このプロトコルは、クローン病の完全に検証されたTNBS誘導マウスモデルと、パラフィンに埋め込まれたホルマリン固定結腸切片の免疫蛍光を用いた免疫体化学によるエストロゲン受容体の視覚化方法を提示する。
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この記事について
サマリー
要約
クローン病は炎症性腸疾患の最も診断されたタイプです。腸内で発症する慢性炎症は、蠕動障害および腸粘膜の損傷を引き起こし、結腸新生物の変態のリスクの増加に関連していると思われる。蓄積された証拠は、エストロゲンとエストロゲン受容体がホルモン感受性組織だけでなく、肺や結腸などのエストロゲンに直接関係しない他の組織にも影響を与えることを示しています。ここでは、TNBS誘発クローン病のマウスモデルから得られた結腸におけるエストロゲン受容体の免疫蛍光染色に成功するためのプロトコルについて説明する。マウスおよび腸の準備におけるクローン病の誘導のための詳細なプロトコルと、ホルマリン固定パラフィン埋め込み腸切片を用いたステップバイステップの免疫ヒストリカル手順が提供される。記載された方法は、生体内でのエストロゲン受容体検出およびエストロゲンシグナル伝達の調査に有用であるだけでなく、大腸炎の発症に関与する可能性のある他のタンパク質にも適用することができる。
概要
クローン病(CD)は、慢性腸炎として現れる炎症性腸疾患(IBD)である。CDの病因は十分に理解されていないが、腸内微生物叢、食事やストレスなどの遺伝的および環境的要因を含むCDの発達を担っているように見えるいくつかの主要な要因がある1。クローン病の病因をよりよく理解するために、腸の炎症のいくつかのモデルが22、3、4、5、6、73,4,5,6を7使用されています。本稿では、CDの2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)誘導型マウスモデルから得られた結果を提示する。
エストロゲンは慢性腸炎88、9、10、11、129,10,11を調節できることが
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プロトコル
動物研究は、欧州議会および2010年9月22日の理事会の指令2010/63/EUに従って、地方倫理委員会(28/ŁB29/2016)の同意を得て実施されました。
1. クローン病のTNBS誘導マウスモデル
注:このプロトコルは、25〜28 gの雄BALB / Cマウスを使用しています。動物は一定の温度(22〜24°C)で収容され、相対湿度55±5%で収容され、標準的なチャウペレットと水道水アドリビタムへの自由なアクセスを持つ12時間の明暗サイクルで維持されます。
- 誘導室にマウスを置き、蓋をしっかりと閉じます。イソフルラン(1.5-2 L/分でO2流量で25%O2)でマウスを短時間麻酔します。
注意:呼吸数は通常よりもリズミカルで遅く、有害な刺激に反応して変化してはならない。 - カテーテルを介して遠位結腸に車体制御として0.9%NaClまたは0.9%NaClの0.1mLの30%エタノールで0.1mLの30%エタノールの4mgを植え付ける。
注:カテーテルは約3cmのアヌスに慎重に導入する必要があります。 - 体重、直腸出血、便の一貫性および死亡率を含む臨床パラメータのために2日目から8日目まで毎日マウスを監視する。
- 8日目に、頸部脱臼でマウスを安楽死させる。
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結果
TNBS誘発クローン病を有するマウスにおける結腸のマクロ的特徴
コントロールマウスおよびTNBS処置マウスから採取したコロンの代表的な画像を図2に示す。クローン病のTNBS誘発モデルを有するマウスでは、結腸の幅が増加する間、結腸の長さが減少する。
図2:対照マウス(対照)及びTNBS処置マウス(TNBS)から得られた代表的な結腸。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリ.......
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ディスカッション
IBD病態生理学検査には、遺伝的、免疫学的または自発的なモデル、ならびに化学的に誘発されたモデル15を含む多数の動物モデルがある。大腸炎のいくつかのタイプの動物モデルの中でも、このプロトコルに記載されているTNBS誘導モデルのような化学的に誘発されたモデルは、比較的安価で入手しやすい。大腸炎のTNBS誘発マウスモデルには、CDの病理学的基礎に関連するいくつかの臨床症状がある。誘発性大腸炎を有する動物は、一貫性のない便の形成、血まみれの下痢および体重の喪失によって特徴付けられる。しかし、これは、このモデルがCD病原病を排他的に研究するために使用することができることを意味するものではありません。TNBS誘導モデルは、例えば、潜在的な治療スクリーニングのために推奨され、一般的に使用される。化学的に誘発された大腸炎の場合、いくつかの重要な点を強調する必要があります。TNBSは、粘膜バリアを乱し、TNBSが腸壁を貫通し、高分子量タンパク質と相互作用することを可能にするエタノールで希釈されなければならない、細胞媒介免疫応答22、16、17。
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作品は、ウッチ大学当局の財政支援のおかげで発表されました: 科学研究副学長, 国家と国際協力のための副学長と生物学と環境保護学部の学部長.ダミアン・ジャセニクは、ポーランド国立科学センターからの助成金(2017/24/T/NZ5/00045と2015/N/NZ5/00336)によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Animals | |||
| BALB/Cマウス | ウッチ大学 | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| 段ボールブロック | NA | NA | |
| 共焦点顕微鏡 - TCS SP8 | ライカバイオシステム | ズ NA | |
| 全自動回転式ミクロトーム - RM2255 | ライカバイオシステム | ズ NA | |
| ガラススライド | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| 加熱パラフィン包埋モジュール - EG1150 H | ライカバイオシステム | ズ NA | |
| 組織学ボックス | マルフォ | LN.138747 | |
| 疎水性ペン | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| 実験室用天びん | Radwag WL-104-0048 | ||
| LAS Xソフトウェア | ライカバイオシステム | ズ NA | |
| 金属金型 | マルフォア | CP.5105 | |
| 滅菌ガーゼ | NA | ||
| 滅菌ハサミ | NA | NA | |
| 滅菌ピンセット | NA | ||
| ティッシュプロセッサー - TP1020 | ライカバイオシステムズ | NA | |
| strong>Reagents | |||
| 2, 4, 6-トリニトロベンゼンスルホン酸 | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| ウシ血清アルブミン | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 二次抗体 | Abcam | ab96886 | |
| ERα 一次抗体 | Abcam | ab75635 | |
| ERβ 一次抗体 | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER 一次抗体 | Abcam | ab39742 | |
| 塩酸 | アバンター パフォーマンスマテリアルズ ポーランド | 575283421 | |
| ペルオキシダーゼ水素 | アバンター パフォーマンス マテリアルズ ポーランド | 885193111 | |
| イソフルラン(フォラン) | バクスター | 1001936040 | |
| ノーマル ヤギ血清 | ギブコ | 16210064 | |
| パラフィン | ライカバイオシステムズ | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| 生理食塩水 | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI(グリセロールベースの液体 with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| 塩化ナトリウム | Chempur | WE/231-598-3 | |
| クエン酸ナトリウム | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performanceマテリアル | BA0860119 |
参考文献
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96<....
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