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方法論記事

ヒト粘膜リンパ組織におけるEx Vivo自然免疫応答を研究する扁桃単核細胞の単核細胞の単離

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DOI：

10.3791/60914

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2020年6月14日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Virology, Ulm University Medical Center, 2CNRS UMR-8601, Centre Interdisciplinaire Chimie Biologie, 3Team Chemistry & Biology, Modeling & Immunology for Therapy, Université Paris Descartes, 4Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, 5Pediatric Otolaryngology Department, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Université de Paris, Institut Cochin

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、部分的な外科的扁桃摘出術を受けた健康なヒトから扁桃体単核細胞を容易に処理および培養し、活性化時に自然免疫応答を研究し、粘膜組織におけるウイルス感染を模倣する方法を説明する。

要約

粘膜関連リンパ組織(MALT)から単離された細胞を研究することは、組織における宿主病原体相互作用をモデル化することができるため、粘膜免疫を含む病理における免疫細胞応答の理解を可能にする。組織由来の単離細胞は最初の細胞培養モデルであったが、組織を得るのが難しいため、その使用は無視されてきた。本プロトコルでは、健康なヒト扁桃腺から扁桃体単核細胞(TMC)を容易に処理し培養し、活性化時に自然免疫応答を研究し、粘膜組織におけるウイルス感染を模倣する方法を説明する。扁桃腺は上皮をほとんど持たず、すべての主要な免疫細胞タイプの数十億まで生じるので、扁桃腺からのTMCの分離は速いです。この方法は、血液からの末梢単核細胞(PBMCs)の使用と同様に、免疫測定、qPCR、顕微鏡、フローサイトメトリーなどを含む複数の技術を用いてサイトカイン産生を検出することを可能にする。さらに、TMCは、将来の毒性アッセイのために考慮する必要があるPBMCよりも薬物検査に対する感度が高いことを示しています。したがって、ex vivo TMC培養は、簡単でアクセス可能な粘膜モデルです。

概要

人間の臓器に関する研究は、アクセシビリティだけでなく、明らかな倫理的理由のために制限されています。しかし、人間の生物学の複雑さを十分に理解するためには不可欠です。単離された細胞(一次培養または細胞株)の培養は、その利用可能性による細胞生物学研究における標準的なシステムである。単離された細胞培養は顕著な発見を可能にしたが、細胞株の使用は生体内器官生物学を完全に模倣していないため、より精査されている。しかしながら、三次元細胞または組織外植物の培養は、4、5、65,と非常に複雑である。実際、組織または器官の一部は、その細胞組成が組織の局在に応じて異なるため、非常に異種である。したがって、組織ブロックを使用するには、多くの技術的および生物学的複製の分析が必要であり、多数のドナーまたは患者の必要性につながります。

粘膜関連リンパ組織(MALT)は、構造的にはリンパ節に類似しているが、独特の機能を有するが、その主な役割は粘膜免疫を調節することであるため7。通常、組織からある程度の距離に位置するリンパ節とは異なり、MALTは一般的に粘膜組織の上皮のすぐ下に位置する。組織学的には、それらは主に高濃度のB細胞とT細胞で構成されているが、マクロファージや樹状細胞などの抗原提示細胞も含まれる。MALTは人体におけるリンパ組織の約50%を構成する。MALTは、GALT(腸-)、BALT(気管支-)、ナルト(鼻)、CALT(結膜)、LALT(喉頭-)、SALT(皮膚-)、VALT(vulvo-)、O-MALT(組織化)、D-MALT(拡散)の9つのグループに細分化される。O-MALTは、主にワルダイヤーの扁桃環の扁桃腺で構成され、最もアクセスしやすいMALT88、99です。実際、中咽頭に位置する扁桃腺は、(潜在的)侵襲性微生物10から消化管および気道を保護する主要な障壁を構成する。また、扁桃腺は、細かい層状扁平上皮非角化上皮で覆われ、血管、神経、およびリンパ管を含む結合組織のカプセルによって支持され、免疫細胞11、12,12への容易なアクセスを提供する。さらに、扁桃摘出術は、扁桃腺を除去する外科的行為であり、睡眠障害呼吸を有する小児に対して行われる一般的な処置であり、扁桃腺を生理学的な設定で容易に利用できる組織13にする。

扁桃腺は、粘膜免疫を伴う病理における免疫細胞応答の研究を可能にする。実際、HIV感染では、扁桃腺は高濃度の免疫細胞で構成されているため、それらはウイルス複製の主な標的であるが、また、循環14,15,15において検出されない大量のサイトカインを産生する。安定した状態では、先天性細胞のまれな集団は扁桃腺を含む様々な粘膜組織に存在するが、本質的に血液から存在しない。

したがって、扁桃腺(TMC)の単核細胞は、PBMCよりも関連性が高く複雑なモデルであり、より深い質問に答えることができます。一方、組織外植の使用は複雑であり、常に自然免疫研究に関連するとは限りません。そこで、TMCs16を用いて粘膜免疫活性化を研究する16モデルを確立した。ここでは、新鮮なヒト扁桃腺からTMCを効率的に分離する方法について述べています。この方法は、ex vivo研究のために完全性を保ちながら、多数の免疫細胞の回復を可能にする。

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プロトコル

標本は研究目的のために特別に収集されておらず、研究は侵襲的とは見なされません。しかし、ヒト扁桃腺の収集には、地方自治体の倫理的承認が必要です。私たちの場合、それはコンティテ・ド・プロテクション・デ・ペルヌ(IDRCB /EUDRACT:2018A0135847)によって承認されました。さらに、各患者または法定代理人の同意は、実験結果を解釈するのに役立つドナーの個人データ(例えば、性別、年齢、ENT感染の歴史)を得ることを要求される。

1. ヒト扁桃組織の取り扱い

  1. 25 mL PBS 1x を含む 1 つの無菌 50 mL バイアルにすべてのドナーの扁桃腺を入れて、当局の勧告に従って実験室に室温 (RT) で輸送します (バイアル、セーフティ ボックス、およびバッグの 3 つのレベルの保護を使用します)。
    注:全体の手順は、生物学的安全性レベル2の実験室で行われるべきです。すべてのヒト標本は、以前に資格を取得しておらず、感染性物質が含まれている可能性があるため、注意して取り扱う必要があります。
  2. 各使用の間にすべてのツールをクリーニングします。
    1. 使用後、細胞ストレーナーを分解し、一晩洗剤溶液(H2Oの1/10容積洗剤)を含む浴槽に他のすべての器具(例えば、害虫、鉗子)と一緒に保管してください。
    2. 各器具を磨いて組織を取り除き、透明な水で洗います。
    3. すべての部品をよく乾かしてから、10メッシュのスチールグリッドの上に60メッシュのスチールグリッドを配置し、リングをしっかりと閉じて、セルストレーナー(85 mL、37 mm直径)を準備します。
    4. すべてのツールを無菌バッグとオートクレーブに入れなさい。

2. 扁桃体単核細胞(TMC)のヒト扁桃組織の解剖と分離

  1. 細胞ストレーナーを150 x 25mm 2(SPL150)細胞培養皿に置き、すべての器具を別のSPL150に入れて無菌状態に保ちます。2
  2. 滅菌鉗子を使用して、バイアルから細胞ストレーナーに扁桃腺を移す。また、扁桃腺を出したいくつかの細胞を含むPBSのすべてを注ぎます。必要に応じて、さらにPBSを追加してグリッドを浸します。
    注:乾燥を避けるために、組織は常に浸漬する必要があります。
  3. 鉗子およびメスを使用して、焼灼、血まみれ、筋腫組織を除去する。
    注:子供から取り除かれた扁桃腺は、このステップを必要としません。
  4. メスと湾曲したピンセットを使用して、直径0.5cm未満の小片に組織を切断します。小片を常に浸すことができるように、すべての組織をカットします。
  5. 細胞ストレーナーに数個の組織を入れ、白いストロマの本当に薄い層だけが残るまでガラスの害虫でグリッドに削ります。グリッドを詰まらせないように、ストロマを取り除いて捨てます。
  6. すべての組織がグリッドを通して圧迫されたら、10 mLピペットを使用してすべての細胞懸濁液をグリッドに移し、最後に1回削ります。
  7. 10 mL ピペットで細胞懸濁液を滅菌バイアルに移します。グリッドと細胞ストレーナーをPBS 1xで洗います。セルサスペンションをベンチのRTで5分間休ませます。このステップは、残りのストロマ、死細胞、および放出されたDNAの沈殿および凝集を可能にし、次のステップを容易にする。
  8. 新しい50 mLバイアルの上に無菌70 μmのふるいを置き(封筒から慎重に取り出す)、10 mLピペットで細胞懸濁液をそっと移します。ペレットが頻繁に存在するので、懸濁液を混合しないでください。ふるいが詰まっている場合は、滅菌1 mLピペットチップの背面を使用して、細胞トラフシーブを傷つけます。必要に応じてふるいを頻繁に変更します。
  9. 4°Cで10分間250xgで細胞を遠心分離する。 g
  10. 上清を捨て、バイアルを軽く混合してペレットを再懸濁し、35mLのPBSで細胞を再懸濁する。
  11. 新しいバイアルで、新しい70 μmのふるいを上に置き、10 mLピペットでセルサスペンションを移します。ふるいが詰まっている場合は、ステップ 2.7 で説明した手法を使用します。

3. 細胞密度勾配によるTMCsの分離

注:TMC は、ステップ 2.10 以降で使用できます。しかし、より明確な細胞溶液を得るために、そして他の細胞の破片および任意の赤い細胞を除去するために、単核細胞の細胞密度勾配分離を行うことを勧める。

  1. 密度勾配媒体(d = 1.076 g/mL)を新しい50 mLバイアルに加えます。TMCs溶液を密度勾配媒体の上に注ぎ、密度勾配媒体との懸濁液の混合を最小限に抑えるように注意する。
  2. 加速とのRTで30分間、1,000 x gで溶液を遠心分離し、中断します。
  3. 10 mL ピペットで取り出し、TMC と密度勾配媒体の間の界面を乱さずに上層(主にPBS 1xを含む)を捨てます。
    注:TMCは赤血球の数が少ないので、溶液は明らかである。従って、PBS中のTMCの溶液と密度勾配媒体との間の界面を視覚化することは困難であり得る。したがって、細胞は、密度勾配が行われる前に20 mM HEPES(FBSなし)を補充したRPMI 1640で再懸濁することができる。
  4. 滅菌1 mLピペットチップでTMCを取り外し、新しい50 mLバイアルに入れ。
  5. 2%の牛血清(FBS)と2mM EDTAを含むPBSの50mLを加えて、4°Cで10分間250xgのgチューブを遠心分離して、残りの血小板を除去します。
  6. ステップ3.5を繰り返しますが、4°Cで10分間g400xgでチューブを遠心します。
  7. 培養培地(R10)を10%熱不活化FBS、2mM L-グルタミン、抗生物質溶液(100 U/mLペニシリウムおよび100μg/mLストレプトマイシン)で補って調製します。
  8. TMCをR10の10 mLに再び懸濁し、細胞を数えます。平均して、この技術は扁桃腺の対につき5 x 108-2 x 109 TMCを生み出す。細胞は、全血からのPBMCのような調査(例えば、特定の細胞型の精製、細胞培養、フローサイトメトリー、RT-qPCR、凍結など)に使用できるようになりました。
  9. 必要に応じて、一次細胞凍結のための標準的な技術を使用して、さらに使用するために細胞を凍結します。
    1. セルの数をカウントします。
    2. 細胞を遠心分離し、上清を取り除きます。ペレットを100%FBSに溶かし、最終的な濃度が1 x 108セル/mLで、同じ体積の80%FBS + 20%DMSO溶液を加えます。その後、細胞は5 x 107細胞/mLになります。このステップは4°Cで行う必要があり、FBSおよびDMSO溶液は、使用する前に4°Cに保たれるべきです。
    3. 1 mLの細胞溶液を凍結チューブに分配し、一晩4°Cであったゆっくりとした凍結容器に入れて細胞凍結の速度を制御します。-80°Cに置きます。
    4. 細胞を解凍するには、凍結を37°Cの暖かい浴槽に一定の攪拌で数秒間置きます。細胞が解凍し始めるとすぐに、それらを49 mLのR10と遠心分離機に移してDMSOを取り除きます。セルをカウントし、PBMC として使用します。
      注:TMCの凍結と解凍は破片を取り除きますが、希少な細胞タイプにも損傷を与えます。解凍後に塊や破片が存在する場合は、使用する前に無菌70 μmのふるいを通して細胞懸濁液を通過するのが最善です。

4. フローサイトメトリーによるTMCsのフェノタイピング

  1. テストが必要な各抗体混合物パネルの前の溶液から5 x 106細胞を取り出し、5 mLのサイトメトリーチューブに入れます。1 x 106のセルを取得して、未染色のコントロールを取得します。
  2. 4°Cで5分間400xgでPBSと遠g心分離機で細胞を洗浄します。500 μLのPBS(1 x 106細胞/mL)で再懸濁し、暗闇の中で4°Cで30分間生存性の染色でインキュベートします。
  3. 細胞懸濁液100μLあたり5μLの熱不活性化ヒトAB血清を加え、暗闇の中で4°Cで15分間インキュベートします。
  4. 4°Cで5分間、PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (洗浄バッファー) と遠心分離機 400 x gで細胞を洗浄します。
  5. 抗体を含む洗浄バッファーの 500 μL で TMC を再中断します(表 1に記載)。暗い中で4°Cで30分間細胞をインキュベートする。
  6. 4°Cで5分間、400 x gで洗浄バッファーと遠心分離機で細胞を洗浄します。パラホルムアルデヒド(PFA)の0.5%を含むPBSの500 μLでTMCsを再中断します。フローサイトメトリーで取得するまで、4°Cで暗闇の中に保管してください。
    注:PFA は危険です。0.5% PFA ソリューションを準備するには、市販の既製のソリューションを使用します。
抗体クローンフルオロクロム会社
ライブ・デッドBV405サーモフィッシャー科学
CD3SP34-2V500BD ファーミングゲン
CD8SK1アムシアンBD ファーミングゲン
CD8BW135/80ヴィオブルーミルテンイバイオテック
CD4RPA-T4PE-Cy7BD ファーミングゲン
CD45HI30パーCP-cy5.5Bd
CD19HD237Ecdベックマン・コールター
CD202H7アレクサ・フルーオール 700BD ファーミングゲン
CD14M5E2PE-cy7BD ファーミングゲン
CD14M5E2ApcBD ファーミングゲン
CD163G8APC-H7BD ファーミングゲン
CD56メム188PeBD ファーミングゲン
CD1237G3PeBD ファーミングゲン
BDCA-1L161パシフィックブルーBD ファーミングゲン
BDCA-3AD5-14H12Fitcミルテンイバイオテック
BDCA-4AD5-17F6Apcミルテンイバイオテック
HLA-DRG646-6パーCP-cy5.5BD ファーミングゲン
CD11c3.9アレクサ・フルーオール 700エバイオサイエンス

表1:フローサイトメトリーによる細胞特性評価のための抗体のリスト。

5. TMCの活性化とサイトカインの測定例

  1. TMCをR10培地で希釈し、2 x 106細胞/mLの濃度を得る。
  2. R10の200 μLの400,000 TMCを96ウェルの丸い底板に分配する。
  3. 細胞を活性化するには、TLR7/8アゴニストレジキモド(R848)を一晩で5μg/mL加えます。
  4. プレートを遠心分離し、TMCの上澄み地を取り出し、さらに分析するために凍結します。サイトカインの生産は、ビーズベースの免疫アッセイを用いて、製造業者のプロトコルに従ってフローサイトメーターを使用して同時に複数の可溶性サイトカインを定量化する。
  5. メーカーのプロトコルに従って発光細胞生存アッセイを使用して細胞の生存率を評価します。簡単に言えば、ウェルに60 μLの細胞生存率溶液を加え、10分以内に発光を測定します(1 s/wellの取得)。

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結果

まず、培養中に存在する細胞の免疫プロファイルを特徴付け、TMCの量を分析した。扁桃腺からTMCをフローサイトメトリーでフェノタイプしました。図1に示すように、血液からPBMCに存在する主要な免疫細胞型はすべて扁桃腺由来のTMCで表した。しかし、TMCではB細胞を除くすべての細胞タイプの頻度は、PBMCよりも低かった。

figure-results-1
図1:扁桃腺におけるTMCのフェノタイピング健常ドナーからTMCが得られたヒト扁桃組織の解剖および細胞の単離。(A)細胞を染色し、フローサイトメトリーによってデータを取得した。データは代表的な実験を表す。(B)表は...

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ディスカッション

ヒト扁桃腺は、二次リンパ器官の役割を模倣するため、粘膜界面で自然免疫応答を研究するための統合的かつ生理的なex vivoモデルを表す。興味深いことに、TMCの細胞組成はPBMCに似ており、主要な細胞集団をすべて含んでいるが、その割合は血液からのPBMCとは異なる場合がある(図1)。すべての免疫応答は組織(粘膜または二次リンパ器官)で開始され、血液中ではなく、追加の集団も見つけることができます。

ヒト組織外植物の使用だけでなく、細胞培養または血液細胞の使用は、それぞれそれらの利点を有する。しかし、サイトカインの分泌および細胞活性化の研究のために、組織外植物は最良のモデルではなかった。実際、組織外植の上清におけるIFN産生を検出できなかった(図2B)。我々は、それが周囲の細胞によって直接消費されることを推測する。一方、血液細胞(PBMC)の刺激は、感染に対する主要な反応を模倣することができますが、サイトカインのほとんどが産生され、ウイ...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作品は、アジェンス・ナショナル・ド・ラ・レシェルシュ・シュル・ル・シダ・エ・レ・ヘパティテスANRS(J-P.H)実験およびN.B.フェローシップ(AAP 2017 166)。N.S.は、ANRSによるフェローシップ(AAP 2016 1)、欧州分子生物学機構EMBOフェローシップ(LT 834 2017)、ウルム大学医学部のスタートアップ資金調達プログラム「バウシュタイン」(LSBN.0147)、ドイツフォルシュングスゲマイナンシャフトDFG(SM 544/1)からの支援を認めています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10メッシュスチールグリッド - 1910 & マイクロ;mDutscher198586セルストレーナーCellector
60メッシュスチールグリッドに入れるには - 230 & マイクロ;mDutscher198591セルストレーナーCellector
70 µに入れるには;m white ClearLine セルストレーナーDutscher141379C
Anios Excell D 洗剤Dutscher59852洗剤
抗生物質溶液、100xサーモフィッシャー15140122100 U/mL ペニシリウムと 100 μg/mL ストレプトマイシン - 培地に加える
BD FalconTM 丸底チューブ、5 mLBD Biosciences352063FACS チューブ
セルストレーナー Cellector、直径 85 mL および 37 mmDutscher198585
CellTiter-Glo (CTG) 発光細胞生存率アッセイPromegaG7572生存率アッセイ
遠心分離機 5810 Rエッペンドルフ
円錐管 ファルコン 50 mLダッチャー352070
湾曲ピンセットダッチャー711200
ジメチルスルホキシド (DMSO)シグマ・アルドリッチD2650
ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水 (PBS)シグマ・アルドリッチD8537カルシウムとマグネシウムなし
エンビジョン・パーキンエルマールミネセンスを測定
ウシ胎児血清(FBS)培地に加えるには
蛍光標識抗体表1
ガラス乳棒ダッチャー198599
Hepes(1 M)サーモフィッシャー1563005620 mM
インキュベーター
LEGENDplex Human Anti-Virus Response PanelBioLegend740390ビーズベースの免疫測定
LymphoprepStemCell7801密度勾配培地
Mr. Frosty 容器Thermo Fisher5100-0001緩慢凍結容器
Pierce 16% Formaldehyde (w/v)、メタノールフリーThermo Fisher28908
Resiquimod (R848)InvivoGentlrl-r848TLR7/8 アゴニスト
RPMI-1640 MediumSigma-AldrichR8758
SPL Cell Culture Dish, 150 mm x 25 mm (SPL150)Dutscher330009
Surgical blade sterile N°23Dutscher132523
UltraComp eBeads Compensation BeadsThermo Fisher01-2222-41
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher15575020PBSの洗浄バッファーを作るには
を参照してくださいで使用 法

参考文献

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ヒト粘膜リンパ組織におけるEx Vivo自然免疫応答を研究する扁桃単核細胞の単核細胞の単離
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