方法論記事

フィーダーフリーおよび化学的に定義された培養条件下でのヒト多能性幹細胞を用いた後神経節系交感神経ニューロンの効率的な分化

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DOI：

10.3791/60843

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2020年5月24日

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、ヒト多能性幹細胞からの神経節後交感神経ニューロンの生成に対する安定した、高効率な分化戦略を説明する。このモデルは、複数の自律神経障害の研究の使用のためにニューロンを利用可能にします.

要約

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、疾患のモデル化やヒト胚発生の研究に役立つツールとなっています。我々は以前、自律神経障害患者に適用された交感神経を有する自律神経ニューロンの誘導のための分化プロトコルを提示した。しかし、このプロトコルは、ノックアウト血清置換(KSR)およびフィーダーベースの培養条件に基づいて構築され、高い分化効率を確保するために、細胞のソートが必要であった。これらの要因は、高い変動性、高コスト、および低い再現性を引き起こします。また、成熟した交感神経特性は、電気的活性を含めて、検証されていない。ここでは、PSC培養と分化がフィーダーフリーで化学的に定義された培養条件で行われる最適化されたプロトコルを提示する。幹神経堤を識別する遺伝子マーカーが同定される。ポストガンリオニック交感神経ニューロンへのさらなる分化は、細胞のソートを必要とせずに20日後に達成される。電気生理学的記録は、機能的ニューロン同一性をさらに示す。我々の分化されたニューロンから検出された発火はニコチンによって増強され、アドレナリン受容体拮抗薬プロプラノロールによって抑制することができる。このプロトコルにおける中間交感神経前駆物質は、最大2週間のニューラルスフェロイドとして維持することができ、培養の拡大を可能にする。要約すると、私たちの更新された交感神経分化プロトコルは、以前のバージョンと比較して、高い分化効率、より良い再現性、より柔軟性、およびより良い神経成熟を示しています。このプロトコルは、自律神経系に影響を与える人間の障害を研究するために必要な細胞を研究者に提供します。

概要

神経節後交感神経ニューロン(symN)は自律神経系(ANS)に属し、意識から独立した身体の恒常性の応答および調節において複数の重要な役割を果たしています。例えば、ストレスはsymNを刺激し、心拍数、血圧、発汗の増加につながる戦いや飛行応答を呼び起こします。SymNは、遺伝学、毒性/傷害、または他の疾患の仲間として、複数のヒト障害に影響を受けます。遺伝的神経障害の一例は、小児期障害家族性自律神経障害(FD)であり、symNの重度の調節不変が自律神経障害を引き起こし、発汗、皮膚のしみ、嘔吐発作、高血圧、および不安1によって明らかである。毒性の一例は化学療法治療であり、自律神経細胞に毒性の副作用があると報告されている2.自律神経性脱化および超内腎症は、パーキンソン病または高血圧性腎疾患,3,4などの疾患に併生したり、併生したりすることが知られている。このように、疾患の文脈におけるsymN生物学や欠陥のメカニズムを研究し、理解できることは、新しい効果的な治療法の探索に有益である。

解剖 学
末梢神経系は、感覚と自律神経分裂に分岐します。感覚神経系の感覚神経は痛みや触覚の原因ですが、ANSはすべての臓器から脳への情報を中継する責任があります。ANSは腸神経系に分かれており、胃腸管を内面化し、リラクゼーションに重要な副交感神経系、および器官の活性化/調節に重要な交感神経系(SNS)に分かれています。SNSは、2ニューロンシステム5を適応させる。脊髄の前神経節交感神経軸索は、神経節後のsymN細胞体が位置する交感神経節に最初に投影される。これらのニューロンは、その後、体内のすべての臓器の標的組織を内側に向けるために長い投影を送信します。前ガングリオン性ニューロンによって伝達される信号はコリン作動性であるのに対し、ポストガングlionic symNはアドレナリン性であり、したがってノルエピネフリン(NE)を主な神経伝達物質として発現する。コリン作動性であるポストガンリオニック、交感神経ニューロンの顕著な例外はほとんどありません, 血管を内在するものを含みます.アドレナリン性ポストガングLION細胞は、酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)、芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼ(AAAD)、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ(DBH)、モノアミンオキシダーゼ(MAO-A)を発現し、NEの生成と代謝を担います。さらに、NE循環性トランスポーターおよび/または受容体αアドレナリン受容体(ADRA2)、βアドレナリン受容体(ADR2B)、ノルエピネフリントランスポーター(NET1)、およびベスキュリモノアミントランスポーター(VMAT1/2)を発現する。

開発
胚発生時にsymNは神経堤(NC)に由来し、神経管とエクトダーム6を重ね合わせ、メラノサイト、骨芽細胞、椎細胞細胞、グリア、腸腸ニューロン、感覚ニューロン、自律神経ニューロン7を含む複数の細胞系統に分化することができる。神経堤細胞(NCC)は、胚を通るいくつかの経路を取る高度に回遊性細胞である。NCの開発の初期のこの段階では、細胞はマーカーSNAIL1 / 2、FOXD3、およびSOX10898、9、10、1110,11を表します。,移行ルートと、それらが採用する軸方向の位置によって、それらが開発される NC サブタイプが決まります。これらのNCサブタイプは、その特定のHOX遺伝子発現によって区別することができる:頭蓋NCCはHOX遺伝子を発現しない、迷走NCCはHOX 1-5を発現し、トランクNCCはHOX 6–9を発現し、仙骨NCCはHOX 10-1112を発現する。その中でも、トランク NCC は symN の主なソースとして認識されます。SymN前駆体は、転写因子MASH1/ASCL113を発現し、これは、PHOX2B14およびINSM115の発現を促進する。15転写因子のGATAファミリーは、後期交感神経発達中に発現される。GATA2 と GATA3 は symN で表現され、DBH16がアクティブになります。転写因子 HAND2 は、DBH および TH17の発現および維持のためにも重要です。

HPSC(例えば、胚性および誘導多能性幹細胞)は、発達パラダイムを再現し、種々のヒト障害の疾患モデリングに使用できるsymNを生成する強力なツール18である。したがって、hPSCからsymNを生成する際には、発達ガイドラインに従い、分化プロセスに沿って適切なマーカーの発現を評価することが重要です。

以前の symN プロトコル
これまでに hPSC19,20,,21から symN の生成を報告した研究グループはほとんどありません。20これらのプロトコルを相互に直接比較し、我々のプロトコルは、最近22を見直した。2016年23年には、symN文字を持つ自律神経細胞の生成のための分化プロトコルを発表しました(図1A)。このプロトコルは、未分化hPSCと細胞分化の両方で使用されたKSRベースの培地を使用しました。さらに、hPSCはマウス胚性線維芽細胞(MEFフィーダー細胞)上に維持された。我々は、障害23をモデル化するためにFD患者からこのプロトコルとPSCを採用しました.2019年には、この古いプロトコル24のより詳細なバージョンを説明しました。要約すると、神経運命は、最初の2日間でTGF-βおよびBMPシグナル伝達を遮断するために二重SMAD阻害25によって誘導された。CHIR99021を用いたWNT活性化は、神経前駆物質をNC細胞に昇格させた。11日目、細胞はCD49D++またはSOX10+集団26、23に対してFACSによってソートされ、23約40%のNC生成効率をもたらした。+したがって、分化の次のステップのための効率と純度を確保するためにソートが必要であった。NccはFGF2とCHIRの併用処理により、スフェロイドとして維持および増幅された。4日後、メンテナンスのNCスフェロイドをメッキし、BDNF、GDNF、およびNGFを与え、symN成熟を終了した。これらのsymNはASCL1、TH、DBH、およびPHOX2Aなどの強力なsymNマーカーを発現したが、ニコチン性アセチルコリン受容体(CHRNA3/CHRNB4)および小胞輸送体(VMAT1/2)の発現を含む、より成熟したsymNのマーカーは、70日後の分化後も低かった。このプロトコルのHOX遺伝子は正式に試験されておらず、細胞の電気生理学的活性を含む成熟した神経特性は検証されなかった。

ここでは、symN を生成するための最適化されたプロトコルを示します (図 1B)。HPSC は、エッセンシャル 8 (E8) メディア27を使用して、ビトロネクチン (VTN) コーティングされた皿のフィーダーフリー条件で維持されます。分化媒体の式は各段階で修正されており、NC母集団28の割合を増加させる。symN成熟はCD49D+/SOX10+ソートまたはソートされていないバルクNCC集団で行うことができます。どちらも30日目までに高レベルのsymNマーカー表現を示す。さらに、このプロトコルで生成されたsymNは、電気生理学的記録およびsymN活性化剤および阻害剤化合物を用いた治療に応答する。

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プロトコル

注意: H9 PHOX2B:GFPレポーターラインは、Ohららによって提供されました。この論文で使用されるいくつかのqPCRプライマーは、OriGene Technologiesから得られたもので、いくつかの配列はFrithら,、30から得られる。20

1. 食器のコーティング、メディアの準備、および hPSC メンテナンスのためのセットアップ

  1. ディッシュコーティング
    1. ビトロネクチン(VTN)コーティング
      1. VTNのバイアルを37°Cの水浴に完全に解凍するまで入れ、十分に混ぜます。
      2. 100 mm ペトリ皿の場合、7 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 0.5 mg/mL VTN を混合し、VTN 溶液を皿に加え、室温 (RT) で 1 時間インキュベートします。
    2. 基質膜マトリックスコーティング
      1. 一晩4°Cで氷上の基部膜マトリックス(材料表を参照)のバイアルを解凍します。
      2. 6ウェルプレートの1ウェルの場合、2mLのDMEM/F12と20μLの100x基膜マトリックスを混ぜ、基質膜マトリックス溶液を皿に加え、パラフィンフィルムで皿を包み、一晩4°Cのきれいな容器に保管します。できるだけ早く作業してください。コーティングされた料理は、4°Cで最大2週間保存できます。
    3. ポリオルニチン(PO)/ラミニン(LM)/フィブロネクチン(FN)コーティング
      1. 初日は、24ウェルプレートの1ウェルに対して、15 μg/mLを1mLの1x PBSと混合し、37°Cでインキュベートし、CO2を一晩で5%でインキュベートします。LMとFNの両方を-20°Cで一晩解凍し、完全に解凍するまで4°Cで保管してください。
      2. 2日目、吸引PO溶液は、1x PBSでウェル2xを洗浄し、2μg/mLのLMを含む1x PBSの1mLとFNの2μg/mLを加え、5%CO2で37°Cでインキュベートします。2この時点で、LM/FN溶液を使用した皿は、乾燥しない限り、数ヶ月間インキュベーターに保管することができます。皿が乾燥するのを防ぐために、さらに1倍のPBSを追加します。
  2. メディアの準備
    1. エッセンシャル8培地(E8)を一晩4°CでE8サプリメント1本解凍して準備します。必要に応じて、E8培地と抗生物質の500 mLとサプリメントを混ぜます.
      注:E8ソリューションは2週間以内に使用する必要があります。
    2. 完全なE8培地90 mLをDMSOの10 mLと混合して、合計容量100mLにしてhPSC凍結培地を調製します。フィルター滅菌。
    3. 10 μM SB431542、1 ng/mL BMP4、300 nM CHIR99021、10 μM Y27632 を100 mLの容量で100 mLの必須培地を混合して、0~1日分化培地を準備します。
    4. 10 μM SB と 0.75 μM CHIR99021 で E6 培地の 100 mL を混合して、1 日 2 ~ 10 分化培地を準備し、合計体積 100 mL を用意します。
    5. 1日10日から14日のスフェロイド培地を、神経基底培地とB27(50x)の2mL、N2(100x)の1mL、2 mM L-グルタミン酸、3 μM CHIR99021、および10ng/mL FGF2を混合して100mLの総体積で調製する。
    6. 1日10日から14日のスフェロイド培地に0.5μMの新鮮なRAを加えて、スピロイド長期維持のために14日から28日の培地を準備します。
      注:RAは必ず-80°Cに保ちます。
    7. 2 mLのB27(50x)、1 mLのN2(100x)、2 mM L-グルタミン酸、25 ng/mL GDNF、25 ng/mL BDNF、25 ng/mL NGF、200 μMアスコルビン酸、および0.2mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmの神経基底培地を混合して、SymN成熟培地を調製する。このソリューションは2週間以内に使用する必要があります。各給餌の前に、0.125 μMの新鮮なRAを加えます。このソリューションは、14 日目 (オプション 1) または 28 日目 (オプション 2) から使用されます。
    8. 合計体積100 mLに対して必要に応じて、DMEMと2%FBS、2 mM L-グルタミン酸、抗生物質を混合してFACSバッファを調製します。
  3. hPSC メンテナンス
    1. hPSC の解凍と維持
      1. VTNコーティング100mm皿1個を用意します。
      2. 液体窒素から直接hPSCのバイアルを解凍するには、バイアルを37°Cの水浴に入れ、解凍するまで慎重にチューブを水中に振ります。解凍したhPSCを10mLの1x PBSを含む15mLチューブに移し、遠心分離機を200xgで4分間移動します。 g
      3. 上清を捨て、チューブにE8培地1mLを加えます。ピペットを数回回してペレットを再懸濁し、さらに9 mLのE8培地を加え、合計10 mLに達する。
      4. 100mm皿からVTN溶液を吸引する。
      5. hPSCを100mm皿に移し、細胞が皿の中に均等に分配されるように、穏やかに振る(円ではなく上下左右)。
      6. 37°Cでインキュベートし、5%CO2で。2
      7. 翌日、すべての培地を吸引し、10mLのE8で供給します。
      8. 次の3-4日間毎日このようにフィードし、分割する準備をします。
    2. hPSC の分割
      注: 分割の時点での hPSC は、80% - 90% コンフルエントである必要があります。滑らかで明るいエッジを持つ大きなコロニーを観察する必要があります。ただし、各コロニー間の接触は避けるべきです(図2B、0日目、図6B)。
      1. 必要に応じて、VTNコーティングされた100 mmの皿を準備します。
      2. E8を吸引し、1x PBSで1倍に分割する必要がある皿を洗います。
      3. 1x PBSを吸引し、0.25 M EDTAの4 mLを加えます。37°Cで2分間インキュベート、5%CO2.
        注意: hPSC は小さなコロニーとして分割/再入れ替えする必要があります。単一細胞への分離を防ぐために、2分以上EDTAで治療しないでください。細胞は、2分の処理後も皿表面に付着する必要があります。
      4. EDTAを吸引し、10mLのE8培地を皿表面に強くピペットしてコロニーを剥離し、15mLチューブ内のすべての培地および細胞を収集する。
      5. hPSC が 80% ~ 90% の合流率で、1:15-1:20 までにコロニーを分割します。たとえば、hPSC を 1 個の 100 mm 皿に分割するには、500 μL の E8/hPSC 溶液を取り、9.5 mL のフレッシュ E8 媒体と混合します。
      6. VTNコーティングされた100 mmの皿の皿のhPSC。
        注:研究者と細胞株ごとに、それぞれ個別に理想的な分割比を確立することをお勧めします。
    3. 凍結 hPSC
      1. 分割する準備ができているhPSCの1つの100ミリメートル皿のために、凍結培地の3つのクライオビアルと3.5 mLを準備します。
        注:メディアとバイアルは、使用されるまで4°Cまたは氷の上に保管してください。
      2. E8を吸引し、1x PBSで皿2xを洗います。
      3. 吸引1x PBSを加え、4 mLの0.25 M EDTAを加え、37°Cで2分間イン2キュベートし、5%CO2でインキュベートする。
        注: hPSC は、分割される時点で小さなコロニーとして凍結する必要があります。単一細胞への分離を防ぐために、2分以上EDTAで細胞を治療しないでください。細胞は、2分の処理後も皿の表面に付着する必要があります。
      4. EDTAを吸引し、皿の表面に1x PBSの10mLを強くピペットしてコロニーを取り外し、50mLチューブ内のすべての培地および細胞を収集する。
      5. 200x gで20mLのPBSと遠心分離機をg4分間加え、残りのEDTAを洗い流します。
      6. 上清を捨て、凍結培地の3mLにペレットを再懸濁します。
      7. hPSCを3つのクライオビアル(それぞれ1mL)に均等に分配します。
      8. 制御された凍結箱または発泡スチロールサンドイッチに一晩で-80 °Cで保管して、ゆっくりとした温度低下を確実にし、液体窒素タンクに移して長期保存します。

2. hPSC をシードして差別化を開始する (0 日目)

注: hPSC は安定化された後(すなわち、解凍後に 2 ~ 3 倍に分割される)、差別化の準備が整っている必要があります。コロニーが健康で、滑らかで光沢のあるエッジと最小限の分化を持っていることを確認してください(図2B)。

  1. 必要に応じて、基膜マトリックスコーティングされた料理(24ウェルまたは6ウェルディッシュ)を1日前に準備します。分化の開始時にRTに料理を持参してください。
  2. 必要に応じて、日 0 ~ 1 分の区別媒体を作成します。
  3. コンフルエントからE8を吸引し、hPCSを分割する準備ができて、1x PBSで皿2xを洗う。
  4. 100 mm皿あたり0.25 M EDTAの7 mLを加え、37°C、5%CO2で15分間インキュベートします。2
    注:この時点で、EDTA治療は単一細胞に分散するために延長されます。
  5. すべてのhPSC(浮いているはずです)をパイプオフし、50 mLチューブに転送します。EDTA溶液と同じ量以上の1x PBSを添加し、EDTAを希釈する。
  6. 200 x gで 4 分間の遠心分離機。
  7. 上清を捨て、0〜1日目の分化培地とピペットの1mLを加えて細胞を均質化します。培地を加え、混合して細胞溶液を濃縮に理想的に希釈し、細胞を数えます。
    注:細胞溶液を過剰に希釈しないでください。1つの完全な100のmm皿からの細胞は開始するために媒体の5 mLで希釈されるべきである。
  8. 自動セルカウンターまたはヘモサイトメーターを使用してセル番号をカウントします。
  9. 必要に応じて細胞溶液を希釈して、低い最終体積で125,000セル/cm2に達します(例えば、6ウェル皿の場合はウェルあたり2mL、24ウェルディッシュの場合はウェルあたり500 μL)。
    注: ボリュームが小さいと、セルの接続速度が向上します。
  10. コーティングされた皿からすべての基部膜マトリックス溶液を吸引し、細胞溶液をウェルにプレートします。
  11. 37°Cでインキュベートし、5%CO2で。2

3. 神経堤細胞誘導(1日目~10日目、図2A)

  1. 1日目には、0〜1日目の分化培地(6井戸料理ではウェルあたり3mL、24ウェルディッシュではウェルあたり1mL)で細胞を供給します。
  2. 2日目には、2日目の10分化培地(6井戸料理では3mL、井戸あたり1mL(24ウェル料理)で細胞を供給します。
  3. これからは、細胞は10日目まで一日おきに供給されるべきです(つまり、次の給餌日は4日目になります)。
    注: 6 日目から NC リッジを検出する必要があります (図 2B)。分化が起きているかどうかを確認するために、SOX10/AP2aに染色し、分化の時間に沿ってマーカー遺伝子発現に使用することができる小さなウェル(すなわち、24のウェル)に平行な分化培養を運ぶことをお勧めします(図2B、C)。C
  4. セルを並べ替える場合は、セクション 4 に進みます。それ以外の場合は、セクション 5 に進みます。

4. 神経堤マーカー CD49D およびスフェロイド中の NC 細胞の凝集のための蛍光活性化細胞分類 (FACS)

注: FACS の並べ替えの場合、サンプルは氷の上に保管し、並べ替えが行われるまで染色後に光にさらされない必要があります。

  1. セルが並べ替えられている場合は、FACS バッファを準備します。
  2. 1日10-14回転楕円体培地を準備します。
  3. 10日目に培地を取り出し、1x PBSで1倍洗います。
  4. 解離液(材料表を参照)を6ウェル皿で2mL、24ウェル皿で1mLあたり2mLで解離液を加え、37°C、5%CO2で202分間インキュベートします。
  5. すべてのhPSCをパイプオフし、50 mLチューブに転送します。
  6. チューブの残りの部分をFACSバッファーと遠心分離機を200 x gで4分間満たします。
    注:各50 mLチューブは、最大20 mL以下のセル溶液を収容できます。FACS バッファの容量は、解離解を中和するのに十分な高さでなければなりません。
  7. 上清を捨て、適切な量のFACSバッファー(6ウェルプレートのウェルあたり2mL〜)で細胞を再懸濁し、カウントして細胞数を決定する。
  8. 以下のサンプルを準備します。
    1. サンプル1(未染色コントロール):FACSバッファの400 μLで1 x 106細胞。20 μmのストレーナーキャップを通して細胞をフィルターし、氷の上にチューブを保持します。
    2. サンプル2(DAPIのみ制御):0.5 ug/mL DAPIを含むFACSバッファの400 μLの1 x 106細胞。ストレーナーキャップでFACSチューブを通して細胞をフィルタリングし、氷の上にチューブを保ちます。
    3. サンプル3(CD49d標識):PE/Cy7結合CD49D抗体(FACSバッファー100μLあたり1 x106細胞あたり5μL)を含むFACSバッファーを15 mLチューブに入れ、氷上で20分間インキュベートします。
  9. チューブをFACSバッファーと遠心分離機で200 x gで4分間満たします。
  10. 上清を廃棄し、メーカーの指示に従って0.5 ug/mL DAPIを含むFACSバッファの1mLに5〜10 x 106セルごとに再中断します。
  11. ストレーナーキャップでFACSチューブを通して細胞をフィルタリングし、氷の上にチューブを保ちます。
  12. 2 mLのFACSバッファを含むコレクションFACSチューブを準備します。
  13. DAPI と PE-Cy7 を検出して CD49D+集団を分離できるレーザーで FACS マシンを並べ替えます。
  14. 並べ替えた後、並べ替えられたセルをカウントします。
  15. 遠心分離機は、すべての細胞を選別し、10〜14日のスフェロイド培地で、培地500 μLあたり0.5 x 106細胞の最終濃度まで再懸濁します。
  16. 超低い付着24ウェルプレートにウェルあたり0.5 x 106セルをプレートします。
  17. 細胞を37°Cでインキュベートし、5%CO2に入れ.2

5. スフェロイド中のNC細胞の凝集

  1. FACS を使用して NC 細胞を分離し、代わりにそれらを直接スフェロイドに集約しない場合は、まずステップ 4.2 ~ 4.5 の説明に従ってセルを準備します。
  2. 残りのチューブを1x PBSで満たし、遠心分離機を200 x gで4分間充填します。
  3. 上清を捨て、適当な量の10〜14日のスフェロイド培地(例えば、6ウェルプレートの場合はウェルあたり〜2mLの培地)で細胞を再懸濁し、数えて細胞数を決定する。
  4. 10~14日のスフェロイド培地で細胞を希釈し、培地500μL当たり0.5 x106細胞にします。
  5. 超低い取り付け24ウェルプレートでウェル当たりのセル懸濁液のプレート500 μL。
  6. 細胞を37°Cでインキュベートし、5%CO2に入れ.2

6. NCスフェロイド維持と交感神経前駆体誘導(10日目~14日目、図4A)

  1. オプション 1: 最小限のスフェロイドカルチャ
    1. 11日目に、10日目から既存の培地を吸引することなく、10~14日のスフェロイド培地をNCスフェロイドに500μL追加します。37°Cでインキュベートし、5%CO2で。2
    2. 12日目にプレートを傾けて、ウェルの片側にNCスフェロイドを蓄積します。慎重に吸引し、できるだけ多くの培地を捨て、10〜14日のスフェロイド培地の1 mLで供給してください。
    3. 14日目まで毎日細胞に餌を与え続けます。
    4. 任意: スフェロイドが凝集し、大きな束を生成する場合は、ピペットを使用してスフェロイドの束を分解します。これにより、個々のスフェロイドが大きくなりすぎないようにもできます。
      注:理想的なスフェロイドサイズの範囲は100〜500 μm程度でなければなりません。その範囲内では、個々の回転楕円体のサイズは重要ではありません。しかし、平滑ではっきりしたエッジ(図3および図6)などの形態は、さらなる成功のために重要である。14日目には、各24ウェルプレートには、上記のサイズ範囲内で、異なるサイズの約50〜60個のスフェロイドが理想的に含まれています。
  2. オプション 2: スフェロイドカルチャの拡張
    1. 15日目に、NCスフェロイドを維持するために、0.5 μM RAを含む10〜14日のスフェロイド培地の1.5 mLで供給します。37°C、5%CO2でインキュ2ベートする。
      注:RAは、すべての給餌のために新鮮に追加され、常に-80°Cで保存する必要があります。
    2. これからは、1日おきに28日目まで給餌し、次にスフェロイドのめっきを続けます(セクション7.1)。
      注:成長するスフェロイドは、それらを分割するために1 mLピペットでそれらをピペット化することによって、週に約1倍分割されます。それらはおよそ1:2-1:4の比率で分割されます。2週間の拡張期間内に、セルの数は約4倍にする必要があります。

7. SymNの分化と成熟(オプション1:14日後;オプション2:28日後)

  1. 通常の料理でメッキスフェロイド
    1. PO/LM/FMコーティングされた24ウェルプレートを準備します。
    2. 0.125 μM RA(すべてのフィードを新鮮に追加)と10 μM Y27632(14日目のみ)を含むsymN培地を準備します。
    3. 14日目にプレートを傾けて、ウェルの片側にNC回転楕円体を蓄積します。慎重に吸引し、できるだけ多くの培地を捨て、1mLのsymN培地で供給する。
    4. コーティングされたプレートからLM/FNを取り外します。
    5. 24ウェルプレートから各ウェルを分割して、新しいコーティングされた24ウェルプレートの4つの別々の井戸にプレートします。各オリジナルウェルには、〜50〜60個の回転楕円体を含む1mLがあります。これにより、250 μL が生成され、新しいプレート上の各ウェルに約 10 ~ 15 個のスフェロイドが含まれる。
    6. ウェルあたり250μLの追加媒体を追加します。
      注: これは 1:4 の分割です。スフェロイドが溶液内で適切に分散され、分割が相対的に均等になるようにしてください。最終的な数は symN の生成の成功に影響を与えないため、スフェロイドの数はカウントされません。
    7. 37°C、5%CO2でインキュ2ベートする。
    8. 15日目(またはオプション2の場合は29日目)に、0.125 μM RAを含む1mLのsymN培地ですべての媒体を交換してフィードします。これからは、ニューロンは20日目(またはオプション2の35日目)まで2日ごとに供給されるべきです。
    9. 20日目(またはオプション2の35日目)の後、ニューロンは既存の培地の半分(500 μL)だけを慎重に交換して供給する必要があります。これからは、メディアがすぐに黄色に変らない限り、毎週餌を与えます。
    10. 希望の時間まで毎週給餌を続けます。
      注: symN は、神経節のような構造で集約される傾向があり、文化の料理から切り離されやすくなります。これを防ぐために、半給餌と最小限の処理をお勧めします。
  2. 電気生理学的記録用めっき細胞
    1. PO/LM/FMコーティング96ウェル電気生理学プレートを準備します。
    2. 0.125 μM RA(すべてのフィードを新鮮に追加)と10 μM Y27632(14日目のみ)を含むsymN培地を準備します。
    3. 14日目に、すべてのスフェロイドを収集し、4分間200 x gで遠心分離します。
    4. 上清を捨て、解離液の2mLを加え、混合物を超低付着板のウェルの1つに戻します。37°Cでインキュベートし、5%CO2で20〜45分間インキュベートします。2
      注:スフェロイドの大きさに応じて、解離期間は20分以上になる可能性があります。このプロトコルでは、スフェロイドが完全に解別されると集約されないため、このプロトコルでは省略可能です。
    5. ピペットはスフェロイドを完全に解約し、次いで200xgで遠心分離機gを4分間分離する。
    6. 上清を捨て、適切な量のsymN培地で細胞を再中断し、セル数を数える。
    7. 細胞をPO/LM/FNコーティングされた電気生理学井戸の100,000/cm2で、井戸当たり200 μLの総体積でプレートします。
    8. 15 日目 (またはオプション 2 の場合は 29 日目) に、セクション 7.1 と同じ給餌プロセスに従います。15日目(またはオプション2の場合は29日目)以降の総体積は、ウェルあたり300 μLでなければなりません。
    9. 20日目(またはオプション2の場合は35日目)の後に多電極アレイマシンを使用して電気信号を測定します。
      注: オプション 2 では、回転楕円体は 14 日から 28 日目の間にいつでもメッキできます。第1の電気信号測定は、スフェロイドをめっきしてから1週間後に行うことができる。

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結果

このプロトコルでは、hPSC から symN を生成する方法について説明します。ここで示した培養条件は、以前に公開されたプロトコル23,24 (図 1A) からフィーダーフリーで化学的に定義された条件まで改善されました (図 1B)。2 つのオプションがあり、1 つは 20 日以内に symN を作成し、もう 1 つは NCC を 2 週間拡張して、さらに多くのセルを生成して symN に分化することができます (図 1B、オプション 1、および 2)。

分化されたセルの symN 特性を適切にモニターするために、PHOX2B-eGFP WA09 レポーターラインと親 WA09 PSC 回線19.すべての分化は、少なくとも1つの通路の後に独立...

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ディスカッション

我々は最近、2つのレビューを発表し、1つは、疾患モデリング31のためのhPSC由来のsymNの使用を議論し、利用可能な分化プロトコル22の詳細な比較を行った。そこで、興味のある研究者がsymNを作ることに成功するために、現在のプロトコルのトラブルシューティングに焦点を当てます。分化プロセス全体の間、一貫したデータと健康な分化細胞を得るためには、すべての段階での汚染を慎重に制御する必要があります。定期的なhPSCの維持では、マイコプラズマのテストは隔週または毎月行われるべきである。細胞の並べ替えが10日目に行われる場合、任意の培地への抗生物質の添加が非常に奨励される。また、分化を開始する前と後に細胞の形態を確認することも重要です。ここでは、いくつかの重要なチェックポイントを提案します(図6A)。まず、分化の準備ができている理想的なhPSCコロニーは、小さなスパイクを持つ明るく滑らかなエッジを持っている必要があります。歯車のようなスパイクを持つコロニーは区別し始めており、使用すべきではあ...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

ハイジ・ウルリッヒスの原稿の批判的な読み取りと編集に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100 mm細胞培養ディッシュFalcon353003
15 mL円錐組織培養チューブVWR/Corning89039-664
24ウェル組織培養プレートFalcon353047
24ウェル超低アタッチメントプレートCorning07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2組織培養インキュベーターThermo Fisher/LifeテクノロジーHeracell VIOS 160i
50 ml 円錐形組織培養チューブVWR/Corning89039-656
6ウェル組織培養プレートCostar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500細胞解離溶液
抗AP2a抗体Abcamab108311宿主:ウサギ; 1:400
希釈抗Ascl1抗体BD Pharmingen556604宿主:マウスIgG1; 1:200
抗CD49D抗体BioLegend304313宿主:マウスIgG1; 5 μ100 μl volume
抗CD49D抗体(アイソタイプ)BioLegend400125宿主:マウスIgG1; 5 μ100 μl 容量
DAPI色素SigmaD95421:1000 希釈
抗DBH抗体Immunostar22806宿主:ウサギ 1:500
抗GFP抗体Abcamab13970宿主:鶏 1:1000
抗HOXC9抗体Abcamab50839宿主:マウス 1:100
抗NET1MabNET17-1宿主:マウス、1:1000希釈抗
PRPH抗体Santa Cruz BiotechnologySC-377093/H0112宿主:マウスIgG2a、1:200
抗SOX10抗体Santa Cruz Biotechnologysc-365692宿主:マウスIgG1、1:100
抗TH抗体Pel-FreezP40101- 150宿主:ウサギ、1:500
アスコルビン酸ΣA8960-5Gストック濃度:100 mM
B27サプリメントThermo Fisher/Life Technologies12587-010ストック濃度:50x
BDNFR&D Systems248-BDストック濃度: 10 μg/mL
BMP4R&D Systems314-BPストック濃度: 6 mM
セルカウンターThermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
セルカウンティングチャンバースライドInvitrogenC10312
CentrifugeEppendorf57021&5424R
CHIR99021R&D Systems4423ストック濃度:6 mM
クライオバイアルThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627ストック濃度:100 mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018ストック濃度:1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057ストック濃度:1x
DMSOサーモフィッシャー/ライフテクノロジーズBP231-100
E6 中型 gibcoA15165-01
E8 中型 gibcoA15169-01原液濃度: 1x
E8 supplementgibcoA15171-01原液濃度: 50x
EDTASigmaED2SS原液濃度: 0.5 M
電気生理学プレート(AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
FACSマシンBeckman CoulterCytoFLEX(FACS用)
FACSマシンBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ(ソーティング用)
FACSチューブ(青色フィルターキャップ)Falcon352235
FACSチューブ(白色キャップ)Falcon352063
ウシ胎児血清 (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450ストック濃度: 10 μg/mL
GeltrexInvitrogenA1413202基底膜マトリックス;ストック濃度:100x
hPSCsThomson et al., (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN)VWR/Corning47743-654ストック濃度:1 mg/mL
L-グルタミンThermo Fisher/Gibco25030-081ストック濃度:200 mM
LNタンクカスタムバイオジェニックシステムV-1500AB
MEAリーダーアクシオン・バイオシステムズ・マエストロ・プロ
マウス・ラミニンI(LM)R&D Systems3400-010-01ストック濃度:1 mg/mL
N2 サプリメントThermo Fisher/Life Technologies17502-048ストック濃度:100x
Neurobasal mediumgibco21103-049ストック濃度:1x
NGFPeproTech450-01ストック濃度:25 μg/mL
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Gibco14190-136ストック濃度:1x
ポリ-L-オルニチン臭化水素酸塩 (PO)SigmaP3655ストック濃度:15 mg/mL
プリモシン (抗生物質)InvivoGenANTPM1ストック濃度:50 mg/mL
qPCR マシンバイオ・ラッド ラボラトリーズC1000 タッチ
qPCR プレートバイオ・ラッド ラボラトリーズHSP9601
組換え FGF2R&D Systems233-FB/CFストック濃度: 10 μg/mL
レチノイン酸SigmaR2625ストック濃度:1 mM
SB431542Tocris/R&D Systems1614ストック濃度:10 mM
トリパンブルーコーニングMT-25-900-CI
ビトロネクチン (VTN)サーモフィッシャー/ライフテクノロジーA14700ストック濃度:0.5 mg/mL
ウォーターバスVWR/コーニング706308
Y27632R&D Systems1254ストック濃度:10 mM
希釈 希釈 希釈 希釈 抗体 希釈 希釈 希釈 ズ

参考文献

  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , Academic Press. (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865(2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92(2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78(2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81(2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).

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