熱誘導抗原検索と二重免疫標識プロトコルを用いてホルムアルデヒド固定およびパラフィン埋め込みネコの心原性動脈血栓中の好中球外細胞トラップ(NET)を同定する方法について述べた。
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この記事について
サマリー
要約
細胞外トラップ(NET)は、細胞を含まないDNA(cfDNA)とヒストンや好中球エラスターゼ(NE)などのタンパク質から構成され、全身性炎症や病原体に応答して好中球によって放出される。NETsは以前、ヒトや犬の血栓形成を増強し、線維化症を阻害することが示されているが、肥大性心筋症に続く生命を脅かす合併症である心原性動脈血栓塞栓症(CATE)を有する猫におけるNETsの役割は不明です。猫の心原性動脈血栓におけるNETを同定し、定量化する標準化された方法は、CATEにおける病理学的役割の理解を進める。ここでは、壊死中に抽出された大動脈分岐内のホルムアルデヒド固定およびパラフィン埋め込みトロンビ中のNETを同定する技術について述べている。キシレンとの脱パラフィン後、大動脈切片は間接的に熱誘導抗原の検索を受けた。その後、切片を遮断、透過、およびex vivo NETsを、無細胞DNA(cfDNA)、ヒストンH3(citH3)、および免疫蛍光顕微鏡を用いた好中球エラスターゼ(NE)の共局在化によって同定された。血栓中のNETの免疫検出を最適化するために、組織元素の自己蛍光は顕微鏡検査の前に自己蛍光消光プロセスを用いて制限された。この技術は、他の種のNETおよび血栓症を研究するのに有用なツールとなり、この複雑な状態の病態生理学に関する新しい洞察を提供する可能性がある。
概要
肥大性心筋症の猫は、生命を脅かす血栓塞栓性合併症のリスクがある 1,,2.猫の心原性動脈血栓塞栓症(CATE)に関連する高い罹患率と死亡率にもかかわらず、猫におけるCATEの基礎となる病態生理は十分に理解されていない。この壊滅的な状態の危険にさらされている猫を治療し、識別するための限られた診断および治療ツールもあります 3.
自然免疫におけるその役割に加えて、好中球は、ヒストンと好中球エラスターゼ(NE)および骨髄ペロペロキシダーゼのような顆粒タンパク質で覆われた無細胞DNA(cfDNA)のウェブのようなネットワークである好中球細胞外トラップ(NETs)を放出することによって血栓症に役割を果たすることが示されている。好中球は、全身性炎症、病原体との直接の遭遇、および活性化された血小板44、5、6、75,6との相互作用に応答してNETs形成を受ける。犬では、好中球由来のDNAが血栓溶血を阻害し、NETタンパク質が血栓形成を加速することが示されている。NETsが循....
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プロトコル
ここで説明するすべての方法は、カリフォルニア大学デービス校の制度的動物管理および使用委員会のガイドラインに従って行われました。組織の壊死と生検は、所有者の同意を得て行われました。
1. 組織固定、埋め込み、切除
- 大動脈分岐を解剖し、下降大動脈、大腿動脈、および一般的な腸骨動脈(図1A)を含む、人道的安楽死または死亡の直後に。鈍いは、少なくとも24時間と48時間未満の10%中性緩衝ホルマリンにそれを完全に沈める前に、筋膜(図1B)を解剖します。
- 試料を脱水するために、まず10%中性緩衝ホルマリンを1時間37°Cに加熱して沈水する。その後、37°C(70%、95%、100%)に加熱されたエタノール濃度の上昇に沈水それぞれ1時間2倍。最後に、すすかずに、100%トルエンで2倍を1時間加熱して37°Cに加熱した。
- 62°Cに加熱したパラフィンを加え、パラフィンを完全に一晩固める。
- ミクロトームを使用したパラフィン埋め込み組織のセクション2~3 μmを、正に帯電したガラススライドに配置します。さらに分析するまで-80°Cで切除組織を保管してください。
2. 脱パラフィン、再水和、熱誘導抗原の検索
- ガラス....
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結果
このプロトコルを用いて、パラフィン埋め込み血栓の脱パラフィン化、熱誘導抗原検索、および二重免疫標識を行い、ネコのCATE中のNETを初めて同定した。大動脈分岐内のトロンビは、標準的なH&E染色および位相コントラスト顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡と明視野顕微鏡検査によって位置付けられていた。明るいフィールド顕微鏡では、ネコ動脈血栓は赤血球、白血球、フィブリン、および血小板で構成された(図3A)。H&E は特定の NET コンポーネントを染色することはできませんが、NETs は、近くの赤血球と白血球を囲むさまざまな長さの深い紫色の糸のネットワークとしてしばしば現れました (図 3A、点線のアウトライン)。血栓は位相対向顕微鏡における血管空間内の十分に区分された構造として特徴付けられた(図2A、図4B)。さらに、これらの領域内にNETsの存在を免疫蛍光顕微鏡法で確認した(
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ディスカッション
我々は、二重免疫標識プロトコルおよび免疫蛍光顕微鏡を用いて、固定ネコ心原性動脈血栓におけるNETを同定するためのプロトコルを記述する。心原性動脈血栓のみが染色されたが、理論的には、このプロトコルは他のタイプの血栓および他の獣医種に使用することができる。ネコの動脈血栓内のNETの同定は、NETが猫の血栓症に役割を果たす可能性があることを示唆している。
固定およびパラフィン埋め込み組織における免疫蛍光によるNETの検出は、H&Eのような従来の組織学的染色よりも優れているが、これはしばしば好中球13に囲まれたクロマチンの糸を示す。固定動脈血栓の免疫細胞化学および免疫蛍光は、citH3のようなcfDNAおよび他の細胞外タンパク質の同時検出を可能にする、NETs形成18、19に特異的であることが知られている。19組織や血栓のNET検出には凍結製剤が最適ではないため、4%ホルムアルデヒドと10%メタノールを含む10%中性緩衝ホルマ.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、カリフォルニア大学デービスコンパニオンアニマルヘルスセンター(CCAH 2018-30-F)からの資金によって支えられました。著者らは、ケビン・ウーラード博士が蛍光顕微鏡を使用することを認めたい。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 4,6-ジアミジノ-2-フェニリン (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| 抗シトルリン化ヒストンH3抗体 | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imagingシステム対物レンズ 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System 対物レンズ 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System 対物レンズ 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 488 抗体 | ThermoFisher Scientific | カタログ # A32723 | |
| ヤギの血清 | ジャクソン免疫研究所 | カタログ#NC9660079。メーカー部品#005-000-121 | |
| 中球エラスターゼ抗体 | Bioss抗体 | BS-6982R-Biotin | Rabbitポリクローナル抗体、ビオチン結合 |
| NP40 | ピアス | 製品#28324。ロット#EJ64292 | |
| 正電荷顕微鏡スライドトーマス | メーカーNo.1354W-72 | ||
| ウサギ | ライフテクノロジー | カタログ#10510 | |
| ターゲット検索ソリューション | Agilent Dako | S2367 | TRIS / EDTA、pH 9(10x) |
| TrueVIEW自家蛍光消光キット | ベクトル研究所 | SP-8400 |
参考文献
- Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, Suppl 1 6-9 (2015).
- Payne, J. R., et al.
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再版と許可
