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方法論記事

動物の香り信号のサンプリングと解析

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DOI:

10.3791/60902

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2021年2月13日

 , 
1Department of Biology, Chemistry and Forensic Science, University of Wolverhampton, 2Department of Anthropology & Behavior, Ecology and Evolution Research Centre, Durham University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

動物のコミュニケーションに使用される方法を理解するために、匂い信号のサンプリングと分析に効果的な方法論を開発しました。特に、ヘッドスペース固相微小抽出とガスクロマトグラフィー質量分析法を用いて、動物の臭気や香りマーキングの揮発性成分を解析しています。

要約

ヘッドスペース固相微小分抽出とガスクロマトグラフィー質量分析法を併用し、動物のコミュニケーションにどう使われるかを理解することで、臭気信号のサンプリングと分析に効果的な方法論を開発しました。この技術により、サンプル中の成分の分離と仮同定を可能にし、続いてピーク面積比を分析して、シグナル伝達に関与する可能性のある化合物を示す傾向を探すことによって、臭気分泌物の揮発性成分を半定量的に分析することができます。このアプローチの主な強みは、分析できるサンプルタイプの範囲です。複雑なサンプル調製または抽出の必要性の欠如;混合物の成分を分離し、分析する能力。検出されたコンポーネントの識別。検出されたコンポーネントに関する半定量的かつ定量的な情報を提供する能力。方法論の主な制限は、サンプル自体に関連しています。特定の関心の成分は揮発性であり、これらは容易に失われるか、またはそれらの濃度が変化する可能性があるため、サンプルを収集した後に適切に保存し、輸送することが重要です。これはまた、サンプルの保管および輸送条件が比較的コストがかかることを意味します。この方法は、様々なサンプル(尿、便、毛髪、香り-腺臭い分泌物を含む)に適用することができます。これらの臭気は、複雑な混合物からなり、マトリックスの範囲で発生し、したがって、個々の成分を分離し、生物学的関心の化合物を抽出する技術の使用を必要とする。

概要

動物1の嗅覚信号を支える化学的変化についてはほとんど知られていないが、また、臭気の揮発性化学プロファイルを記録および定量する方法論的な課題のために2。非常に複雑な化学マトリックスを扱う場合、いくつかの潜在的な落とし穴があります。これらには、臭いサンプル3をサンプリングして分析する際に含まれます。

ウォルヴァーハンプトン大学ロザリンド・フランクリン科学センターでは、動物がどのように使用されるのかを理解するために、臭いや香りの分析を行っています。化学と行動生態学、内分泌学、細胞診を組み合わせて、動物のコミュニケーションにおける嗅覚信号の役割の理解を深めます。

方法論を開発し、ヒト以外の霊長類(すなわち、キツネザル、赤いキツネザル、日本のマカク、オリーブヒヒ、チンパンジー)、その他の哺乳類(猫、牛など)を含む様々な種の臭気やマーキングを分析しました。尿、便、毛髪、香り臭気分など、さまざまなサンプルを収集・解析しています。これらの臭気と香りマークは、化合物の複雑な混合物で構成されているので、分析に使用される方法論は、セパレーター技術の何らかの形を含める必要があります。図示されているように、それらはまた、興味のある成分を抽出する技術の使用を必要とする行列の範囲で発生する。

Vaglioら4および他 の著者5 によるこれまでの研究では、直接溶媒抽出6 および複雑な溶媒抽出7 を用いた一方で、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)を用いた動的ヘッドスペース抽出(DHS)を用いた。特に、動的ヘッドスペースサンプリングでは、サンプルマトリックス(例えば、水性サンプル中の極性化合物)に強い親和性を示す化合物を除き、すべての揮発性化合物を最終的に除去する既知の不活性ガスの体積でヘッドスペースをパージする必要があります。

現在の方法論では、ヘッドスペース固相微小抽出(HS-SPME)とGC-MSの技術を採用しています。特に、我々は、以前のGC-MSの実験室8、9、10でVaglioらによって既に使用されている方法論を開発し、強化した。

溶媒のない抽出技術は、これらの方法が安定した固相支持体上で化合物を固定化するため、小さく、揮発性の高い化合物(サンプルから容易に失われる可能性がある)を分析するのに非常に効果的です。HS-SPMEは、吸着性ポリマーで被覆された繊維を用いて、試料ヘッドスペース内の揮発性化合物を捕捉したり、水性生物学的流体11に浸漬して溶解化合物を抽出したりする。ポリマーコーティングは化合物を強く結合しないため、よってGCの注入口で加熱することによって、それらが除去できる。この方法は、溶媒抽出技術よりも強力であり、DHSよりも効果的です。

現在のアプローチでは、サンプルはガラスバイアル内に含まれています。これらのバイアルは、バイアルのヘッドスペースを占有するために香りマークの揮発性成分を促進するために動物の体温をシミュレートするために40°Cの温度に温めます。65μmのポリジメチルシロキサン/ジビニルベンゼン(PDMS/DVB)吸着材でコーティングされたSPME繊維はヘッドスペース環境にさらされ、サンプルからの揮発性成分は繊維に吸着されます。GC-MSの入口ポートで繊維を加熱すると、揮発性成分は繊維から脱離され、次いでGCによって分離される。質量スペクトル断片化パターンは、MSを用いて各成分について得られる。これらの質量スペクトルを質量スペクトルデータベースと比較することにより、香りマークの成分を仮に特定することができる。オートサンプラーを使用して、複数のサンプルを一貫した方法でバッチで分析することができます。

SPME繊維の各タイプが極性化学物質との親和性が異なることを考えると、繊維は通常、対象の化学化合物の極性および/または分子量に応じて選択されます。また、GCカラムの種類や対象の化学化合物の特性によってGC条件も変化します。

この技術により、サンプル中の成分の分離と仮識別を可能にし、続いてピーク面積比を分析して、シグナリングに関与する可能性のある香りマーキングの成分を示す傾向を探すことによって、香りマーキングの揮発性成分の半定量的分析が可能になります。

この現在のアプローチの主な強みは次のとおりです。

  • 分析できるサンプルタイプの範囲。
  • 複雑なサンプル調製や抽出は必要ありません。
  • 揮発性成分を分析する機能。
  • 混合物の成分を分離する能力。
  • 検出されたコンポーネントを識別できるように。
  • 検出されたコンポーネントに関する半定量的および定量的な情報を提供する能力。

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プロトコル

1. サンプルコレクション

  1. 次のいずれかである臭気のサンプル:
    1. 滅菌濾紙の香り印(例えば、香り腺臭分泌物)またはバイアル(例えば、尿)に直接に、習慣的な研究対象(例えば、動物園霊長類)によって自発的に放出を収集する。
    2. 試験科目をトレーニングした後、無菌綿棒を積極的な強化トレーニングを使用してこすり取って収集します。
    3. 研究対象者のセドレーション後に滅菌綿棒をこすって収集します。
  2. サンプルを滅菌10 mLねじ込み透明ガラスバイアルに入れ、FTFE/シリコーンセプタを組み込んだスクリュートッピングキャップでシールします。すぐに-20°Cで保管してください。
    注意:ニトリル手袋のような清潔な個人用保護具を使用することが重要です。頻繁に変更する。サンプルおよびバイアルとの直接の皮膚接触を避ける。新しいバイアルを使用することが好ましいです。ただし、使用されたバイアルの場合は、バイアルを事前に清掃してから、同じプロトコルを使用することが重要です。
  3. 香りのマークが収集されるたびに環境ブランクを取ります。例えば、サンプリング媒体(例えば、フィルターペーパーや綿棒)とサンプリングが行われている間に環境に露出されるヘッドスペースバイアルを収集する。

2. サンプル準備

  1. 香り印のろ紙または綿棒の頭部から約10mmの正方形の刃で切断し、10 mLねじを覆ったヘッドスペースバイアルに入れることで、現場でサンプルを準備します。
  2. 各サンプルを調製したら、適切な抗菌ワイプまたはアルコールを使用してサンプリング媒体を切断するために使用されるブレードを処分または洗浄し、十分に乾燥させます。
  3. すべてのサンプルを-20 °Cで保管してください。
    注:-20°Cで好ましいか、それ以外の場合は、フィールド内で実質的に可能な限り低く。

3. 分析の準備

  1. 冷凍庫からサンプルを取り出し、少なくとも1時間室温まで自然に温めます。
  2. GC-MS の分析方法を次のように設定します。
    1. SPME分析条件については、最初の使用前にSPME繊維を条件とするメーカーの指示に従ってください:繊維前条件(5分間260°C)、サンプルインキュベーション(2分間40°C)、抽出時間(15分)、脱着時間(2分)、繊維ポストコンディション(260°C20分)
    2. 次のGC条件を使用してください:カラム(HP5-MS 30 m x 0.25 mm;0.25 μm)、インジェクター温度(270°C)、流量(1mL/min)、注入モード(スプリットレス)、GCオーブンプロファイル(45°C2分、4°C/分~170°C、20°C/分~300°C)、MSD°C(20°C~300°C)、28°C(20°C)、28°C°C(°C)、28°C°C(20°C)の転写(20°C)、リジェクション
      注: サンプル保持時間の整合性を改善するために、分析方法は保持時間ロックです)。
    3. 以下の MSD 条件を使用してください: 溶媒遅延 (2.5 分) およびスキャン範囲 (29 から 400 amu)。
      注 : 以前のプロトコル4では、10 ~ 400 の範囲が使用されていました。
  3. 繊維調節ユニットへのパージガス供給がオンになっていることを確認します。
    注: SPME アセンブリがオートサンプラーに正しく取り付けられ、自動サンプラー トレイ、ファイバ コンディショニング ユニット、GC インレット ポートに位置合わせされていることが重要です。正しく配置されないと、SPME ファイバが破損または破壊される可能性があります。

4. 分析

  1. GC-MS 自動サンプラー トレイの最初の位置に空のヘッドスペース バイアル (システムブランクとして機能する) を配置します。自動サンプラートレイの 2 番目の位置に環境ブランクを置きます。自動サンプル トレイの後続の位置に、分析用のサンプルを配置します。
  2. サンプル トレイ内の各サンプルを分析する解析シーケンスを作成します。
    1. マスハンターのホーム画面で、 シーケンス|読み込みシーケンス。
    2. 該当する情報を挿入して、すべてのブランクおよびサンプルのシーケンス表を完成させます。完了したシーケンス テーブルを保存します。
      注: シーケンス テーブルの正確な情報は、テーブルのラボの書式によって異なります。最小情報には、通常、サンプルタイプ、サンプル名、バイアルの場所と数、分析方法とデータファイルの場所と名前(サンプル名に一致するデータファイル名の割り当てが将来のデータ処理を支援する)が含まれます。解析中に、その他のサンプルをシーケンスに追加できます。
  3. シーケンスを実行するには、[ シーケンス]|実行シーケンス:
  4. 分析後、できるだけ早く冷凍庫にサンプルを返します。
    注:サンプルを再分析することは可能かもしれませんが、初期分析中に一部の揮発性成分が完全に抽出された可能性があり、一部の化合物が40°Cで熱分解および細菌分解を受けた可能性があるため、得られたクロマトグラムは元の香りマーキングを完全に表すものではありません。

5. データ分析

注:初期データ分析には、Chromatogramsの統合が含まれており、ChemStationソフトウェアとNIST(米国規格技術研究所)の質量スペクトルデータベース、バージョンMSD F.01.01.2317を使用して、ピークの仮の識別と一緒に保持時間とピークエリアデータを取得します。データ分析は、手動で行うか、半自動方式で行うことができます。半自動方式を使用する場合、仮の識別を検証するために、ある程度の手動データ分析を行う方が有益な場合があります。

  1. 左側のナビゲーション バーで該当するファイルをクリックして、データ ファイルを開きます。全イオンクロマトグラム(TIC)がデータ分析画面の上部ウィンドウに表示されます。
  2. RTE インテグレーターを使用して TIC を統合するには、 クロマトグラム |統合.
  3. 3 x ベースラインノイズを超えるピークが統合されるように、積分パラメータを調整します。 クロマトグラム|を選択MS シグナル統合パラメータ :出力ボックスで、必要に応じて最小ピーク領域を調整します(1.0 は、この例では許容可能な結果を生成します)。
  4. ピークを特定して概要レポートを生成するには、[レポートのエクスポート] を選択|ライブラリの検索結果は XLS にレポートされます。
    注: 表示するライブラリ一致の数と一緒に検索するスペクトル ライブラリは、ライブラリの検索を行う前に、ソフトウェア内で事前設定する必要があります。
  5. 結果のスプレッドシート レポートには、各ピークの統合データと、ID を割り当てる一時的なスペクトル ライブラリの一致が含まれます。一般的に、ライブラリの品質/ライブラリの一致は仮の識別を受け入れる>80でなければなりません。スプレッドシートを保存します。
  6. TIC から直接ピークを特定します。
    1. 関心のピークを選択します。
    2. ピークが小さい場合は、マウスの左ボタンを押しながらピークの周囲にボックスを描画して拡大し、ボックスをピーク上に伸ばして離します。
    3. ピークの最高点 (または直後) になるようにカーソル行を配置します。
    4. マウスの右ボタンをダブルクリックすると、ピークのマススペクトルがデータ分析画面の下部ウィンドウに表示されます。
    5. スペクトルライブラリを検索するには、スペクトルウィンドウ内の任意の場所にカーソルを移動し、マウスの右ボタンをダブルクリックします。ライブラリの検索結果が新しいウィンドウに表示されます。
    6. 関心のあるスペクトラムからバックグラウンドノイズを除去するには、まず問題のピーク上でマウスの右ボタンをダブルクリックします。その後、関心のピークの直前にピークがない領域で右マウスボタンをダブルクリックします。 クロマトグラム|を選択スペクトルを減算する。減算されたスペクトルは、データ分析画面の下部ウィンドウに表示され、ウィンドウヘッダーのSCANデータの横に'(-)'と表示されます。

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結果

このプロトコルに従って、赤いキツネザル(バレシア・バリガタ・ルブラ)によってフィルター紙に自発的に放出された14のアノ・生殖器の香りマークの分析から合計32の揮発性化学化合物を暫定的に同定し、臭気プロファイルをシグナ12の特徴と比較した。炭化水素、テルペン、テルペンアルコール、ケトンなどの天然に存在する揮発性化合物は、これらのプロファイル内に存在し、以前はセックスフェロモンとして機能し、他の動物種のフィットネスに手がかりとして機能することが判明した化合物が含まれていました。仮に特定された化合物を 表 1に示します。代表的なクロマトグラム (コントロールから 1 つ、キツネザルの香りマークから 1) を 図 1に示します。成分の数と相対的な存在量は、異なる研究対象間でサンプルからサンプルまで変化した。しかし、6つの化合物(ベンズアルデヒド、2-エチル-1-ヘキサノール、p-クレゾール、シスp-メンタ-2,8-dien-1-ol、2-ピネン-4-1、ペンタデカン)が全てのサンプルに存...

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ディスカッション

コントロールサンプルの使用は、サンプル収集時に作成された環境制御とシステムブランクの両方で、香りマークサンプルの解釈にとって非常に重要です。サンプリング環境またはインストゥルメンタルシステムに起因するピークは、目的のピークのみが任意の解釈に含まれるように、香りマークサンプルから除外する必要があります。これらのコントロールは、計測器の「健康」を評価し、監視する役割を果たすこともできます。

プロトコルには、各抽出の前後にファイバを条件にする手順が含まれています。これは自動サンプラーの使用によってより容易になり、サンプルからサンプルへの交差汚染がないことを保障する。

方法論の主な制限は、サンプル自体に関連しています。コレクションに続いて、それらが適切に格納され、輸送される必要があります。特定の関心の成分は揮発性であり、これらは容易に失われるか、またはそれらの濃度が変化する可能性があります。現在、サンプルは保存され、通常は-20°Cで凍結して輸送されます。 その結果、これらのサンプルの保管と輸送に大きなコストがかかります。分析のために...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

私たちは、ビデオの制作のためにロザリンドフランクリン科学センター、ウォルヴァーハンプトン、ベンマントルでの化学分析に彼の支援のためにキースホールディングに感謝します。また、グロリアーナノ・モネティ教授、ジュゼッペ・ピエラッチーニ博士、フィレンツェ大学質量分析センターのメンバー、CNRのARCAラボ(フィレンツェ)のルカ・カラマイ教授とマルコ・ミケロッツィ博士に感謝しています。原稿に記載されているサンプリングと分析方法を含む研究プロジェクトは、2つのマリー・スクウォトフスカ・キュリー・イントラ・ヨーロピアン・フェローシップ(助成金契約ID:327083、703611)、英国霊長類協会からの小さな助成金('感覚的に豊かな霊長類')、そして小さな研究助成金('狩猟採集者は特別な匂いを持っていますか?この方法論を設定するために必要なラボの作業は、理工学部の年次資金調達コンペティション(ウォルヴァーハンプトン)からS.V.への資金も受け取りました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10 mLオートサンプラーバイアルAgilent5188-539210 mlスクリュートップバイアル、
18 mmバイアルキャップAgilent8010-0139マグネティック、PTFE/シリコンセプタム
オートサンプラー AgilentGC120 PALオートサンプラー
キャピラリーカラムAgilentHP5-MS30 m x 0.25 mm; 0.25 & micro;m
データ解析ソフトウェアAgilent-ChemStation
ガスクロマトグラフAgilent7890B
インレットセプタAgilent5182-3442Merlin microseal
質量選択検出器Agilent5977A
レポーティングソフトウェアMicrosoft-Excel
スペクトルライブラリNIST-NIST/EPA/NIH マススペクトルライブラリ
スペクトルライブラリ検索プログラムNIST-MSSearch v.2.2
スプリットレスインレットライナーAgilent5190-4048
SPME ファイバーAgilentSU57345U65 & micro;m PDMS/DVBファイバー
付き 付き

参考文献

  1. Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
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再版と許可

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