ゼブラフィッシュ幼虫に対する環境汚染物質の神経行動効果の研究

サマリー

この論文では、ゼブラフィッシュ幼虫モデルを用いた環境汚染物質の神経行動毒性の評価について、暴露プロセスや神経行動指標の検査を含む詳細な実験プロトコルを提示する。

要約

近年、特に生物の初期の開発段階では、ますます多くの環境汚染物質が神経毒性であることが証明されています。ゼブラフィッシュ幼虫は、環境汚染物質の神経行動研究の優れたモデルです。ここでは、胚の収集、暴露プロセス、神経行動指標、試験プロセスを含むゼブラフィッシュ幼虫を用いた環境汚染物質の神経毒性の評価に詳細な実験プロトコルが設けられる。データ分析を行います。また、培養環境、暴露プロセス、および試験条件を、アッセイの成功を確実にするため議論される。このプロトコルは、精神病薬の開発、環境神経毒性汚染物質の研究に使用されており、対応する研究を行うか、機械学的研究に役立つ最適化が可能です。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ幼虫に対する神経行動効果を研究するための明確な操作プロセスを示し、様々な神経毒性物質または汚染物質の影響を明らかにすることができる。

概要

近年、ますます多くの環境汚染物質が神経毒性^{1、2、3、4}が証明されている。しかし、環境汚染物質にさらされた後の生体内の神経毒性の評価は、内分泌破壊や発生毒性の場合ほど容易ではありません。さらに、汚染物質への早期暴露、特に環境関連用量で、毒性試験^{5、6、7、8}で注目を集めている。

Zebrafishは、環境汚染物質にさらされた後の早期発生時の神経毒性研究に適した動物モデルとして確立されています。ゼブラフィッシュは、受精後に他の種よりも速く発達する脊椎動物です。幼虫は、絨毛膜の栄養素が7日間の受精後(dpf)9のためにそれらを維持するのに十分であるため、餌を与える必要はありません。幼虫は、〜2dpfで絨毛から出出て、観察、追跡、定量化、および行動計器10、11、12、13から始まる3-4 dpf 14、15、16、18を使用して自動的に観察、追跡、定量化、および分析することができる水泳や旋回などの行動を開発する。また、ハイスループット試験は行動計測器でも実現できます。したがって、ゼブラフィッシュ幼虫は、環境汚染物質¹⁹の神経行動研究のための優れたモデルである。ここでは、ハイスループットモニタリングを使用して、光刺激下のゼブラフィッシュ幼虫に対する環境汚染物質の神経行動毒性を研究するプロトコルを提供しています。

我々の研究室は、2,2',4,4'-テトラモジフェニルエーテル(BDE-47)20,21,6'-ヒドロキシ/メトキシ-2,2',4,4'-テトラブロの神経行動毒性を研究しました この提示されたプロトコルを用いた、デカ臭素化ジフェニルエーテル(BDE-209)、鉛、および市販の塩素化パラフィン²³を用いた、モディフェニルエーテル(6-OH/MeO-BDE-47)22。多くの研究室は、幼虫または成魚24、25、26、27に対する他の汚染物質の神経行動効果を研究するためにプロトコルを使用しています。この神経行動プロトコルは、胚性ゼブラフィッシュ²⁷におけるビスフェノールAおよび置換ビスフェノールSへの低用量暴露が早期視床下部神経新生を誘発したことを示す機械学的支持を提供するために使用された。さらに、一部の研究者は、対応する研究を実行するためにプロトコルを最適化しました。最近の研究では、カゼインコーティングされた金ナノ粒子(βCas AuNPs)を用いた、簡分でハイスループットのゼブラフィッシュモデルでアミロイドベータ(Aβ)の毒性を排除しました。ゼブラフィッシュ幼虫および隔離脳内Aβ42の血液脳関門を横切って移入された全身循環におけるβCas AuNPsが、行動病理学²⁸によって支持された非特異的なシャペロン様様式で毒性を惹起することを示した。

移動、経路角、および社会的活動は、提示されたプロトコルの汚染物質にさらされた後のゼブラフィッシュ幼虫の神経毒性効果を研究するために使用される3つの神経行動指標である。移動は幼虫の泳ぎ距離によって測定され、汚染物質にさらされた後に損傷を受ける可能性があります。経路角と社会活動は、脳と中枢神経系²⁹の機能とより密接に関連している。パス角度とは、泳ぐ方向³⁰に対する動物の動きの経路の角度を指す。~-180°~+180°から8つの角度クラスがシステムに設定されています。比較を簡素化するために、最終結果の6つのクラスは、以前の研究^21,22に従って、ルーチンターン(-10°〜0°、0°、0°〜+10°)、平均ターン(-10°〜-90°、+10°〜+90°)、応答性ターン(-180°〜-90°、+180°)として定義されます。2魚の社会活動は、グループのショアリング行動の基本です。ここで、有効な2つの幼虫間の距離<0.5cmは社会的接触と定義される。

ここで提示されたプロトコルは、ゼブラフィッシュ幼虫に対する神経行動効果を研究するための明確なプロセスを示し、様々な物質または汚染物質の神経毒性効果を明らかにする方法を提供する。このプロトコルは、環境汚染物質の神経毒性の研究に興味のある研究者に利益をもたらします。

プロトコル

この議定書は、同済大学動物倫理委員会によって承認されたガイドラインに従っています。

1. ゼブラフィッシュ胚コレクション

1. 健康な大人のチュービンゲンゼブラフィッシュの2組を暴露前の夜に産卵箱に入れ、性比を1:1に保ちます。
2. 翌朝、日光の後に30〜60分システムに戻って成魚を取り外します。
3. 産卵箱から胚を取り出します。
4. 胚を系水ですすいでください。
5. 十分なシステム水で胚をガラスのペトリ皿(直径9cm)に移します。
6. 顕微鏡下で胚を観察し、後で暴露するために健康な胚を選択する。
   注:健康な胚は、通常、顕微鏡の下で薄い黄金色で透明です。不健康な胚は通常、薄く、顕微鏡下で観察されるように一緒に集まる。

2. 露光前の準備

1. ゼブラフィッシュブック³¹のガイドラインに従ってハンクスのソリューションを準備します。
   注:ハンクスのソリューションには、0.137 M NaCl、5.4 mM KCl、0.25 mM Na₂HPO 4、0.44 mM KH 2 PO_4、1.3mM CaCl_2、1.0mM MgSO_4、および 4.2 mM NaHCO₃が含まれます。
2. 滅菌水を使用してハンクスの溶液を10%ハンクス溶液に希釈します。
3. 10% ハンクスのソリューションの 999 mL に DMSO の 1 mL を追加して、0.1% DMSO を含む 10% ハンクスのソリューションの制御ソリューションを作ります。
   注: 次の手順では、露出ソリューションの例として BDE-47 を使用します。
4. 5 mg/mL の標準露光液を作るために 100% DMSO の 1 mL のきちんとした BDE 47 の mg を溶解します。.
5. 5 mg/mL溶液を1分間ボルテックスし、DmSOでBDE-47を完全に溶解させた。
6. 5 mg/mL溶液の10μLを12mLの茶色のガラス瓶に移します。
7. 殺菌水を10mLの最終体積に加えて、BDE-47露光溶液5mg/LおよびDMSO比を0.1%、次いで1分間渦とする。
8. 5 mg/L溶液の10μLと100μLをそれぞれ2つの100 mL体積フラスコに移します。
9. 0.1% DMSO (ステップ 2.3 で準備) を含む 10% ハンクス溶液を 100 mL に加えて、BDE-47 露光液の最終濃度を 5 μg/L および 50 μg/L にします。
10. 溶液を100mLの茶色のガラス瓶に移し、4°Cで保管します。

3. 胚の暴露

1. 3つのガラスペトリ皿(直径6cm)3〜5時間後受精(hpf)のそれぞれに50個の胚を移す。
2. 1 mL ピペットチップを使用して、胚の周りのシステム水をブロットします。
3. コントロールと2つのBDE-47露光溶液(コントロール、5 μg/L、50 μg/L)をそれぞれ3つのガラスペトリ皿に移すためにピペットを使用してください。
4. ガラスのペトリ皿を一つずつやさしく振って、胚をプレートの底に分散させます。
5. ガラスのペトリ皿を28.5 °Cの下のライトインキュベーターに入れます。
6. 露出ソリューションの半分を 5 dpf まで 24 時間ごとに更新します。
7. 1 dpf と 2 dpf のすべてのグループの死んだ胚を確認し、死亡率を計算します。
8. 2 dpf および 3 dpf で各グループのインキュベートされた胚をチェックし、ハッチングの可能性を計算します。
9. 幼虫が絨毛から出てきた毎日の変形を確認し、すべての群の変形率を計算する。
   注:変形指標には、心膜嚢胞、脊髄湾曲、尾湾曲、他の因子³²が含まれる。

4. 行動テストの準備

1. 移動とパス角テスト用に48ウェルマイクロプレートを準備し、5dpfの朝の社会活動テスト用に6つのウェルマイクロプレートを3つ用意します。
2. 48ウェルマイクロプレートのすべてのウェルに800μLの露光液を移します。
   注:グループごとに16個の井戸を使用します(すなわち、制御溶液、5 μg/L、および50 μg/Lグループ)。
3. 1 mL ピペットチップを使用して、ガラスペトリ皿から 1 つの幼虫を使用して 200 μL の暴露溶液を 48 ウェルマイクロプレートの 1 つのウェルに移します。
4. 露光液の4 mLを6ウェルマイクロプレートのすべてのウェルに移す。
   注:グループごとに6つのウェルマイクロプレートを1つ使用してください。
5. 1 mL ピペットチップを使用して、2 つの幼虫を含む 200 μL の暴露溶液を 6 ウェルマイクロプレートの各ウェルに移します。
   注: すべてのグループに 6 つの繰り返しグループがあります。
6. 試験室の温度が試験前に28°C2時間であることを確認してください。
   注: 行動テストは通常午後に行われます。

5. 行動テスト

1. 移動とパス角試験
   1. コンピュータデスクのランチャーアイコンをクリックして、ハイスループットの監視エンクロージャを制御するソフトウェア(「マテリアルの表」を参照)を開いてプログラムを開始します。
   2. 動作インターフェイスに入るには、「トラッキング、回転、パス角度」モジュールを選択します。
   3. ステップ4.3で準備した48ウェルマイクロプレートを記録プラットフォームに移し、カバーを引き下げろ。
   4. ソフトウェアで次に [ファイル]をクリックし、新しいプロトコルの生成を開始します。
   5. "場所数" の位置に「48」と入力し、[OK]ボタンをクリックします。
   6. ソフトウェアの [パラメータ] - [プロトコル パラメータ] をクリックします。実験時間を1時間10分に設定し、積分期間を60 s³³に設定します。
   7. 検出された領域を描画します。
      1. 楕円形を選択し、左上の最初の円を描きます。
      2. 円を選択し、"コピー" " "右上のマーク" " 貼り付け"選択" ボタンをクリックし、マウスを使用して、コピーした円を右上にドラッグします。
      3. 円を選択し、"コピー" " " 下マーク" "貼り付け" 選択 " ボタンを順にクリックし、マウスを使用してコピーした円を右下にドラッグします。
      4. 次に [ビルド] の[マークのクリア] ボタンをクリックします。
         メモ:システムはプレートの他のすべてのウェルを自動的に描画します。新しく作成された領域は、実際の魚と井戸の側面にその反射の間で各井戸に完全にフィットする必要があります。
   8. [尺度の描画] ボタンをクリックし、画面にキャリブレーションライン (マイクロプレートの斜めまたは平行線) を描画し、その長さを入力して「単位」を設定します。次に、[グループに適用]ボタンをクリックします。
   9. ソフトウェアで、動物の色を "黒" に設定します。
   10. 動物の検出を可能にするために検出閾値を16〜18に設定する。
   11. 入力非アクティブ/小・小/大速度をそれぞれ0.5cm/sおよび2.5cm/sで入力します。
   12. パス角度クラスを設定します。入力 "-90, -30, -10, 0, 10, 30, 90" と入力し、-180°+180°からパス角クラスを作成します。
   13. ライト条件を設定する
       1. 次の3 つのトリガー方法の 1 つを使用して、光の状態を設定する" パラメーター ""ライト駆動" をクリックします。
       2. 「エッジ」ボタンを選択し、10分の暗い期間を設定し、続いて10分の光と暗い期間を交互に3サイクルを設定します。
   14. プロトコルを保存し、テストルームのライトを下げる。
   15. システム内の幼虫を 10 分間順応し、次に "実験" " [実行] ボタンをクリックし、実験ファイルを保存するフォルダーを選択して、結果の名前を入力します。
   16. 次に [バックグラウンド]ボタンをクリックしてテストを開始します。
   17. 次に [実験] ボタン [停止] をクリックすると、テストが終了したときに実験が停止します。
       メモ:システムが停止したときにテストされたデータが表示されます。データには、3 つの速度クラスでの追跡距離と、毎分 8 つの角度クラスのパス角度番号が含まれます。提示例における移動試験では、全光周期(10分)の総距離と対照群と治療群の差を比較した。
   18. 48ウェルマイクロプレートを他の実験のために光インキュベーターに戻します。
2. 社会活動テスト
   1. コンピュータデスクのランチャーアイコンをクリックして、ハイスループットの監視エンクロージャを制御するソフトウェアを開き、プログラムを起動します。
   2. 「ソーシャルインタラクション」モジュールを選択して、操作インタフェースに入ります。
   3. ステップ4.4で準備した6ウェルマイクロプレート(コントロールグループ)を記録プラットフォームに移し、カバーを引き下げる。
   4. ソフトウェアで次に [ファイル]をクリックし、新しいプロトコルの生成を開始します。
   5. "場所の数" の位置に「6」と入力し、[OK]ボタンをクリックします。
   6. ソフトウェアの [パラメータ] - [プロトコル パラメータ] をクリックします。実験時間を1時間10分に設定し、積分期間を60sに設定します。
   7. 検出された領域を描画します。
      1. 楕円形を選択し、左上の最初の円を描きます。
      2. 円を選択し、[コピー] の [上の右マーク] の [貼り付け]ボタンをクリックし、マウスを使用して、コピーした円を右上のウェルにドラッグします。
      3. 円を選択し、"コピー" " " 下マーク" "貼り付け" 選択 " ボタンを順にクリックし、マウスを使用してコピーした円を右下にドラッグします。
      4. 次に [ビルド] の[マークのクリア] ボタンをクリックします。
         注:新しく作成された領域は、それぞれよく、実際の幼虫と井戸の側面の反射の間に完全にフィットする必要があります。
   8. [尺度の描画] ボタンをクリックし、画面にキャリブレーションライン(マイクロプレートの斜めまたは平行線)を描画し、その長さを入力して「単位」を設定します。次に、[グループに適用]ボタンをクリックします。
   9. 動物の検出を可能にするために検出閾値を16〜18に設定する。
   10. ソフトウェアの「黒い動物」ボタンをクリックします。
   11. ソフトウェアで [距離のしきい値] ボタンを選択し、入力 "5" を入力します。
   12. ライト条件を設定します。
       1. 次の3 つのトリガー方法の 1 つを使用して、光の状態を設定する" パラメーター ""ライト駆動" をクリックします。
       2. 「エッジ」ボタンを選択し、10分の暗い期間を設定し、続いて10分の光と暗い期間を交互に3サイクルを設定します。
   13. プロトコルを保存し、部屋のライトを下げる。
   14. システム内の幼虫を 10 分間順応し、次に "実験" " [実行] ボタンをクリックし、実験ファイルを保存するフォルダーを選択して、結果の名前を入力します。
   15. 次に [バックグラウンド]ボタンをクリックしてテストを開始します。
   16. 次に[実験] ボタン [停止] をクリックし、テストが終了したときにソフトウェアでの実験を停止します。
       メモ:システムが停止したときにテストされたデータが表示されます。
   17. 6ウェルマイクロプレート(対照群)を他の実験のために光インキュベーターに戻す。
   18. 6つのウェルマイクロプレート(5μg/Lおよび50 μg/Lグループ)を記録プラットフォームに移し、そのステップを5.2.4から5.2.17までを序数で繰り返します。

6. データ分析

1. スプレッドシート ファイルを移動とパスの角度の結果で開きます。
2. 3 つの距離列 (inadist、 smldist、 lardist) を選択して、それらを加算します。
   注: inadist、 smldist、およびlardistのデータは、それぞれ異なる速度クラス (非アクティブ/小/大) でシステムによって記録される異なる距離を意味します。
3. 10分毎の光周期は、すべての井戸の距離を合計し、16の井戸の平均距離を計算し、光刺激の下で3つのグループのデータを比較します。
4. 10分ごとに、cl01からcl08までの全ての光の持続時間におけるすべての井戸の角度数を集計し、光刺激の下で3つのグループのデータを比較する。
   注: cl01からcl08までの列のデータは、それぞれ異なるパス角度でシステムによって記録される異なるパス角度番号を意味します。
5. ソーシャル アクティビティの結果でスプレッドシート ファイルを開きます。
6. contctとcontdur列を選択し、10 分の光の期間ごとに、すべてのウェルのソーシャル タイムとその期間を合計します。
7. すべての光の持続時間で1つのグループの平均社会時間と持続時間を計算し、光刺激の下で3つのグループのデータを比較します。

結果

ここでは、光刺激下でゼブラフィッシュ幼虫を用いた環境汚染物質の神経行動効果を調えるためのプロトコルを説明する。移動、パス角度、およびソーシャルアクティビティテストは、導入で定義されています。移動およびパス角度テストにおけるマイクロプレートの設定とソフトウェアの画像を以下に示します。また、独自の研究成果を例に挙げています。BDE-47および6-OH/MeO-BDE-47への曝露後の移動とパス角の効果を2つの研究が紹介する。第3の研究は、4つの市販の塩素化パラフィンが社会的行動に及ぼす影響を提示する。

48ウェルマイクロプレートのセットアップと移動および経路角試験における幼虫の運動軌跡。
プロトコルには、1つの対照群と2つの治療群を含む3つのグループが使用された。すべてのグループは16匹の動物を持つことができるので、システムは1つのマイクロプレートで移動および進路角のハイスループットテストを行うために使用することがで...

ディスカッション

本研究は、ゼブラフィッシュ幼虫を用いた環境汚染物質の神経毒性を評価するための詳細な実験プロトコルを提供する。ゼブラフィッシュは、暴露期間中に胚から幼虫までのプロセスを経るが、これは胚と幼虫の良いケアが不可欠であることを意味する。胚や幼虫の発生に影響を与えるものは、最終的な結果に影響を与える可能性があります。ここでは、培養環境、露光プロセス、および実験条件について、アッセイ全体の成功を確実にする。

培養環境では、ゼブラフィッシュ胚および幼虫は、~28°Cの安定した温度で生活しています。この研究では、光条件を自動的に設定し、温度を安定に保つことができる光インキュベーターを使用して胚および幼虫を収容する。胚は1dpfと2 dpfで絨毛膜から出てこないので、暴露溶液を更新する際に孵化していない胚に損傷を与えないように注意する必要があります。また、溶液中のDMSOの比率は0.1%34、35未満にする必要があり^、新鮮な露光溶液は、それが更新のために使用される前に28°Cでなけれ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
48ウェルマイクロプレート	Corning	3548	Embyros ハウジング
6ウェルマイクロプレート	Corning	3471	Embyros ハウジング
BDE-47	AccuStandard	5436-43-1	汚染物質
DMSO	Sigma	67-68-5	共溶媒
顕微鏡	オリンパス	SZX 16	観察装置
ピペット	エッペンドルフ	3120000267	トランスファーソリューション
Zebrabox	Viewpoint	ZebraBox	ビヘイビア機器
Zebrafish	Shanghai FishBio Co., Ltd.	Tubingen	Zebrafishサプライヤー
ZebraLab	Viewpoint	ZebraLab	Behaviorソフトウェア