質量分析誘導ゲノムマイニングプロトコルが確立され、ここに記載されています。ゲノム配列情報とLC-MS/MS解析に基づき、複雑な微生物や植物抽出物からの分子の同定を容易にすることを目的としています。
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この記事について
サマリー
要約
天然物で覆われた化学空間は、巨大で広く認識されていない。したがって、自然界におけるそれらの機能の幅広い評価を行う簡便な方法論や、潜在的な人的利益(例えば、創薬用途)が望まれている。このプロトコルは、ゲノムマイニング(GM)と分子ネットワーキング(MN)の組み合わせ、全ゲノムシーケンシングにおける遺伝子クラスターコードアノテーションと、粗代謝抽出物の化学構造シグネチャを一致させる2つの現代的なアプローチを記述する。これは、新しい自然エンティティの発見に向けた最初のステップです。これらの概念を一緒に適用すると、ここでは MS ガイド付きゲノムマイニングと定義されます。この方法では、主成分は以前に(MNを使用して)指定されており、構造的に関連する新しい候補は、ゲノム配列アノテーション(GMを使用)に関連付けられています。GMとMNを組み合わせることは、既に知られている化合物から類似体を同定するために、新しい分子の骨格を標的にしたり、代謝プロファイルを収穫するための有益な戦略です。
概要
二次代謝の調査は、多くの場合、特定の生物学的活性のための粗抽出物をスクリーニングし、その後、活性画分に属する成分の精製、同定、および特性化から構成される。このプロセスは、いくつかの化学実体の分離を促進し、効率的であることが証明されています。しかし、今日では、これは主に再発見率が高いため、実現不可能であると見なされています。医薬品産業は特殊代謝物の役割や機能を知らずに革命を起こしたので、その同定は、自然を正確に表さない実験室条件下で行った。今日では、自然なシグナル伝達の影響、分泌、および検出不可能な低濃度でのほとんどの標的の存在をよりよく理解しています。さらに、プロセスの規制は、学術界や製薬業界がこの知識を活用するのに役立ちます。また、サイレント生合成遺伝子クラスター(BGC)2に関連する代謝産物の直接分離を含む研究にも利益2をもたらす。
この文脈において、ゲノムシーケンシングの進歩は、微生物代謝産物のスクリーニングへの関心を再び高めている。これは、発見された生合成クラスターのゲノム情報を分析することで、実験室の条件下で観察または生産されていない新しい化合物をコードする遺伝子を明らかにすることができるからです。現在、多くの微生物全ゲノムプロジェクトまたはドラフトが利用可能であり、その数は毎年増加しており、ゲノムマイニング33、....
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プロトコル
生合成遺伝子クラスターのゲノムマイニング
- MS誘導ゲノムマイニングのための生合成遺伝子クラスター(BCG)を選定するための第一歩として、全ゲノムシーケンシング(WGS)を行います。目的株(細菌)の全ゲノムドラフトは、高品質のゲノムDNAを用いて以下を用いてイルミナMiSeq技術によって得ることができる:ショットガンTruSeq PCRフリーライブラリ準備およびNextera合致ペアライブラリー調製キット33。
注:シーケンス後、イルミナショットガンライブラリとイルミナメイトペアライブラリは、Newbler v3.0(ロシュ、 454) アセンブラー・プログラム (で見つかりました) および FgeneSB に基づくパイプラインを使用してコメント化 ()33微生物学リソースアナウンス(MRA)は、利用可能なリポジトリに堆積された微生物リソースの可用性を公開する記事を掲載した完全にオープンなアクセスジャーナルです(にあります)。候補タンパク質コード遺伝子はRASTサーバーアノテーション34を使用して同定され、全ゲノムショットガン(WGS)プロジェクトはDDBJ/ENA/GenBank()およびゴールド( - 完全な配列ゲノムから二次代謝遺伝子クラスターの注釈に関するシリ....
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結果
このプロトコルは、新しい特殊なバリノマイシン類似分子にアクセスするためのゲノムマイニング、異種発現、およびMSガイド/コードアプローチの組み合わせを使用してうまく例示されました。標的のゲノムから分子へのワークフローであるバリノマイシン(VLM)は図8に示されている。ストレプトマイセスsp. CBMAI 2042 ドラフトゲノムをインシリコで解析し、次いで VLM 遺伝子クラスターを同定し、異種宿主に移した。異種株及び野生型株を適切な発酵条件を用いて三重で栽培し、酢酸エチルで仕切り、濃縮して粗抽出物を生成した。製品から、MS/MSデータを取得し、分子ネットワーキングのためのタンデムMS代謝物プロファイルを生成しました。図9は、ストレプトマイセスsp.CBMAI 2042粗抽出物からMS/MSデータから得られたクラスター化されたイオンを表しており、その特徴断片化パターンと対応するMS類似度が、分子ファミリー共有構造特徴2の発生を示唆している.......
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ディスカッション
このプロトコルの最も強い利点は、新しい分子、特に構造類似体2の構造を解明するために、代謝プロファイルを迅速に切り下げ、ゲノム情報をMSデータとブリッジする能力である。ゲノム情報に基づいて、ポリケチド(PK)、非リボソームペプチド(NRP)、グリコシル化天然物(GNP)、および不可解なBgCsなどの異なる天然物の化学タイプを調査することができます。したがって、BGCは、既に知られているBGCに関連する新しい化合物または未知の類似体を直接産生するためにクローン化することができ、分子ネットワーキングによって発見された類似点によって促進される。したがって、この手順は、天然源によって生成される貴重な化合物を区別するのに役立ち、天然物パイプラインで一般的である将来の分離ステップのガイドとして使用することができます。
MS誘導ゲノムマイニングは、まずペプチドゲノミクス41およびグリコーゲノミクス42の分野で説明した。Dorresteinたちの研究グループ.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究のための財政支援はサンパウロ研究財団によって提供された - FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 と 2014/50249-8 から L.G.O; 2013/12598-8 および 2015/01013-4 から R.S.、2019/08853-9 から C.F.F.A.B.S.P、C.F.F.A.、L.G.O.は、国家科学技術開発評議会(205729/2018-5、162191/20191/2015-4、313492/2017-4)からフェローシップを受けました。L.G.O.はまた、科学の女性のためのプログラム(2008年、ブラジル版)によって提供される助成金のサポートに感謝しています。すべての著者は、ブラジルの卒業後のプログラムを支援するためのCAPES(高等教育人材の改善のための調整)を認めています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アセトニトリル | Tedia | AA1120-048 | HPLCグレードの |
| 寒天 | オキソイド | LP0011 | NA |
| アプラマイシン | シグマAldrich | A2024 | NA |
| カルベニシリン | Sigma Aldrich | C9231 | NA |
| 遠心分離機 | Eppendorf | NA | 5804 |
| ラムフェニコール | シグマAldrich | C3175 | NA |
| コラム C18 | Agilent Technologies | NA | ZORBAX RRHD Extend-C18, 80Å, 2.1 x 50 mm, 1.8 & micro;メートル、1200バール圧力制限P / N 757700-902 |
| カナマイシン | シグマアルドリッチ | K1377 | NA |
| マニトールP.A.- A.C.S. | Synth | NA | NA |
| 微量遠心分離機 | Eppendorf | NA | 5418 |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N4382 | NA |
| Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | F548S | NA |
| Q-TOF 質量分析計 | Agilent technologies | NA | 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS |
| Sacarose P.A.- A.C.S. | Synth | NA | NA |
| シェーカー/インキュベーター | Marconi | MA420 | NA |
| 塩化ナトリウム | Synth | NA | P. A. - |
| ACS 大豆抽出 | 物 NA | NA | |
| ショ糖 | Synth | NA | P. A. - ACS |
| Thermal Cycles | Eppendorf | NA | Mastercycler Nexus Gradient |
| Thiostrepton | SigmaAldrich | T8902 | NA |
| トリプトン | オキソイド | LP0042 | NA |
| トリプトン ソイ ブロス | オキソイド | CM0129 | NA |
| UPLC | Agilent Technologies | NA | 1290 インフィニティ LC システム |
| 酵母抽出 | 物 オキソイド | LP0021 | NA |
参考文献
- Davies, J. Specialized microbial metabolites: functions and origins. The Journal of Antibiotics. 66 (7), Tokyo. 361-364 (2013).
- Ziemert, N., Alanjary, M., Weber, T. The evolution of genome mining in microbes - a review. Natural Product Reports. 33 (8)....
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再版と許可
