Method Article

フィーダーフリーおよび化学的に定義された培養条件下でのヒト多能性幹細胞を用いた後神経節系交感神経ニューロンの効率的な分化

DOI:

10.3791/60843

⸱

May 24th, 2020

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコルでは、ヒト多能性幹細胞からの神経節後交感神経ニューロンの生成に対する安定した、高効率な分化戦略を説明する。このモデルは、複数の自律神経障害の研究の使用のためにニューロンを利用可能にします.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、疾患のモデル化やヒト胚発生の研究に役立つツールとなっています。我々は以前、自律神経障害患者に適用された交感神経を有する自律神経ニューロンの誘導のための分化プロトコルを提示した。しかし、このプロトコルは、ノックアウト血清置換(KSR)およびフィーダーベースの培養条件に基づいて構築され、高い分化効率を確保するために、細胞のソートが必要であった。これらの要因は、高い変動性、高コスト、および低い再現性を引き起こします。また、成熟した交感神経特性は、電気的活性を含めて、検証されていない。ここでは、PSC培養と分化がフィーダーフリーで化学的に定義された培養条件で行われる最適化されたプロトコルを提示する。幹神経堤を識別する遺伝子マーカーが同定される。ポストガンリオニック交感神経ニューロンへのさらなる分化は、細胞のソートを必要とせずに20日後に達成される。電気生理学的記録は、機能的ニューロン同一性をさらに示す。我々の分化されたニューロンから検出された発火はニコチンによって増強され、アドレナリン受容体拮抗薬プロプラノロールによって抑制することができる。このプロトコルにおける中間交感神経前駆物質は、最大2週間のニューラルスフェロイドとして維持することができ、培養の拡大を可能にする。要約すると、私たちの更新された交感神経分化プロトコルは、以前のバージョンと比較して、高い分化効率、より良い再現性、より柔軟性、およびより良い神経成熟を示しています。このプロトコルは、自律神経系に影響を与える人間の障害を研究するために必要な細胞を研究者に提供します。

Introduction

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神経節後交感神経ニューロン(symN)は自律神経系(ANS)に属し、意識から独立した身体の恒常性の応答および調節において複数の重要な役割を果たしています。例えば、ストレスはsymNを刺激し、心拍数、血圧、発汗の増加につながる戦いや飛行応答を呼び起こします。SymNは、遺伝学、毒性/傷害、または他の疾患の仲間として、複数のヒト障害に影響を受けます。遺伝的神経障害の一例は、小児期障害家族性自律神経障害(FD)であり、symNの重度の調節不変が自律神経障害を引き起こし、発汗、皮膚のしみ、嘔吐発作、高血圧、および不安1によって明らかである。毒性の一例は化学療法治療であり、自律神経細胞に毒性の副作用があると報告されている2.自律神経性脱化および超内腎症は、パーキンソン病または高血圧性腎疾患,3,4などの疾患に併生したり、併生したりすることが知られている。このように、疾患の文脈におけるsymN生物学や欠陥のメカニズムを研究し、理解できることは、新しい効果的な治療法の探索に有益である。

解剖 学
末梢神経系は、感覚と自律神経分裂に分岐します。感覚神経系の感覚神経は痛みや触覚の原因ですが、ANSはすべての臓器から脳への情報を中継する責任があり....

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Protocol

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注意: H9 PHOX2B:GFPレポーターラインは、Ohららによって提供されました。この論文で使用されるいくつかのqPCRプライマーは、OriGene Technologiesから得られたもので、いくつかの配列はFrithら,、30から得られる。20

1. 食器のコーティング、メディアの準備、および hPSC メンテナンスのためのセットアップ

  1. ディッシュコーティング
    1. ビトロネクチン(VTN)コーティング
      1. VTNのバイアルを37°Cの水浴に完全に解凍するまで入れ、十分に混ぜます。
      2. 100 mm ペトリ皿の場合、7 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 0.5 mg/mL VTN を混合し、VTN 溶液を皿に加え、室温 (RT) で 1 時間インキュベートします。
    2. 基質膜マトリックスコーティング
      1. 一晩4°Cで氷上の基部膜マトリックス(材料表を参照)のバイアルを解凍します。
      2. 6ウェルプレートの1ウェルの場合、2mLのDMEM/F1....

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Results

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このプロトコルでは、hPSC から symN を生成する方法について説明します。ここで示した培養条件は、以前に公開されたプロトコル23,24 (図 1A) からフィーダーフリーで化学的に定義された条件まで改善されました (図 1B)。2 つのオプションがあり、1 つは 20 日以内に symN を作成し、もう 1 つは NCC を 2 週間拡張して、さらに多くのセルを生成して symN に分化することができます (図 1B、オプション 1、および 2)。

分化されたセルの symN 特性を適切にモニターするために、PHOX2B-eGFP WA09 レポーターラインと親 WA09 PSC 回線19.すべての分化は、少なくとも1つの通路の後に独立.......

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Discussion

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我々は最近、2つのレビューを発表し、1つは、疾患モデリング31のためのhPSC由来のsymNの使用を議論し、利用可能な分化プロトコル22の詳細な比較を行った。そこで、興味のある研究者がsymNを作ることに成功するために、現在のプロトコルのトラブルシューティングに焦点を当てます。分化プロセス全体の間、一貫したデータと健康な分化細胞を得るためには、すべての段階での汚染を慎重に制御する必要があります。定期的なhPSCの維持では、マイコプラズマのテストは隔週または毎月行われるべきである。細胞の並べ替えが10日目に行われる場合、任意の培地への抗生物質の添加が非常に奨励される。また、分化を開始する前と後に細胞の形態を確認することも重要です。ここでは、いくつかの重要なチェックポイントを提案します(図6A)。まず、分化の準備ができている理想的なhPSCコロニーは、小さなスパイクを持つ明るく滑らかなエッジを持っている必要があります。歯車のようなスパイクを持つコロニーは区別し始めており、使用すべきではあ.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ハイジ・ウルリッヒスの原稿の批判的な読み取りと編集に感謝します。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm細胞培養ディッシュFalcon353003
15 mL円錐組織培養チューブVWR/Corning89039-664
24ウェル組織培養プレートFalcon353047
24ウェル超低アタッチメントプレートCorning07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2組織培養インキュベーターThermo Fisher/LifeテクノロジーHeracell VIOS 160i
50 ml 円錐形組織培養チューブVWR/Corning89039-656
6ウェル組織培養プレートCostar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500細胞解離溶液
抗AP2a抗体Abcamab108311宿主:ウサギ; 1:400
希釈抗Ascl1抗体BD Pharmingen556604宿主:マウスIgG1; 1:200
抗CD49D抗体BioLegend304313宿主:マウスIgG1; 5 μ100 μl volume
抗CD49D抗体(アイソタイプ)BioLegend400125宿主:マウスIgG1; 5 μ100 μl 容量
DAPI色素SigmaD95421:1000 希釈
抗DBH抗体Immunostar22806宿主:ウサギ 1:500
抗GFP抗体Abcamab13970宿主:鶏 1:1000
抗HOXC9抗体Abcamab50839宿主:マウス 1:100
抗NET1MabNET17-1宿主:マウス、1:1000希釈抗
PRPH抗体Santa Cruz BiotechnologySC-377093/H0112宿主:マウスIgG2a、1:200
抗SOX10抗体Santa Cruz Biotechnologysc-365692宿主:マウスIgG1、1:100
抗TH抗体Pel-FreezP40101- 150宿主:ウサギ、1:500
アスコルビン酸ΣA8960-5Gストック濃度:100 mM
B27サプリメントThermo Fisher/Life Technologies12587-010ストック濃度:50x
BDNFR&D Systems248-BDストック濃度: 10 μg/mL
BMP4R&D Systems314-BPストック濃度: 6 mM
セルカウンターThermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
セルカウンティングチャンバースライドInvitrogenC10312
CentrifugeEppendorf57021&5424R
CHIR99021R&D Systems4423ストック濃度:6 mM
クライオバイアルThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627ストック濃度:100 mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018ストック濃度:1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057ストック濃度:1x
DMSOサーモフィッシャー/ライフテクノロジーズBP231-100
E6 中型 gibcoA15165-01
E8 中型 gibcoA15169-01原液濃度: 1x
E8 supplementgibcoA15171-01原液濃度: 50x
EDTASigmaED2SS原液濃度: 0.5 M
電気生理学プレート(AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
FACSマシンBeckman CoulterCytoFLEX(FACS用)
FACSマシンBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ(ソーティング用)
FACSチューブ(青色フィルターキャップ)Falcon352235
FACSチューブ(白色キャップ)Falcon352063
ウシ胎児血清 (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450ストック濃度: 10 μg/mL
GeltrexInvitrogenA1413202基底膜マトリックス;ストック濃度:100x
hPSCsThomson et al., (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN)VWR/Corning47743-654ストック濃度:1 mg/mL
L-グルタミンThermo Fisher/Gibco25030-081ストック濃度:200 mM
LNタンクカスタムバイオジェニックシステムV-1500AB
MEAリーダーアクシオン・バイオシステムズ・マエストロ・プロ
マウス・ラミニンI(LM)R&D Systems3400-010-01ストック濃度:1 mg/mL
N2 サプリメントThermo Fisher/Life Technologies17502-048ストック濃度:100x
Neurobasal mediumgibco21103-049ストック濃度:1x
NGFPeproTech450-01ストック濃度:25 μg/mL
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Gibco14190-136ストック濃度:1x
ポリ-L-オルニチン臭化水素酸塩 (PO)SigmaP3655ストック濃度:15 mg/mL
プリモシン (抗生物質)InvivoGenANTPM1ストック濃度:50 mg/mL
qPCR マシンバイオ・ラッド ラボラトリーズC1000 タッチ
qPCR プレートバイオ・ラッド ラボラトリーズHSP9601
組換え FGF2R&D Systems233-FB/CFストック濃度: 10 μg/mL
レチノイン酸SigmaR2625ストック濃度:1 mM
SB431542Tocris/R&D Systems1614ストック濃度:10 mM
トリパンブルーコーニングMT-25-900-CI
ビトロネクチン (VTN)サーモフィッシャー/ライフテクノロジーA14700ストック濃度:0.5 mg/mL
ウォーターバスVWR/コーニング706308
Y27632R&D Systems1254ストック濃度:10 mM
希釈 希釈 希釈 希釈 抗体 希釈 希釈 希釈 ズ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-ind....

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