小麦粒代謝物および脂質の非標的分析法を紹介する。このプロトコルは、アセトニトリル代謝産物抽出法と逆相液体クロマトグラフィー質量分析法法を含み、正および負のエレクトロスプレーイオン化モードでの取得を伴う。
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この記事について
サマリー
要約
遺伝子間の相互作用、農業における環境と管理を理解することで、製品収量と品質をより正確に予測し、管理することができます。メタボロミクスデータは、特定の時点でこれらの相互作用の読み取りを提供し、生物の生化学的状態を有益にします。さらに、個々の代謝産物または代謝産物のパネルは、収量および品質予測および管理のための正確なバイオマーカーとして使用することができる。植物のメタボロムは、生理学的特徴とバイオマーカー発見に生化学的洞察の機会を提供する様々な物理化学的特性を有する何千もの小分子を含むことが予測される。これを利用するために、メタボロミクス研究者にとって重要な目的は、単一の分析で可能な限り多くの物理化学的多様性を捉えるためです。ここでは、フィールド成長小麦の分析のための液体クロマトグラフィー質量分析ベースの未標的メタボロミクス法を提示する。この方法は、液体クロマトグラフ四級溶媒マネージャーを使用して第3移動相を導入し、従来の逆相勾配と脂質を受け入れ可能な勾配と組み合わせたものです。穀物調製、代謝物抽出、器械分析およびデータ処理ワークフローについて詳細に説明する。質量精度と信号再現性が良好で、この方法はイオン化モードごとに約500の生物学的関連特徴を生み出した。また、小麦品種間の代謝産物および脂質特徴シグナルが有意に異なって決定された。
概要
農業における遺伝子、環境、管理慣行の相互作用を理解することで、製品の収量と品質をより正確に予測し、管理することができます。植物代謝物は、ゲノム、環境(気候、降雨など)などの要因の影響を受け、農業環境では作物の管理方法(肥料の適用、殺菌剤など)が影響を受けます。ゲノムとは異なり、メタボロームはこれらの要因の影響を受けるため、メタボロミクスデータは特定の時点でこれらの相互作用の生化学的指紋を提供する。メタボロミクスベースの研究には通常、生物の生化学の深い理解を達成し、生理学に関連して摂動(非生物的または生物的ストレス)への応答メカニズムを説明するのを助けるという2つの目標のうちの1つがあります。そして第二に、バイオマーカーを研究中の摂動と関連付ける。どちらの場合も、この知識を持つことの結果は、歩留まりのサイズと品質を向上させるという目標を達成するためのより正確な管理戦略です。
植物のメタボロムは、様々な物理化学的特性を有する数千1個の小分子を含むと予測されている。現在、メタボロミクスプラットフォーム(主に質量分析と核磁気共鳴分光法)は、単一の分析でメタボローム全体を捕捉することはできません。メタボロミクス研究者にとって、メタボロムの可能な範囲を可能な限り多く提供するこのような技術(サンプル調製、代謝産物抽出および分析)の開発は、メタボロミクス研究者にとって重要な目的です。小麦粒の以前のターゲットを持っていないメタボロミクス分析は、複....
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プロトコル
この方法は、30サンプル(サンプルあたり約150シード)に適しています。ここでは、10種類の畑で栽培された小麦品種の3つの生物学的複製が使用されました。
1. 穀物の調製
- サンプル(全粒粉)を-80°Cの貯蔵から取り出す。
注:サンプルが複数の季節から収集されている場合は、収穫後すぐに種子の凍結乾燥をお勧めします。これは、保存期間の変化の後に発生する代謝産物濃度の変化を最小限に抑えます。これを行うには、15 mLプラスチック遠心管(約300種の種子がチューブを充填します)に種子を移し、アルミホイルで覆います。ピンを使用してホイルを2〜3回突き刺し、一晩(約24時間)全粒穀物を凍結乾燥させます。サンプルは、この段階で-80°Cの冷凍庫に戻すか、次の工程を行うことができる。 - 20 sのハイモードで2回実行するための実験室ブレンダーを使用して種子を粉砕します。
注:このプロトコルに使用されるブレンダーは、ブレンダーをブレードの高さに充填し、比較的均質な粉砕粒サンプルを与えるために約150シードを必要とします。 - ベースからブレンダーを取り出し、ブレンダーの側面をタップして、粗い粉砕された穀物をサンプルの表面に持ち込みます。粗い材料は廃棄するか、または保存することができます。
- ブレンダーから2 mLプラスチックマイクロ遠心チューブに粉末状の細かく粉砕した材料を移します。
注:ブレンダーを脱....
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結果
植物のメタボロメは、そのゲノムと環境の組み合わせ、さらに農業環境、作物管理体制の影響を受けます。我々は、小麦品種間の遺伝的差異が代謝産物レベルで観察され得、ここでは、500以上の測定化合物が穀物単独の品種間で有意に異なる濃度を示すことを実証する。良好な質量精度(<10 ppm誤差)および内部標準の信号再現性(<20%RSD)は、Figure 2負と正のイオン化モードの両方について観察された(表3)。記載されたサンプル調製および液体クロマトグラフィー質量分析ベースの解析により、負イオン化モードで900畳み込んだ特徴と、正のイオン化モードでの>1300デコンボルト特徴が得られた。サンプル調製法および分析方法がアーティファクト特徴を導入したかどうかを判断するために、調製ブランク(図3)を含め、したがって、データマトリックスから排除されたすべての非生物学的影響を決定した。負モードでは421個、正モードでは835.......
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ディスカッション
ここでは、小麦の分析のためのLC-MSベースの非標的メタボロミクス法を紹介する。この方法は、逆相勾配に第3移動相を導入することにより、4つの取得モード(逆相および脂質アメ有効逆相と正イオン化と正負イオン化を伴う)を2つのモードに組み合わせたものです。組み合わせアプローチは、イオン極性あたり約500の生物学的関連特徴を生み出し、その約半分は小麦品種間の強度が有意に異なった。異なる小麦品種の穀物中の代謝産物濃度の有意な変化は、変化した生化学を示し、これは穀物の品質および収量にとって重要な疾患耐性、ストレス耐性および他の表向きの形質に関連している可能性がある。例えば、メタボロミクスのアプローチは、新たな防御機構12を記述し、干ばつ許容度13における代謝産物の役割を提案するために用いられてきた。このプロトコルの将来の応用は、特定の環境および管理の実践のために望ましい遺伝的形質に特定の品種の生化学的プロファイルをさらにリンクすることができるかもしれない。これにより、選択した遺伝子型に最適な粒度と収率が得られます。
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
著者らは、西オーストラリア州首相の農業・食糧フェローシップ・プログラム(西オーストラリア州政府の雇用・観光・科学・イノベーション省)とサイモン・クック教授(センター)を認めたい。デジタル農業、カーティン大学、マードック大学)。フィールドトライアルと穀物サンプルコレクションは、西オーストラリア州の地域ロイヤリティプログラムの政府によって支援されました。グラントリー・ステイナーとロバート・フレンチがフィールドトライアルに貢献したのを認めます。NCRISが出資するバイオプラットフォームオーストラリアは、機器の資金調達で認められています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 13C6-ソルビトール | メルク Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-アミノアントラセン | メルク Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| アセトニトリル | サーモフィッシャー サイエンティフィック | FSBA955-4 | Optima LC-MS グレード |
| ギ酸アンモニウム | メルク Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | バージョン 1.7 | |
| AnalyzerProソフトウェア | SpectralWorks Ltd. | 手順7.2で使用するデータ処理ソフトウェア。バージョン5.7 | |
| AnalyzerPro XDソートウェア | SpectralWorks株式会社 | 手順7.5で使用するデータ処理ソフトウェア。バージョン1.4 | |
| ザ | ルトリウスのバランス。Precision Balances Pty. Ltd. (プレシジョンバランス) | ||
| d6-トランスケイ皮酸 | Isotec | 513962-250 mg | |
| ギ酸 | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| 凍結乾燥機 (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott ボトル (100 mL、500 mL、1 L) | |||
| ガラスバイアル (2 mL) およびスクリューキャップ蓋 (スリット済み) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (バイアル)、VSS-SC91191 (蓋) | |
| Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| 用取り付けキットイソプロパノール | サーモフィッシャーサイエンティフィック | FSBA464-4 | オプティマ LC-MS グレード |
| ラボ用ブレンダー | ワーリング 商用 | モデル HGBTWTS3 | |
| ロイシン-エンケファリン | ウォーターズ | p/n 700008842 | チューニングソリューション |
| メタボアナリスト | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | ハイスループットメタボロミクスのためのWebベースの分析パイプライン。無料のWebベースのツール。バージョン4.0。 | |
| メタノール | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS グレード |
| ミコナゾール | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| 微量遠心分離機 (Eppendorf 5415R) | エッペンドルフ (Crown Scientific Pty. Ltd. 販売) | 5426 No. 0021716 | |
| 微量遠心チューブ (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View ソフトウェア | Sciex | バージョン 1.2 (64 ビット) | |
| ピペットチップ (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| ピペット (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| プラスチック遠心チューブ (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll 分子探索解析ソフトウェア。バージョン 2.3 (64 ビット) | |
| Sciex 5600 トリプル ToF 質量分析計 | Sciex | ||
| スクリューキャップ溶解チューブ (2 mL) セラミックビーズ付き | Bertin Technologies | ||
| ギ酸ナトリウム | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| 組織溶解器/ホモジナイザー | Bertin Technologies | シリアル0001620 | |
| メスフラスコ (10 mL、50 mL、100 mL、200 mL、1 L) | |||
| ボルテックスミキサー | IKA Works株式会社(Crown Scientific Pty. Ltd.が販売) | 001722 | |
| ウォーター | サーモフィッシャーサイエンティフィック | FSBW6-4 | Optima LC-MS グレード |
| ウォーターズ・アクイティ LC システム、クオータナリーポンプ搭載 | ウォーターズ | ||
| ・ウォーターズ・アクイティ UPLC 100mm HSST3 C18 カラム | ウォーターズ | 製品 p/n 186005614 |
参考文献
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotyp....
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