Method Article

ライブセルにおけるeIF4E-eIF4G相互作用を測定してeIF4Fアセンブリをモニタリング

DOI:

10.3791/60850

⸱

May 1st, 2020

 ,  , 
1p53 Laboratory, Neuros/Immunos, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research)

In This Article

Summary

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ここでは、スクリーニングフォーマットにおけるeIF4F複合ダイナミクスの薬物誘発摂動を評価することを可能にする生細胞におけるeIF4E-eIF4G相互作用を測定するプロトコルを提示する。

Abstract

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eIF4F複合体の形成は、ヒトにおいてしばしば発癌活性化を受けるシグナル伝達経路の収束のための主要な下流節であることが示されている。eIF4Fは、翻訳開始のmRNA-リボソーム採用段階に関与するキャップ結合複合体である。多くの癌の細胞および前臨床モデルにおいて、eIF4Fの調節緩和は癌の増殖および生存に関与する特定のmRNAサブセットの翻訳の増加をもたらす。eIF4Fは、キャップ結合サブユニットeIF4E、ヘリケースeIF4Aおよび足場サブユニットeIF4Gから構築されたヘテロ三量体複合体である。活性eIF4F複合体の組み立てに重要なのは、eIF4EとeIF4Gタンパク質のタンパク質間相互作用です。この記事では、ライブセルにおけるeIF4E-eIF4G相互作用の状態を監視するeIF4Fアセンブリを測定するプロトコルについて説明します。eIF4e:4G細胞タンパク質-タンパク質相互作用アッセイは、eIF4F複合体完全性における薬物誘発変化を正確かつ確実に評価することを可能にします。この方法は、市販の化合物の活性を検証したり、eIF4F複合体の形成を効率的に妨害する新規化合物やモダリティのさらなるスクリーニングに応用できると考えています。

Introduction

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遺伝子発現の制御は、増殖増殖や分化などの細胞プログラムの正しい実行において極めて重要な役割を果たす。調節制御機構は、遺伝子転写のレベルまたはmRNA翻訳のレベルで発揮することができます。過去10年間で、伸びと終了の後半のステップではなく、開始プロセスの変調による翻訳制御が、幅広い生物学的機能を果たすタンパク質の特定のサブセットの合成を細かく調節できることがますます明らかになりました。

生存に関与するmRNAの翻訳の増加は、抗オートファジーおよび抗アポトーシス応答がいくつかの癌に関与しており、また、異常活性化または翻訳開始因子1の発現を介して関連している。

eIF4F複合体は翻訳開始のマスターレギュレータです。5'mRNA末端にキャップ構造を結合することにより、eIF4Fは、初期mRNA-リボソームの採用を推進し、今度は弱く翻訳された真核生物mRNA2のmRNA翻訳効率を高めている。EIF4Fは、RAS/MAPKまたはAKT/TOR経路の異常活性化を有する多くの癌モデルに対して癌関連mRNAの媒介翻訳が報告されており、癌細胞が独自の腫瘍性腫瘍性活性を高めるためにeIF4Fをアップレコンドすることを示唆している。eIF4F複合体形成を阻害することによってこのフィードフォワードループの破壊は、これにより非常に有望な治療戦略

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Protocol

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HEK293細胞株はプロトコルに使用され、10%のウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、および100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシンを添加したダルベックコの修飾イーグル培地で培養された。細胞を加湿環境下で5%CO2 で37°Cで培養した。

1. eIF4E:eIF4G604-646 相補分析によるeIF4F複合破壊の定量的評価

  1. eIF4Eの細胞培養と一過性トランスフェクション:eIF4G604-646 相補アッセイ
    1. すべての実験のために20の通過未満で解凍した細胞を使用してください。1 日目に、標準セル カウンタを使用してセル番号を決定し、Trypan blue 除外方法13を使用して生存可能なセルの総数をカウントします。
    2. 標準成長培地の2 mLで1ウェルあたり0.9 -1.2 x 106 のHEK 293細胞を含む6ウェルプレートをシード。
      注:上記の細胞株内で最高のトランスフェクション効率を達成するために、播種の翌日にメッキされた細胞が70〜90%コンフルエントであることを確認してください。
    3. 2日目の朝、以下に説明する脂質系トランスフェクション試薬を用いたSubA-eIF4EおよびeIF4G604-646-SubBプラスミ....

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Results

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eIF4E:eIF4G604-646 相補系の感度を検証するために、4EBP1媒介性eIF4F複合体集合体の阻害をmTOR阻害剤を用いて評価した。4EBPタンパク質ファミリーのmTORC1キナーゼ依存性リン酸化を阻害することにより、mTOR阻害は、eIF4Eに対する4EBP1会合を増強し、したがって、eIF4F分解15を増強する。mTORC1のアロステリック阻害剤であるがmTORC2およびATP競合ベースの阻害剤(例えば、PP242)のmTORC1およびmTORC2キナーゼの両方を特異的に阻害するように設計されたラパログ(例えば、ラパマイシン)の2つのクラスが試験された。

HEK293細胞は、ステップ1に記載されているようにeIF4E:eIF4G604-646 相補系でトランスフェクトした。24時間のトランスフェクションの後、細胞を再播種し、mTOR阻害剤PP2.......

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Discussion

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本稿で説明する方法は、生細胞におけるeIF4G-eIF4E相互作用の直接測定を通じてeIF4F複合体集合体を定量的に監視するためのルシメラーゼベースの相補アッセイを利用する。我々は、eIF4E-eIF4G相補システムの使用に関する詳細を提供しており、また、このシステムが、eIF4E-eIF4G相互作用16の薬物誘発4EBP1媒介解離解を測定する際に極めて正確であることを示した。このアッセイのスループットを容易にするために、この記事で説明する実験用セットアップは、96ウェルマイクロプレート形式の使用のために設計されています。

最適な結果を得るには、アッセイを行う際に2つの重要なステップを考慮する必要があります。まず、実験間のトランスフェクション効率は同様であるべきである。これは、低い通過数細胞の使用を通じて、そして厳密に播種の日に細胞を数えることによって保証することができる。細胞の合流度が70-90%未満の場合、脂質ベースのトランスフェクション試薬で細胞をトランスフェクションすることは推奨されないので、DNAトランスフェクションが行われ.......

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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この作業は、p53lab (BMSI、A*STAR) および JCO VIP 認可 (A*STAR) からのコア予算によって支えられた。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
293FT細胞サーモフィッシャーサイエンティフィックR70007
細胞培養マイクロプレート 96ウェル、Fボトムグライナーバイオワン655083
細胞力価 Glo 2.0PROMEGAG9241
Envision マルチラベルリーダーPerkinElmernot applcable
F2 マルチチャンネルピペット 12チャンネル 30-300 mlサーモフィッシャーサイエンティフィック4662070
ピペットF2マルチチャンネルピペット 12チャンネル5-50mlサーモフィッシャーサイエンティフィック4662050
FUGENE6プロメガE2692
ポフェクタミン3000サーモフィッシャーサイエンティフィックL3000015
NanoBiT PPIスターターシステムPROMEGAN2014
Optimem I還元血清中央値、フェノールレッドなしサーモフィッシャーサイエンティフィック11058021
オービタルシェーカーエッペンドルフは適用
&γ;-アミノフェニル-m7GTP(C10-spacer)-アガロースイエナバイオサイエンスAC-155S
フィンリできません

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular Mechanism of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).
  3. Bhat, M., ....

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