウム(0.5%)、グリセリン(1%)、ポリソルベート80(0.5%)、-潤滑剤-不活性成分-ホウ酸;カルボマー共重合体タイプA;蓖麻子油;エリスリトール;レボカルニチン;純水;ピュライト(安定化オキシクロロ複合体)であり、pHを調整するために水酸化ナトリウムを含んでいる場合があります。
XP を落ち着かせる (ソリューション #2)	Bausch &ロム		軽質鉱物油(1.0%)、鉱油(4.5%)-エモリエント-不活性成分-ホウ酸、エデト酸二ナトリウム、オクトキシノール-40、ポリクオタニウム-1(防腐剤)、ポリソルベート80、精製水、ホウ酸ナトリウム十水和物。塩酸および/または水酸化ナトリウム(pH調整用)が含まれている場合があります。
Systane Complete(ソリューション#3)	株式会社アルコン		プロピレングリコール0.6%潤滑剤不活性成分-ホウ酸、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、エダテート二ナトリウム、ヒドロキシプロピルグアー、鉱物油、ポリオキシル40ステアリン酸、ポリクワッド®(ポリクオタニウム-1)0.001%防腐剤、 トリステアリン酸ソルビタン、ソルビトール、精製水。pHを調整するために、塩酸および/または水酸化ナトリウムが含まれている場合があります。
TrypLE Express(細胞解離溶液)	Fisher Scientific	12605036