マウスにおける下腹部および後肢の脳閉回路灌流における確立

サマリー

プロトコルは、膀胱、前立腺、性器、骨、筋肉および足の皮膚を含むマウス下半身の上皮灌流に記載されている。

要約

エクスビボ灌流は、孤立した器官(例えば肝臓、腎臓)の機能を研究するための重要な生理学的ツールである。同時に、マウス器官のサイズが小さいため、骨、膀胱、皮膚、前立腺、生殖器官のエクスビボ灌流は困難であるか、または実現不可能である。ここでは、上記組織を含むマウスの下半身灌流回路を初めて報告するが、主なクリアランス器官(腎臓、肝臓、脾臓)をバイパスする。この回路は、腸骨動脈および静脈の上の腹部大動脈および下大静脈をカニューララットし、末梢血管を焼灼することによって確立される。灌流は、パーフューズン流を最大2時間維持した蠕動ポンプを介して行われる。蛍光レクチンおよびHoechst溶液によるその際の染色では、マイクロバスキュアチュアが正常に浸透していることを確認した。このマウスモデルは、病理学的プロセス、および薬物送達のメカニズム、腫瘍への循環腫瘍細胞の移動/転移、および浸透した器官および組織との免疫系の相互作用を研究するのに非常に有用なツールとなり得る。

概要

孤立した臓器灌流は、もともと移植のための臓器生理学を研究するために開発された^{11、2、3、2,3}そして他の身体システムからの干渉なしに器官の機能の理解を可能にした。例えば、単離した腎臓および心臓灌流は、血行力学の基本原理および血管活性剤の効果を理解するのに非常に有用であったが、肝臓灌流は、健康および疾患組織^{44、5、6、75,6,7}における薬物代謝を含む代謝機能を理解する上で重要であった。さらに、移植を目的とした臓器の生存率と機能を理解する上で、灌流研究は重要であった。癌研究では、単離された腫瘍灌流は、マウス、ラット、および新たに切除されたヒト組織^88、99を用いていくつかのグループによって説明されている。いくつかの単離された腫瘍灌流では、腫瘍を卵巣脂肪パッドに移植し、腸間動脈¹⁰から血管を供給する腫瘍の成長を強制する。Jainグ....

プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、コロラド大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 灌流システムを予熱する

1. 図1Aのカスタマイズされた構成に示すように、すべての水ジャケット部品(パーフューズ貯留槽、湿潤チャンバー、および蓋)に対して37°C循環水浴を開始することにより、手術前に灌流システムを準備する。チューブが清潔であることを確認し、必要に応じて交換してください。パーフューズ量を制限するには、湿潤チャンバ内の気泡トラップをパーフューズト貯留層として使用する(図1B-6)。

2. 血管カテーテル法

1. イゾフルランの獣医麻酔装置を使用して8-10週齢のBALB/cマウスで麻酔を誘発し、3~5%のイゾフルランと酸素流量を0.3 L/minで行います。代わりに、ケタミン/キシラジンまたは腹腔内麻酔の他のタイプを使用してください。2つの方法で麻酔の深さを評価する:つま先ピンチと角膜反射。
2. 4-0シルク縫合糸を針で二重蒸留水にプレウェットします。
3. 麻酔マウスを外科医に向けた発泡スチロールボード上の上の上の上の上の上に置き、前肢と後肢をテープで固定します。....

結果

10mL未満の灌流緩衝液の体積を保ちながら、8~10週齢マウスの腹部大動脈と下の大静脈のカヌレーションを通じて閉回路灌流システムを設置しました。 図3A は、Hoechst 33342およびDyLight 649-レクチンを含むリンガーの溶液で組織を浸透した後の共焦点画像を示す。筋肉、骨髄、精巣、膀胱、前立腺、足の皮膚は、効率的な核および血管染色を示す。 図3B は、ノルマンサーム灌流の3時間後の臓器のヘマトキシリン-エオジン染色を示す。

図 1.単純化された灌流のセットアップ。(A)システムは(1)圧力/流量コントローラ、(2)循環加熱水浴、(3)加熱カバーとカスタ.......

ディスカッション

記載された回路は、様々な研究問題、例えば薬物送達における異なる血清成分および組織障壁の役割、または免疫および幹細胞の密売を調査するために使用することができる。異なる薬物送達システム(例えば、リポソームおよびナノ粒子)は、送達における生理学的および生化学的要因の役割を理解するためにパーフューザートに添加することができる。灌流の持続時間は、研究された組織、科学的目標、およびパーフューズトの組成によって異なる場合があります。ここでは、乳酸とアルブミンを用いたリンガーの溶液からなる基本的な灌流媒体を用いて、最大2時間の灌流の結果を提示する。本研究の目的は、最適な臓器/組織機能と酸素化をサポートするために、灌流媒体や条件を開発し最適化するのではなく、灌流回路を確立することであった。栄養素、ビタミン、ホルモン、および血液細胞の添加は、前の文献で広範囲に調査されており、ヒトおよび動物組織^の研究論文の数十に記載されている多くの灌流メディアと酸素化プロトコル^{7、99、10、11、1.......}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Equipment
3.5x-90xステレオズーム顕微鏡、ブームスタンド、LEDライト付き	Amscope	SKU:SM-3BZ-80S二酸化炭素
、USP	Airgasヘルスケア	19087-5283
焦点顕微鏡	NIKON	ECLIPSE Ti2
高温FIAB		付き使い捨て滅菌焼灼ペンF7244
モイストチャンバーバブルトラップ(図1のパート6)	ハーバード製装置	733692	パーフィセート容器としてカスタマイズ、定圧灌流も可能に
石英窓付きモイストチャンバーカバー(図1のパート3)		チャンバーの温度を保つ	ハーバード733524製装置
金属管式熱交換器付きモイストチャンバー	ハーバード製装置	732901	灌流液とマウスの温度を維持するための蓋付きウォータージャケット付きモイストチャンバー
縫合カッター付きオルセン・ヘガー針ホルダー	ファインサイエンスツール(FST)	125014
酸素圧縮、USP	エアガスヘルスケア	C2649150AE06
ローラーポンプ(図1のパート4)		イストチャンバー
SCP plugsysサーボ制御F /灌流(図1のパート1)	追跡速度を制御する	ハーバード装置	732806
パッドハーバー	ド装置
チューブセット(図1の矢印)	ハーバード装置(TYGON)	733456
学生標準パターン鉗子	ファインサイエンスツール(FST)	91100-12
外科用ハサミ	ファインサイエンスツール(FST)	14001-14
モイストチャンバー用テーブル	ハーバード装置	734198
サーモサーキュレーター(図1のパート2)	ハーバード装置	724927	すべてのウォータージャケットコンポーネント用の循環ウォーターバス
3ウェイストップコック(図1のパート5)	コールパー	マー30600-02
獣医麻酔器	ハイランド	HME109
Materials
19-G BD PrecisionGlideの針	BD	305186	Insyte Autoguard 翼のある針を固定し、皮質骨を引っ掻くため
4-0 シルク縫合	Keebomed-Hopemedical	427411
6-0 シルク縫合	Keebomed-Hopemedical	427401
フィルター (0.2 &マイクロ;m)	ThermoFisher	42225-CA	Filter for 5% BSA-RINGER' (5% BSA-RINGER用)S
油性マーカー	Staedtler	342-9
シリンジ (10 mL)	Fisher Scientific	14-823-2E
シリンジ (60 mL)	BD	309653	Filter for 5% BSA-RINGER'S
試薬
1% エバンス ブルー ( w/v ) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH 7.5)	シグマ	314-13-6
10% 緩衝ホルマリン	velleyvet	36692
BALB/c マウス ( 8-10 週齢)	Charles River
Baxter Viaflex lactate Ringer's solution	EMRN Medical Supplies Inc.	JB2324
ウシ血清アルブミン	サーモフィッシャー	11021-037
シアノアクリレート接着剤	Krazy Glue
DyLight-649-lectin	Vector Laboratories,Inc.	ZB1214
エタノール(70%(vol / vol))	Pharmco	111000190
Hoechst33342	Life Technologies	H3570
Isoflurane	Piramal Enterprises Limited	66794-017-25
リン酸塩緩衝生理食塩水	Gibco	10010023

共モ内のカニューレに灌流液を送達するハーバード製装置730113のシリコンシリコーン糸 糸