イン・ビボヒドロキシルラジカルプロテインフットプリントにおけるカエノハブディティス・エレガンスにおけるタンパク質相互作用の研究

近年、タンパク質の相互作用や立体構造の変化を研究するために、質量分析(MS)に結合したタンパク質フットプリントが使用されています。ヒドロキシルラジカルタンパク質フットプリント(HRPF)法は、タンパク質アミノ酸側鎖を改変することにより、タンパク質溶媒のアクセシビリティをプローブする。HRPF法は、タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)1、インビトロ^2、インセル(IC-FPOP)3、および最近では生体内(IV-FPOP)4においてタンパク質構造をプローブするために使用⁴されてきた。¹³FPOPは、過酸化水素の光分解によりヒドロキシルラジカルを迅速に生成するために248nm波長エキシマレーザーを利用してヒドロキシルラジ^カル1を形成する。さらに、これらのラジカルは、タンパク質が展開するよりも速く、マイクロ秒の時間スケールで20アミノ酸のうち19個をラベル付けすることができます。しかし、ヒドロキシルラジカルを用いた各アミノ酸の反応性は1000倍に及び、保護因子(PF)5を算出して側鎖酸化を⁵正常化することができる。

FPOPは、サイズや一次配列に関係なくタンパク質を酸化的に修飾できるため、細胞内および生体内タンパク質の研究に有利であることが証明されています。IV-FPOPは、インビトロおよびイン細胞研究⁴と同様にC.エレガンスにおけるタンパク質構造をプローブする。C.エレガンスは線虫科の一部であり、ヒトの病気を研究するモデルとして広く使用されています。受動拡散と活性拡散の両方によって過酸化水素を取り込むワームの能力は、異なる身体システムにおけるタンパク質構造の研究を可能にする。さらに、C.エレガンスは、FPOP 6に必要な248 nmレーザー波長での透明度のためにIV-FPOPに適^{しています}。質量分析にこの方法を結合することで、従来のボトムアッププロテオミクスアプローチを用いて複数の改変タンパク質を同定することができます。

このプロトコルでは、C.エレガンスにおけるタンパク質構造解析のためのIV-FPOPの実行方法について説明します。実験プロトコルは、Konermannら⁷から適応したIV-FPOP用のマイクロ流体流動システムの組立とセットアップを必要とする。IV-FPOPの後、サンプルはタンパク質抽出のために均質化される。タンパク質サンプルはタンパク質分解され、ペプチドは液体クロマトグラフ(LC)タンデムMSで分析され、その後定量化されます。

1. C. エレガンスのメンテナンスと文化

1. ワームコロニーを成長させ、標準的な実験室の手順⁸に従って第4の幼虫(L4)段階に同期させる。
2. IV-FPOP実験の日は、細菌の芝生からL4ワームを洗浄 (OP50大腸菌) M9バッファ (0.02 M KH₂PO_4,0.08 M Na₂HPO_4,0.08 M NaCl, 1 mM MgSO_4).
3. IV-FPOPサンプルあたり〜10,000のワームの500 μLのアリコートを得る。

2. マイクロ流体流動システムアセンブリ

1. 2 cmのフッ素エチレンプロピレン(FEP)チューブ(1/16インチ外径(o.d.)x 0.020 インチ内径(i.d.))を切断して、流動システムアセンブリを開始します。
2. きれいな解剖針を使用して、片端のみの小さなクレーターを作るためにFEP管のi.d.を広げ、長さは50mm〜50mmです。クレーターは、2つの360 μm o.d.の融合シリカ片に収まるのに十分な大きさでなければなりません。
   注: この端点は出口の毛細管に合うためにだけ使用されるので、反対側の端を広げないでください。
3. セラミックカッターで、250 μm i.d. の 15 cm の 2 つの部分を切断し、シリカを融合させます。これら2つの部分は、フローシステムの注入ラインになります。
4. 自己接着テープを使用して、2つの250 μm i.d.毛細血管をテープでつなぎ合わせて、互いに平行であり、その端部が100%フラッシュされていることを確認します。
   注:切断後に融合したシリカの端が破砕されないように、まっすぐで100%互いに洗い流されるようにするには、虫眼鏡またはステレオ顕微鏡を使用して調べることをお勧めします。
5. 2 つのテーピングされた毛細血管を FEP チューブの手作りのクレーターに挿入します。手作りのクレーターの端まで毛細血管を押し上げます。
   注意:フローシステムの有効性を維持するために、手作りのクレーターを通り過ぎないでください(図1a)。
6. きれいな表面にエポキシ樹脂の小さなドットを置き、解剖針と混合します。
7. 素早く、同じ針を使用して、FEPチューブと接続する注入毛細血管の端に少量の樹脂を置き、樹脂を乾燥させ、出口側を吊り下げ、数分間(図1a)。
8. 樹脂が乾燥している間、FEPチューブと2つの毛細血管を結合させ、新しい250 μm i.d.毛細血管を切断します。新しい毛細管は流れシステムの出口毛細管になる。毛細管の所望の長さは、以下の式を使用して計算することができます。
   
   ここでlはセンチメートルで切断される毛細管の長さ、tは分単位での所望の反応時間、fはmL/minの流量、すなわちセンチメートルの毛細管の内径である。
   注:出口毛細管を切断した後、端部を調べて、まっすぐで破砕していないことを確認します。
9. 樹脂が乾燥したら、新しいキャピラリーをFEPチューブ出口の端に差し込みます。出口毛細管の内側の端と2つの注入毛細管は、FEPチューブ内で互いにフラッシュする必要があり、これは混合Tを作成する(図1b)。
10. ステップ2.6および2.7に記載されているように、出口毛細管およびFEPチューブを新鮮なエポキシ樹脂と結合する。
11. 樹脂がフローシステムを一緒に一晩乾燥させます。翌日マイクロ流体流量システムをセットアップします(図1c)。

3. 生体内FPOP用マイクロ流体流動システム

1. 1つの5 mLシリンジの中に4つの磁気スターラーを挿入します。この注射器はサンプルシリンジになります。磁気スターラーは、IV-FPOP(図2A)中に、ワームが注射器の内側に落ち着くのを防ぎます。
2. 2本の5mLシリンジをM9で満たします。流量や混合効率に影響を与える可能性があるため、各シリンジ内に気泡がないことを確認してください。
3. Luer アダプタを各 5 mL シリンジに接続して、指がしっかりと固定されていることを確認します。
4. 各シリンジを1つの3-2バルブに取り付けます。シリンジは、バルブの中央ポートに取り付ける必要があります(図2B)。
5. 各5 mLのシリンジをデュアルシリンジポンプに固定し、プッシャーブロックからのシリンジへの過圧を防ぐために、メカニカルストップカラーを調整します。ストップカラーを設定する際には、磁気スターラーの追加を心に留めておいてください。
6. スーパーフランヘレスナット、FEPスリーブ、スーパーフランヘラミフェルールを使用して、自家製マイクロ流体流動システムの各注入毛細管端を各3-2バルブの上のポートに取り付けます(図2B)。
7. 3-2バルブ(ボトムポート)の残りの開いたポートに、スーパーフランジェルナット、FEPスリーブ、スーパーフランヘラミを使用して10cm 450 μm i.d.キャピラリーを取り付けます(図2B)。これらの毛細血管は、採取サンプル毛細血管になります。
8. ポンプフローを開始し、マイクロ流体フローシステムのすべての接続を確認して、視覚的な漏れがないか確認します。実験流量を用いて少なくとも3つのシリンジボリュームを流す。最終流量は、レーザー照射窓、レーザー周波数、ゼロ排除分量量に依存します。
   注:このプロトコルでは、2.55mm、250 μm i.d.融合シリカ、ゼロ排除分率、50Hz周波数のレーザー照射窓から375.52 μL/minの最終流量を計算しました。
   1. 流路は3-2バルブハンドルの矢印でマークされます。各シリンジは、バルブハンドルを排出位置から引き出し位置に移動することで、手動で補充することができます。
      注:3-2バルブの漏れを修正するには、スーパーフランヘレスナットを再ねじ込むか、バルブ接続(スーパーフランダースナット、FEPスリーブ、またはスーパーフランジェルスフェルール)を交換します。混合Tでのリークは、マイクロ流体流動システムの再組み立てが必要です(ステップ2.1〜2.11)。
9. マイクロ流体流動システムを実験ベンチに移動し、360 μm o.d. ステンレス鋼の組合を使用して、出口の毛細管を放射段階に固定します(図2C,D)。
10. 長い範囲のライターを使用して、レーザー照射窓に融合シリカのコーティングを燃やします。糸くずのない組織とメタノールを使用して、焼けたコーティングをきれいにしてください。
    注:過剰な熱が溶融したり、キャピラリーを壊すことができるので、キャピラリーを過熱しないように燃焼サイクルとメタノール洗浄サイクルを交互に行います。
11. 磁気スターラーを含む5 mLシリンジの上に磁気スターラーブロックを配置します。磁気スターラーブロックの速度と位置を調整して、5 mLシリンジ内の磁気スターラーがゆっくりと常に回転するようにします。

4. イン・ビボFPOP

1. KrFエキシマレーザーをオンにし、チラトロンをウォームアップします。
   注意:レーザーは目を傷つける可能性のある248 nmの波長で目に見える、目に見えない放射を放出する。レーザーをオンにしてビーム出口ウィンドウを開く前に、適切な目の保護を着用する必要があります。
2. 光センサをビーム出口ウィンドウに配置して、少なくとも100パルスの50Hzの周波数でレーザーエネルギーを測定します。
   注:このプロトコルでは、150 ± 2.32 mJのレーザーエネルギーで2.55mmの照射窓を使用しました。
3. 約10,000個のワーム(500μL)を入手し、サンプルをサンプルシリンジに手動で取り出します。
4. サンプルシリンジに2.5 mLのM9バッファを充填し、最終的なサンプル容量を3 mLにします。サンプルシリンジに気泡が入らないようにしてください。
5. 200 mM H₂O₂の 3 mL で 2 番目のシリンジを充填し、再び気泡がシリンジに導入されないようにします。
6. 出口毛細管の終わりに、 40 mM N'-ジメチルチオウラ(DMTU)の6 mLを含むアルミニウム箔で包まれた15mL円錐形チューブを置き、40 mM N-tert-ブチル-α-フェニルニトロン(PBN)、1%ジメチルスルホキシドを余分_H2O2、ヒドロキシルラジカル、およびメチオンスルポキシド還元を抑制します。₂
7. ソフトウェアウィンドウからエキシマレーザーを起動し、最初のパルスを待ち、デュアルシリンジからサンプルフローを開始します。
   注:サンプルは、3つの条件下で技術的な三重で生物学的複製で実行する必要があります_:H2O2(サンプル)によるレーザー照射_、H2O2によるレーザー照射なし、レーザー照射なし_H2O2(コントロール)、生物学的セットあたり9サンプルに合計。
8. サンプル全体を15 mLチューブに集め、サンプルシリンジからの背圧が時々蓄積する可能性があるため、視覚的な漏れがないかサンプルフローを積極的に監視します。
9. IV-FPOPに続いて、805 x gで2分間遠心分離することによりペレットワームを除去し、250μLの溶解緩衝液(8M尿素、0.5%SDS、50 mM HEPES、50 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EDTA、1 mMフェニルメチルスルホロンフッ化物[PMSF])を加える。サンプルをきれいなマイクロ遠心チューブに移し、フラッシュフリーズし、サンプル消化まで-80 °Cで保存します。

5. タンパク質の抽出、精製、タンパク質分解

1. 氷上の凍結サンプルを解凍し、10 sの超音波処理によって均質化し、続いて60 sの氷のインキュベーションを行う。超音波処理の複数のラウンドが必要とされ得、ホモジネートは、顕微鏡スライド上に2μLサンプルアリコートを置くことによって実体顕微鏡下で観察することができる。小さなワームが見られない場合、サンプルの均質化は完了します。
2. 遠心分離機は4°Cで5分間400 x gでホモゲン化されたワームを、きれいなマイクロ遠心分離管に上清を集める。
3. メーカーの指示書を使用して、バイチンチオン酸アッセイ(BCAアッセイ)を使用してサンプルタンパク質濃度を決定します。
   注:サンプル濃度は、任意の生化学的タンパク質濃度アッセイを使用して決定することができます。リシスバッファー(8 M尿素、0.5%SDS、50 mM HEPES、50 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM PMSF)との試薬の相溶性に留意してください。さらに、バッファー希釈が必要な場合があります。
4. 各サンプルから100μgのタンパク質を得て、きれいなマイクロ遠心チューブに入れる。
5. ジチオスレイトール(DTT)を10 mMの最終濃度に加え、すべてのサンプル中のジスルフィド結合を低減します。渦、スピンダウン、50°Cでサンプルを45分間インキュベートします。
6. 10分間室温までサンプルを冷却します。
7. 50 mM最終濃度にヨウオアセトアセトアミド(IAA)を加える。渦、スピンダウン、および光から保護された室温で20分間のサンプルをインキュベートします。
8. アルキル化の直後に、100%前冷やしたアセトンを4分の4量加えてタンパク質サンプルを沈殿させ、-20°Cで一晩インキュベートする。
9. 翌日、ペレットタンパク質は16,000 x gで10分間遠心分離して沈殿し、90%アセトンでサンプルペレットを洗浄し、上清を除去し、ペレットを2〜3分間乾燥させます。
10. タンパク質ペレットを25 mM Tris-HCl(1 μg/μL)に再び懸濁します。1:50(w/w)のタンパク質比に対する最終的なプロテアーゼでトリプシンを加え、一晩で37 °Cでサンプルを消化します。
11. 翌日、5%のギ酸を加えてトリプシン消化反応を消す。
    注:LC-MS/MS分析には、サンプルあたり最小0.5μgのペプチドが必要です(ステップ6.1~6.5)。定量的な着色ペプチドアッセイ(材料表参照)を使用してサンプルペプチド濃度を決定します(

6. 高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)

1. 0.1% FA (A) の水と 0.1% FA (B) の ACN の LC 移動相を使用します。
2. 0.5 μgのペプチドを C18 (5 μm, 100 Å) を含むトラップカラム (180 μm × 20 mm) に積み込み、サンプルを 99% の溶媒 A と 1% B で 15 μL/min の流量で 15 分間洗浄します。
3. C18逆相材料(5 μm、125 Å)を用いた社内パックカラム(0.075 mm i.d.×20 mm)を用いた別々のペプチド。
4. 次の分析分離方法を使用して、勾配を 300 nL/min で 120 分間に送り出しました: 0-1 分、3% B;2-90分、10-45%B;100-105分、100%B;106-120分、3%B
5. 高分解能質量分析計を用いて、ポジティブイオンモードナノエレクトロスプレーイオン化(nESI)でペプチドのデータ取得を行います。
   注:このプロトコルでは、高解像度の質量分析計に対する超高性能LC(UPLC)機器の組み合わしが利用されました。データ依存的な取得を利用した。MS1 の m/z スキャン範囲は、60,000 解像度で 3750 ~ 1500、動的除外 60 個でした。+1 および >6 の電荷状態のイオンは除外されました。5.5e5の自動ゲイン制御(AGC)ターゲットを使用し、最大射出時間は50 ms、強度しきい値は5.5e4でした。MS2用に選択されたイオンは、32%正規化された衝突エネルギーを用いて、より高エネルギーの衝突解離(HCD)断片化を行った。15,000分解能と5.0e4 AGCターゲットを用いて分光計でフラグメントイオンを検出した。

7. データ分析

1. C.エレガンスデータベースに対するボトムアッププロテオミクス分析ソフトウェアを使用してタンデムMSファイルを検索します。
2. タンパク質分析の検索パラメータを次のように設定します: 1 トリプシンは切断を逃した、375-1500 m/zペプチド質量範囲、0.02のフラグメント質量許容範囲、前駆体質量許容値は10 ppmです。カルバミドメチル化は、静的修飾として設定され、全てヒドロキシルラジカル側鎖修飾^{9,1010を動的}として知っている。ペプチド同定は、95%の信頼度(中)および残基で99%の信頼度(高)で確立される。誤検出率 (FDR) は 1% に設定されます。
3. 電子データベースにデータをエクスポートし、以下の式を使用してペプチドまたは残留物あたりの酸化の程度を要約します¹¹:
   
   注:EIC領域が酸化修飾を伴うペプチドまたは残基の抽出されたイオンクロマトグラフィー領域(EIC)であり、EIC領域は酸化修飾の有無にかかわらず同じペプチドまたは残基の総面積である。

IV-FPOPに使用されるマイクロ流体流動システムでは、H2O2とワームはレーザー照射の直前まで分離されています。 この分離は、内因性カタラーゼおよび他の細胞機構12によるH2O2の分解を排除する。2250 μm i.d. キャピラリーの使用は、2つの生物学的複製で63~89%の間の全サンプル回収を示し、150 μm i.d. 毛管は21~31%の回復しか示していません (図 3A)。より大きなi.d.毛細管(250 μm)を使用すると、IV-FPOPおよび単一ワームフロー(図3B)の間のワームフローが小さいi.d.キャピラリー(150 μm)と比較して、より良いワームフローにつながります(図3C)。150μm i.d. 毛管は単一のワームの流れを許さない(図3C)、そして1つのワームごとのレーザー露出の量を減らすレーザー照射窓で複数のワームが一緒に流れるのが見られる。

IV-FPOP は、C. エレガンスでの溶媒アクセシビリティをプローブする共有ラベル技術です。図4Aは、FPOP改変および未修飾ペプチドの代表的な抽出イオンクロマトグラム(EIC)を示す。ヒドロキシルラジカルラベルは酸化的に修飾されたペプチドの化学を変え、FPOP修飾ペプチドをより極性にする。逆相クロマトグラフィーでは、IV-FPOP修飾ペプチドは、未修飾ペプチドよりも早期に保持時間を有する。単離されたペプチドのMS/MS断片化により、酸化的に改変された残基の同定が可能になります(図4B)。

IV-FPOPは、C.エレガンス内の2つの生物学的複製にわたって合計545個のタンパク質を酸化的に改変することを示している(図5A,B)。タンパク質フットプリント法としてのIV-FPOPの利点は、ワーム内の様々な身体システムのタンパク質を修飾する技術の能力に依存している(図5C)。この方法は、ワーム内の身体組織または器官に関係なくタンパク質構造およびタンパク質相互作用を探査することを可能にするであろう。また、タンデムMS分析は、IV-FPOPプローブが生体内で溶媒の入手可能性を確認する。ヒートショックタンパク質90(Hsp90)の酸化パターンを、ミオシンシャペロンタンパク質UNC-45と複合体で解析した(図6)。Hsp90のMS/MS分析は、4つの酸化的に改変された残基(図6C,D)を示し、FPOP修飾(ln(PF)))5の正規化された範囲は、Hsp90の残基M698が残基R697、E699、およびE700に結合した場合の残留物(図6C)よりもアクセスが少ないことを示している。5酸化におけるこれらの違いは、文献溶媒アクセス可能表面積(SASA)計算(PDB 4I2Z13)によって検証される。残基M698は、SASA値が高い残基R697、E699、およびE700と比較した場合に埋め込み残渣であると考えられる0.03のSASA値を有する(図6C)。14

図 1.インビボFPOPマイクロ流体システムの概略図。(A)IV-FPOPフローシステムの2つの注入ライン(オレンジ)がFEPチューブ(黄色)の内側に示され、エポキシ樹脂の正しい結合位置は水色の円で表される。A(B)3つの250 μm i.d. 毛細血管によって形成された完全な組み立て混合-T。FEPチューブに対する出口毛細管の正しい樹脂結合位置は、水色の円で表される。(C) C. エレガンスの生体内共有ラベル付けのための完全な組み立てられた流れシステム。FPOP の前に、ワームは、標識の直前まで H2O2から分離された状態に保たれています。レーザー照射窓は水色で示され、レーザービームは紫色の稲妻で表されます。数字はスケールアウトではありません。この図は、Espinoら4から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.IV-FPOP中のマイクロ流体系。(A)5mLシリンジ内のC.エレガンスの代表的な写真。かき混ぜることなく、ワームは注射器の底に落ち着く(左)。磁気スターラーとスターラーブロックは、IV-FPOP実験中にワームを懸濁状態に保ちます(右)。(B)5mLシリンジの代表的な画像、毛細管を注入し、3-2バルブに接続された毛細管を引き出す。3-2バルブハンドルは、引き出し位置に示されています。(C)IV-FPOP中のマイクロ流体流動システムは、磁気攪拌機ブロックがワームの5 mLシリンジの上の位置にある。C(D)出口毛細管は放射段階に固定した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3.2つのi.d.毛細血管を用いたC.エレガンスの流れと回復の比較。(A) 250(グレー)および150(黒)μm i.d.毛細血管を有する2つの生物学的複製物(BR)に対するIV-FPOP後のワームの回収率。誤差範囲は、技術三次体全体の標準偏差から計算されます。250 μm(B)および 150 μm(C)i.d. 毛細血管を通ってレーザー照射窓を流れるC.エルガン。虫はより小さい毛細管でより堅く圧縮される。150 μm i.d. 毛細管は、ワームの凝集を示す。この図は、Espinoら4から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4.IV-FPOPに続く代表的なLC-MS/MSの結果。(A)FPOP修飾ペプチド(赤色)および未改変(青色)のEIC。A選択されたペプチドは、アクチン-1タンパク質に属する。(B)二重に荷電した非修飾アクチン-1ペプチドのMS/MSスペクトル 317-327.(C)二重に荷電したFPOP改変アクチン-1ペプチド317-327のMS/MSスペクトルは、この例ではP323が酸化的に改変された(y5++イオン、赤色)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 5.IV-FPOPは、C.エレガンス内のタンパク質を酸化的に変更します。(A)2つの生物学的複製(BR)に渡って50Hzで200mM過酸化水素の存在下で酸化的に改変されたタンパク質のベン図、BR1は青色、BR2は黄色である。(B) 静脈内の酸化修飾タンパク質の、照射されたサンプル、過酸化水素制御、および技術的トリクエート全体のBR2におけるワームのみの制御の図。(C) 異なるC. エレガンス体系内の酸化的に修飾されたタンパク質の円グラフ.この図は、Espinoら4から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 6.IV-FPOP の変更を溶媒のアクセシビリティに関連付ける。(A)ミオシンシャペロンタンパク質 UNC-45 (グレー) (PDB ID 4I2Z13) LC/MS/MS分析で同定された2つの改変ペプチドを強調し、669-680および698−706(緑、左インセット)。UNC-45は、Hsp90ペプチド断片(青色)に結合している。この断片内の酸化的に改変された残基は棒(赤)で示され、UNC-45は表面(右の差し込み)としてレンダリングされます。(B)タンデムMSスペクトルの UNC-45ペプチド 669-680 (上) および 698−706 (下側) は、CO2の損失に対するbイオンおよびyイオンを示し、FPOP修飾を行った。(C) Hsp90酸化的に変質残基の計算ln(PF)、R697、M698、E699、およびE700。Hsp90の計算されたSASA値は、各残基の上に示される。(D) +16 FPOP 修正を示す R697、M698、E699、および E700 用タンデム MS スペクトル。この図は、Espinoら4から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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