機能化された磁気ナノ粒子の合成、その結合とゼリロフォア・フェロキサミンの評価

MNPを用いた細菌検出方法は、抗体の分子認識に基づく、アプタマー、バイオプロテイン、病原性細菌¹によってMNPに結合した炭水化物。シレブロフォアは細菌の外膜上の特定の受容体によって認識されることを考慮に入れて、彼らはまた、それらの特異性を増加させるためにMNPにリンクすることができます^2.シドロフォアは、細菌^3、44によるFe³⁺取り込み³に関与する小さな有機分子である。サイドロフォアとMNPの間のコンジュゲートの調製と、細菌の捕獲および単離に対する評価はまだ報告されていない。

小分子を用いた磁性ナノ粒子のコンジュゲート合成における重要なステップの1つは、MNPの表面に小分子が結合していることを確認するために結合の種類または相互作用の選択である。このため、磁気ナノ粒子とフェロキサミン(エルシニア・エンゴコリチカが認識するシドロフォア)とのコンジュゲートを調製する手順は、MNPの変更可能な表面の生成に焦点を当て、カルボジイミド化学によってシデロフォアに共有結合することを可能にした。均一なマグネタイトナノ粒子(MNP)を得るために、核形成及びサイズ制御を改善するために、ベンジルアルコールとのソルボ分解反応^を、振盪せずに熱ブロック中に運んだ。次いで、水性媒体6におけるナノ粒子懸濁液の保護と安定性を向上させるステーバー法によりシリカコーティングを生成^した。フェロキサミンの構造を考慮して、シデロフォアと共役する適切なナノ粒子(MNP@SiO2@NH2)₂を生成するためにアミン基の導入が必要である。₂これは、ソルゲル法⁷を用いてシリカ改変ナノ粒子_(MNP@SiO2)の表面に存在するアルコール基を用いて(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(apTES)の凝縮によって達成された。

並行して、フェロキサミン鉄(III)錯体は、水溶液中のアセチルアセトネートの鉄と市販のデフェオキサミンを複合化することによって調製した。N-スクシニルフェロキサミンは、リンカーとして作用するスクシニル基を持ち、コハク酸無水とフェロキサミンの反応により得られた。

_{MNP@SiO2@NH22}とN-succinylferoxamineの間の結合は、MNP@SiO2@NH@Fa_@を与えるために、カップリング試薬ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス-()を使用してカルボジイミド化学を介して行った( ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロリン酸(BOP)及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)を軟質塩基性培地中でN-スクシニルフェロキサミン⁸中の末端酸基を活性化する。 N₂

MPが特徴付けられると、野生型(WC-A)およびフェロキサミン受容体FoxAを欠くY.エンテオコリチカ(FoxA WC-A 12-8)の変異体を捕捉する、裸で機能的な磁気ナノ粒子の能力を評価した。プレーンMP、機能化されたMPおよび共役_{MNP@SiO2@NH@Fa}は、各_@Y.エンゴコリチカ株と相互作用することを許可した。バクテリア共役凝集体を、磁場の印加により細菌懸濁液から分離した。分離した凝集体をリン酸緩衝生理食塩液(PBS)で2回リンスし、PBSで再懸濁して連続希釈を調製し、次いでコロニー計数用にメッキした。このプロトコルは_{、MNP@SiO2@NH@Fa}の合成の各ステップ、全ての中間体および共役体の構造的特徴付け、および中間体に関するコンジュゲートの特異性を評価する容易な方法として細菌捕獲アッセイを示す。⁹

注:不活性雰囲気条件下で行われた反応については、すべてのガラス製品は、以前に65°Cでオーブンで乾燥し、ゴム中隔で密封し、アルゴンで3回パージしました。

1. フェロキサミンと共役した磁性ナノ粒子の合成

1. Fe₃O₄磁性ナノ粒子(MP)の合成
   1. 20 mLガラスバイアルに0.5gのFe(acac)3を加え、10mLのベンジルアルコールと混ぜます。₃
   2. この混合物を2分間超音波処理し、加熱ブロックに移し、180°Cで72時間加熱します。
   3. 反応が完了したら、バイアルを冷却し、ナノ粒子を4000 x gで4000 x gで30分間リンスし、遠心分離を少なくとも2回繰り返します。
   4. ネオジム(NdFeB)磁石を用いて磁力引力により上清からナノ粒子を分離し、残留溶媒を廃棄する。
   5. 96%エタノール繰り返し工程1.1.4でリンスする。そして溶媒が透明に見えるまで40 kHzで1分間の浴中で超音波処理と交互に上清を捨てます。
2. 磁気ナノ粒子 SiO₂コーティング_(MNP@SiO2)
   1. 80 mLのイソプロパノールでMNPの2gの懸濁液を調製し、4 mLの21%アンモニア、7.5mLの蒸留水、0.56 mLのテトラエチルオルソケイ酸(TEOS)を磁気攪拌棒で丸底フラスコに加えます。
   2. 連続撹拌で40°Cで2時間加熱し、1時間超音波処理します。
   3. MNPを磁石で分離し、上清を捨て、イソプロパノールの30mLに分散させる。
   4. 手順 1.2.1 を繰り返します。および 1.2.2.
   5. 96%エタノールで磁気攪拌棒を取り出して洗浄し、すべての材料を回収します。
   6. 磁石を用いて磁力で上清からナノ粒子を分離する。
   7. 上清を捨て、超音波処理と交互に96%エタノールでナノ粒子をすすいだ。
   8. 室温でナノ粒子を真空下で12時間乾燥させます。
3. トリエトキシシラン(3-アミノプロピル)を用いた_MNP@SiO2の機能化
   1. 前工程から得られた_MNP@SiO2の500mgを不活性雰囲気下でN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)でリンスし、40kHzで1分間超音波処理する。その後、上清を捨てて、この処理を3回繰り返します。
   2. 丸い底フラスコで粒子を再懸濁し、磁気攪拌棒で攪拌し、9 mLのAPTESを加えます。
   3. 混合物を60°Cで12時間かき混ぜます。
   4. 上清を捨て、超音波処理と交互に96%エタノールでナノ粒子をすすいだ。
4. フェロキサミンの合成
   1. 100mg(0.15ミリモル)のデフェキサミンメシル酸塩と53.0mg(0.15 mmol)のFe(acac)3₃を蒸留水5mLに5mLで溶解し、室温で一晩攪拌します。
   2. 得られた生成物を分離漏斗で20mLのEtOAcで3回洗浄し、次いで、回転エバポレーターを使用して真空下で有機溶媒を除去する。
   3. 水相を凍結乾燥させて、フェロキサミンを赤い固体として手に入れる。
5. N-スクシニルフェロキサミンの合成
   1. 350mg(3.50 mmol)のコハク酸無水物を、不活性雰囲気下の50mLの丸底フラスコで5mLのピリジン中のフェロキサミン100mg(0.17ミリモル)の溶液に加えます。
   2. 得られた混合物を室温で16時間かき混ぜます。その後、回転エバポレーターで減圧下でピリジンの過剰を除去し、濃い赤色の固形物を得た。
   3. 反応粗物を3mLのメタノールに溶解する。
   4. メタノール溶液をセファデックスカラム(直径20mmの列に20cmのセファデックス)に移し、0.5 mL/minで溶出します。
   5. 赤い分画を収集し、回転エバポレーターを使用して真空下でメタノールを除去します。
6. コンジュゲート_{MNP@SiO2@NH@Fa}の合成
   1. 乾燥_MNP@SiO2の30mgをDMFで₂回@NHし、ナノ粒子を100 mLのエルレンマイヤーフラスコで30分間不活性雰囲気下で30分間超音波処理します。
   2. N-スクシニルフェロキサミン(200mg、0.30ミリモル)、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス-(ジメチルアミノ)-六フッ化ホスホウ酸ホスホニウム(BOP、 173 mg, 0.45 mmol), 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt, 46 mg, 0.39 mmol) およびN,N-ジイソプロピレチルアミン (DIPEA, 128.8 mg, 1.21 mmol) DMF (混合 A) の 10 mL で DMF (混合 A) 下で 50 mL のラウンド底フラスコス.
   3. アルゴンガス雰囲気(Mix B)を₂使用して、乾燥した無酸素条件下での超音波処理の下でDMFの3mLで_2@NH2をすすったMNP@SiOを中断します。
   4. ミックスAを加える B ドロップワイズをミックスします。
   5. 室温でオービタルシェーカーを使用して最終混合物を一晩振ります。
   6. 得られたコンジュゲート_{(MNP@SiO2@NH@Fa)}を磁石を用いて懸濁液から分離する。
   7. 得られた固体をリンスし、エタノールの10 mLでそれを5回超音波処理します。
   8. 真空下で固体を24時間乾燥させます。

2. ナノ粒子を用いた病原性細菌の捕獲を定量化するY.エンテゴコリチ株による細菌アッセイ

1. 滅菌2 mLチューブで1mg/mLでPBS内のすべての中間ナノ粒子と最終コンジュゲートの懸濁液を調製します。
2. ルリア・ベルタニ(LB)の5mLでY.エンゴコリティカの培養を37°Cで一晩インキュベートして準備します。
3. 鉄欠損トリプティック大豆ブロス(TSB)の50 μLを10 mM 2,2′ビピリジルを加えて調製します。
4. 5 mLの鉄欠乏性TSBをY.エンゴコリチの一晩培養物の50 μLで接種し、OD₆₀₀ = 0.5\u20120.8に達するまで撹拌して37°Cでインキュベートする。
5. ステップ2.4で得られた培養液の100μLを取り、900μLのPBSを含む2.0 mLチューブで希釈し、最初の1/10希釈を得た。次に、同じ手順を使用して最初の希釈から1/100希釈液を調製し、1 x 10⁶コロニー形成ユニット(CFU)/mLで細菌細胞の濃度をほぼ得る。
6. 2.0 mLチューブの細菌懸濁液1/100希釈液の1mg/mLで1mg/mLのナノ粒子懸濁液を100μL加え、渦で均質化します。
7. 培養液を20°Cで1時間培養する。
8. 磁石を用いてMNP/バクテリアの凝集体を分離し、上清を慎重に捨てます。
9. ボルテックスを使用して1 mL PBSで分離したナノ粒子を2回リンスする。
10. ナノ粒子をPBSの1 mLで懸濁し、CFU/mLでの細菌捕獲量をカウントします。
11. 前の懸濁液から1 x^10-4希釈に達するまで4回連続して1/10希釈液を調製する。
12. 各希釈液を10μLずつTS寒天プレートにプレートし、一晩で37°Cでインキュベートします。
13. エピホワイトモードでゲルデジタイザーでプレートを撮影します。個々のコロニーの数を数えるためにスポットを増幅するために適切なソフトウェアで画像を処理します。
    注:各MNP中間体は、合成の進捗状況をフォローアップすることを特徴としました。まず、結晶構造を確認するためにXRDによって裸のMPを研究した。次いで、各中間体のFT-IRスペクトルを実行し、対応する反応で生じた変化をチェックした。また、各中間体のラマン分光分析もFT-IRスペクトルから推測された結論を確認するために行った。TGA分析により、有機材料を持つ中間体の重量の損失を推定することができました。各中間体の形態および大きさをTEMによって研究した。最後に、XPS分析は、各MNP中間表面における原子酸化状態を決定し、コンジュゲート_{MNP@SiO2@NH@Fa}における共有結合形成を確認するために重要であった。

各中間体と最終コンジュゲートの形態と特性を決定するために、徹底的な構造特性化が行われます。この目的のために、技術XRD、FT-IR、ラマン分光法、TGA、TEM、EDXマッピングおよびXPSは、共役体の形成を実証するために使用される。X線光電子分光法(XPS)によって獲得されたナノ粒子の表面における原子の酸化状態は、ナノ粒子とシドロフォアとの間の共有結合の形成を確認するための最も関連するデータである。これらの結果に同意して、このプロトコルは再現可能です。

裸MNP、機能化されたMPおよび共役体は、PBS溶液中の各Y.エンゴコリチカ株と混合される。バクテリア-Mpの凝集体は磁石を使用して懸濁液から分離される。凝集体をPBSで2回リンスした後、PBSで再懸濁してコロニーカウント用にメッキされる連続希釈液を調製する。

このプロトコルを用いて調製した中間体および最終的な共役は、合成の各ステップで起こる変化を表示するためにいくつかの技術に提出された。赤外線およびラマン分光法は、合成の各ステップを監視するための簡単かつ迅速な方法を構成します。Si-O、C-Si-C、Fe-O、O=Cアミド振動、FT-IRおよびラマン(下記参照)スペクトルにおけるO=C-Nヒドロキサン酸振動(下記参照)スペクトルに対応する特徴的なバンドの存在は、合成の各ステップで磁気ナノ粒子の表面に起こっていた化学変化の最初の指標であった。

XRDディフラクトグラム

図1は、JCPDSファイル00-003-0863と比較してマグネタイトの合成磁性ナノ粒子(MNP)の組成および結晶構造を確認するために用いたXRD分析を示す。

TEM分析

図2Cは、(111)、(220)、(311)、(420)、(422)、(511)および(440)4.9、2.9、2.4、2.0、1.7、1.6、1.6と一致する電子回折パターンの明るいスポットを示す。一方、図2Dおよび図4Eは、非晶質無機有機材料に埋め込まれた分散MNP粒子(〜10nm)に対応するMNP@SiO2@NH2@FaのTEM画像を示す。2コーティングの厚さは、〜10nm以上です。

EDX分析

EDX マップは、表面上の要素 Fe、O、Si、および C の分布を表示します。図3Aは、MNP@SiO2の表面にSiが存在する様子を明確に示す。フェロキサミンによるアミンの機能化と共役の後、MNP@SiO2@NH@Faのナノ粒子表面上のCの増分が、正常な結合の証拠として図3Bに示されている。

IR分析

裸のMNP、MNP@SiO2、MNP@SiO2@NH2および2MNP@SiO2@NH@FaのFTIRスペクトルを2,図4に示す。2すべてのFTIRスペクトルは、Fe-O振動に関連した600 cm-1で分析のスペクトル範囲内のバンドの始まりを表示します。si-O-Si伸張振動に起因する1050 cm-1の広帯域の存在は、MNP@SiO2、MNP@SiO2@NH2、MNP@SiO2のFTIRスペクトル2に、シ2リカコーティングを確認@NH@Fa。22

MNP@SiO2の FTIR スペクトル (図 4) は、830 ~ 1275 cm -1 (Si-O 結合) の間の広いバンドを表示します。-1MNP@SiO 2@NH2の FTIR スペクトルにおける APTES との機能化の後、おそらく Si-C 結合 (1175 ~ 1250 cm-1の間で予想される) により、より激しくなります。最後に、2995cm-1(C-H伸縮結合)、1640cm-1(O=C-NHアミドII振動)および1577cm-1(O=C-Nヒドロキサミン酸振動)で観察されたバンドをMNP@SiO2のFTIRスペクトルにおいて観察@NH@Fa、ナノ粒子10とのフェロキサミンの結合を確認した。-1 -1 -1

サーモグラビメトリー解析

図5に、有機物や水の添加による重量損失を示すサーモグラビメトリーデータを示す。

ラマン分析

また、裸MNPのシリカコーティングと機能化は、各中間体およびMNP@SiO2@NH@Faのラマン分析によっても確認された(図6)。すべてのラマンスペクトルは、305.8、537.2および665.6cm-1でピークを示し、Fe-O振動(図6A)11)に対応し、713.5cm-1のピーク上の肩を、Si-O-Si振動に関連する(図6B)12。11APTESの官能化後、MNP@SiO2@NH2のラ2マンスペクトルは、SiO2の存在に対応する1001.5および1027.4cm-1で2強烈なピークを表示し、1578.6および1597.9cm-1でSi-C結合の形成を確認する。さらに、703.0cm-1でピークの肩の存在はまた-1、APTES(図6C)13、14の存在13,14を確認した。最後に、1490〜1700cm-1(-1中心1581cm-1)の間の-1広いピークは、MNP@SiO2@NH@FaのラマンスペクトルにおけるSi-C結合およびアミド基に相当する、共役体(図6D)14の形成と一14致している。

XPS 分析

表面上の原子の酸化状態の検討は、XPS分析により行い、構造中の結合形成を確認した。図 7は、さまざまな機能化された MN デバイスと異なる機能化された MN の XPS スペクトルを示しています。MNPの場合、C1の狭いピークは、合成中にサンプルを取り扱う際の不純物による可能性があります。炭素の導入は、MNP@SiO2@NH2および2MNP@SiO2@NH@FaスペクトルにおいてC-Cおよび2C-H結合として観察される。N1sスペクトルの399 eVでのピークの分析と、MNP@SiO2@NH@Faに対して観察された減衰は、MNP@SiO2@NH2とフェロキサミンとの間の2アミド結合の形成を確認する。また、ヒドロキサミック部分のN-O結合の存在は、402eVでピークの存在と一致している。Si2pの狭いスペクトルにおけるピークの存在は、全中間体および共役において、シロキサン群15,16,16に対する結合エネルギーと一致している。

Zポテンシャル

Z の潜在的な値は、表 1に示されています。結果は、それぞれMNPとMNP@SiO2の-25.21および-29.35 mV2の負です。aptesを使用して機能化し、MNP@SiO2@NH2を与え、表面電荷を負から正に変更しました。2この事実はアミン群に起因し、表面電荷はMNP@SiO2@NH@Faに対して正のままである。正の表面Z電位は、細菌(表面が陰性である)と共役17、18、19,18との相互作用を19説明することができる。

細菌捕獲アッセイ

MNP中間体とMNP@SiO2@NH@Faで捕捉されたY.エンゴコリチWC-AおよびFoxA WC-A 12-8の細胞数は、40\u201260コロニーを分離し、容易に視覚化した希釈液で定量化された。裸でキャプチャされたセルの数、MNP@SiO2、および MNP@SiO2@NH2は、それらの間に有意な違いを示さない (図 8)。MNP@SiO2@NH2の遊離アミン基による静電力と2細菌中のフェロキサミン膜受容体の低濃度は、期待される結合特異性の欠如を正当化する可能性がある。

このプロトコルは、主にカルボディイミド化学を使用するもの、異なるタイプのコンジュゲートの合成に適用することができます。より良い結果を得るために修正を導入するのに十分な汎用性があります。すべての中間体と最終的な共役の完全な特徴付けにより、記載された技術を用いて、1つの合成の各ステップに従い、欲望結合の形成を確認することができる。細菌捕獲アッセイ中のコロニーのカウントは、10 μLの低下を使用して、反復を取得し、異なる条件下でアッセイを実行することが容易になる1つのプレートで同時にすべてのサンプルをテストすることができます。

図1:MNP(Fe3O4)(紫)とマグネタイトパターン(黒)の比較
この図は、マルティネス・マタモロスら9.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:裸のMNP(A、BおよびC)およびMNP@SiO2@NH@Fa(D、EおよびF)の明2視野TEMおよび電子回折像。
画像は中解像度と高解像度です。この図は、マルティネス・マタモロスら9.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:MNP@SiO2のEDX2マップ:HAADF画像とA.MNP@SiO2とB.MNP@SiO2の対応するFe、Si、OおよびCマップMNP@SiO2@NH@Fa。2
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図4:無鉄酸化物のFT-IRスペクトル(Fe3O4)MNP、MNP@SiO2、MNP@SiO2@NH2および22342MNP@SiO2@NH@Fa(4)。
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図5:MNP、MNP@SiO2@NH2、およびMNP@SiO2@NH@Faのサーモグラメトリック分析。22
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図6:裸酸化鉄(Fe3O4)MNP(A)、MNP@SiO2(B)、MNP@SiO2@NH2(C)及び24MNP@SiO2@NH@Fa(D)のラマンスペクトル。32 2
(*)APTES、(**)他の酸化相は、レーザーパワーによるマグネタイトの変質から形成される可能性が高い。この図は、マルティネス・マタモロスら9.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 7: XpS の狭いスペクトル MNP、MNP@SiO 2@NH2と MNP@SiO2@NH@Fa。この図は、マルティネス・マタモロスら9.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図8:Y.エンテゴコリチカのCFUは、磁性ナノ粒子の100μgあたり、裸、MNP@SiO2、MNP@SiO2@NH2、MNP@SiO2@NH@Faを100μgにキャプチャした。22 2
(A)WC-A(野生型)(B)FoxA WC-A 12-8(フェロキサミン受容体FoxAを欠く変異体)およびY.エンゴコリチカと相互作用するMNP@SiO2@NH@FaのSEM画像。ABこの図は、マルティネス・マタモロスら9.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表1:Z電位測定。この表は、マルティネス・マタモロスら9から得られた。

開示するものは何もありません。