方法論記事

ポータブルqPCRシステムを用いた マトリカリアシャモミラ のフィールド同定

DOI：

10.3791/60940

⸱

2020年10月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Herbalife NatSource (Hunan) Natural Products Co., Ltd., 2Corporate Quality Laboratory, Herbalife International of America, Inc., 3Corporate Quality, Herbalife International of America, Inc., 4Hyris Ltd, 5Natural Health Product Research Alliance, University of Guelph

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで提示されるのが、ポータブルqPCRシステムを用いた マトリカリア・シャモミラ のフィールド識別プロトコルです。この実行が容易なプロトコルは、農場や倉庫などの実験室設備や専門知識へのアクセスが制限されている場所で植物種の身元を確認する方法として理想的です。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

植物製品の品質管理は原料供給から始まります。従来、植物同定は形態学的評価と化学分析法によって行われる。しかし、特に近年の植物学者の入手可能性の欠如は、消費者の需要の増加と気候変動によってもたらされるサプライチェーンのストレスに対処するために品質管理を強化する必要性と相まって、代替アプローチを必要とします。このプロトコルの目的は、実験室の機器や専門知識へのアクセスが制限されているフィールドまたは任意の設定でポータブルqPCRシステムを使用して植物種の同定を容易にすることです。標的DNAは色素ベースのqPCRを用いて増幅され、植物の参照材料から抽出されたDNAが陽性対照となる。標的DNAは、その特異的な増幅によって同定され、その融解ピークを正の対照に一致させる。実践的なフィールドサンプル収集からDNA抽出、PCR増幅、データ解釈まで、ステップとパラメータの詳細な説明が含まれており、読者がこのプロトコルを確実に複製できるようにしています。結果は、従来の実験室の植物同定方法と一致して生成された。このプロトコルは、実行が容易でコスト効率が高く、サプライチェーンの原点に近い原材料の品質テストを可能にします。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

健康を維持し改善するために植物を使用する習慣は、数千年にさかのぼります。消費者需要の増加によってもたらされるサプライチェーンのストレス1,持続不可能な収穫慣行と気候変動2,植物の姦淫は、食品および栄養補助食品業界での懸念が高まりつつあります3.宣言されていない植物種や誤認された植物種の存在は、有効性の低下、あるいは安全性の問題につながる可能性があります。例えば、ブラックコホシュ(Actaea racemosa)は、月経前の不快感を治療するために使用され、その有効性4に対する限定的な臨床データサポートを有する低価格のアジア種に置換され得る。より深刻なケースでは、中国のハーブを用いた減量の臨床研究におけるステファニー・テランドラのアリストロキア・ファンチの置換は、一部の参加者5,66において重度の腎毒性および腎不5全につながった。2つの異なる種は、中国の共通名「ファンジ」を共有しました。これらのケースは、原材料の同定から始まるより厳格な品質管理の必要性を強調しています7(できればサプライチェーンの起点に近い場所にできるだけ近い方が好ましいため, 資源を正しいアイデンティティの材料に効率的に割り当てることができる。

多くの直交アプローチを植物の同定に使用できます。従来、植物同定は形態学的評価8、9および9化学分析8法10、11、12、13,11,12,13を介して行われる。形態学的同定は、植物材料の巨視的特徴と微視的特徴の違いがある場合の違いに基づいている(図1)。しかし、近年の古典的な植物学に関するトレーニングプログラムの欠如は、専門家の不足をもたらしました 14,このアプローチは、日常的な品質管理のために実用的ではありません.粉末植物材料でのその用途も限られています。化学分析法は、薬理工学や研究所で広く使用されていますが、高性能薄層クロマトグラフィー(HPTLC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、核磁気共鳴分光法(図2)、環境要件などの機器のサイズにより、フィールドテストには適していません。近年、ゲノム法は植物種の認証と置換検出の代替技術として登場し、効率的かつ正確であることが証明されています。ゲノム法,は、植物材料15、16、17、18、19,16における遺伝情報の高い忠実度と特異性18を19利用する。,17分子診断ツールは、ポータブルデバイスの形で利用可能であり、多くの場合、技術の使用障壁を下げる自動化されたデータ解釈ツールが含まれている、このアプローチは、フィールド識別20、21、22、23、24に最適です。20,21,22,23,24分子解析方法を設計し、検証した後 25,,26,,27,それは基本的な分子生物学の訓練を受けた任意の人員によって行うことができます。利用可能なさまざまなポータブルツールの中で、DNA配列上のリアルタイムPCRは、費用対効果の高い選択肢の1つです28.ポータブルデバイスの組み合わせは、カスタマイズされ、検証された分子分析と共に、農場や植物材料倉庫などの実験室外の植物種や成分の検証を可能にし、従来の方法に関連する時間とコストを削減します。

このプロトコルの目的は、ポータブルqPCRシステムを使用して、実験室の機器や専門知識へのアクセスが制限されているか利用できない状況で植物の同定のための方法を導入することです。この方法は、マトリカリア・シャモミラ(図3A)の分野で実証され、一般的にはドイツのカモミールとして知られており、その抗炎症および抗酸化特性29に広く使用されている。それは、特に属チャマエメラム、タナセタム、および菊30、31、32,31,32から、類似した外観や臭気の関連種と混同することができます。関連種の中で、ローマのカモミールとしても知られるチャマエムム・ノビレは、商業における同等の生産レベルを有する顕著なものです(図3B)。実証された方法は、標的植物種M.シャモミラを同定するだけでなく、DNA配列の特異的増幅に基づいてその近親的なC.nobileを検出するように設計された。

この記事では、インターカレート色素ベースのqPCRとメルトカーブ解析をポータブルデバイス上で使用して 、M.chamomilla のフィールドボタニカル同定を実行する方法を詳細に説明します。このプロトコルには、現場からの植物サンプルの収集、現場でのDNA抽出、リアルタイムPCR反応のセットアップが含まれます。有効な結論を確実にするために、標的植物 M.シャモミラ および非標的植物性 C.ノビレ ゲノムDNAは、認定された植物基準材料から事前に抽出され、陽性対照として使用される。この方法の特異性は 、M.シャモミラ と C.ノビレ の両方の同定試験をサンプルおよびコントロールで個別に行うことによって実証される。非テンプレート陰性制御はPCR汚染によって引き起こされる偽陽性の結果を除外するために使用される。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. サンプルコレクション

  1. 平らで水平な面を持つフィールドにテストエリアを設定します。
  2. カモミール花畑の植物の大部分の特徴を反映した代表的な植物を特定する(図4)。
  3. 滅菌手袋を使用して代表的な植物から花の頭を選びます。
  4. サンプルを2.0 mLのコレクションチューブに入れる。
  5. ステップ 1.3 ~ 1.4 を繰り返し、同じプラントからリーフレット (長さ約 0.5 ~ 0.7 cm) を収集します。
    注 :M.シャモミラ の花と葉は、2.0 mLコレクションチューブの底に座るのに十分な小ささです。表面積が大きい他の植物の場合、ペーパーパンチまたはハサミ(使用前に70%エタノールですすい)を使用して、試験のために組織サンプルを分離することができます。複数のサンプリングが必要な場合は、異なるサンプルの取り扱いの間にペーパーパンチまたははさみをすすきます。

2. DNA抽出

  1. 乾式バスインキュベーターを95°Cに予熱します。
  2. 各採取チューブに、植物DNA抽出キットから抽出液の100 μLを加 える(材料表に記載)。DNA抽出効率を向上させるには、組織のペスルを用いて抽出液中の組織試料を粉砕する。
  3. チューブを閉じます。植物組織が抽出プロセス全体を通して抽出液で覆われていることを確認します。
  4. コレクションチューブを予熱乾燥式バスインキュベーターに入れ、95°Cのコレクションチューブを10分間インキュベートします。
  5. 10分後、乾燥したバスインキュベーターからチューブを取り出します。
  6. 同じDNA抽出キットから100μLの希釈液を加え、上下にピペットを数回加えることで溶液を混合します。
  7. リーフレット抽出についても同じ手順を繰り返します。
  8. さらに溶液を混ぜるために振ります。植物組織は通常、この治療後に分解されているようには見えない。液体の色が変わり、曇りになる可能性があります。
    注:希釈溶液は、すぐに進まない場合は、一晩室温で保存することができます。貯蔵前に植物組織から細胞の破片を取り除く必要はない。チューブ内の液体は、下流のPCR増幅のためのDNAテンプレートを保持しています。

3. PCR反応のセットアップ

  1. qPCR機器のサーモサイクリング条件をメーカーの仕様に従って設定します。に示した PCR サーモサイクリング プロファイル (表 1)を適用し、最初の変性のための一定温度ステップから始まり、25 サイクルの増幅が続き、温度ランプで終わり、高解像融解曲線を得ます。
  2. 使用前に室温でqPCRマスターミックスとプライマー(表2)を解凍します。
  3. 各ウェルにロードされる反応を計画する:標的種との陽性対照を含む井戸、非標的種による陽性対照、サンプル、および陰性対照(図5)。
    1. この例では、ドイツのカモミール識別試験には5つの井戸が使用され、残りの5つのウェルはローマのカモミール識別試験に使用されます。各種同定試験の種類ごとに、1つの井戸は、対象種の参照材料から抽出されたDNAで陽性対照を含み、1つは非標的種の参照材料から抽出されたDNAで陽性の対照を含み、2つの井戸はフィールドから抽出された花と葉のDNAサンプルで満たされ、1つの井戸は否定的な対照のために割り当てられます。 表 3 に、各ウェルタイプについて説明します。
  4. 各植物種同定試験のマニュアルに従って反応マスターミックスを準備します。典型的な反応マスターミックスは、普遍的なqPCRマスターミックス(2x)、前方および逆種特異的プライマー、およびヌクレアーゼフリー水が含まれています。 表4 に反応系の組成を示す。
    注:すぐに使用しない場合は、qPCR反応マスターミックスを+2°C~+8°Cのクーラーまたはミニ冷蔵庫に保管してください。
  5. 使用前にピペッティングして反応マスターミックスを十分に混ぜます。
  6. qPCRカートリッジを面を上にして平らで安定した面に置きます。
  7. ステップ3.4で構成された反応マスターミックスの18 μLを、ステップ3.3で定義されたウェルに従ってカートリッジウェルにロードします。このデモでは、ドイツのカモミール同定試験反応マスターミックスをGCテスト用にラベル付けされたウェル(井戸1、3、5、7、9のGCT)に追加し、ローマカモミール同定試験反応マスターミックスをRCテスト用にラベル付けされたウェル(ウェル2、4、6、8、10)に追加します( 図5を参照)。
  8. DNA抽出チューブの上清から2μLのサンプルDNAを、あらかじめ抽出したDNA陽性制御から、qPCRマスターミックスをプリロードしたカートリッジウェルに移します。各DNAテンプレートをqPCRマスターミックスに加えた後、ピペット処理で溶液を軽く混ぜます。
    注:DNA抽出チューブからDNAを転送する際は、細胞の破片を浮遊しないでください。必要に応じて、上清と細胞の破片を分離するために小型遠心分離剤を使用してください。
  9. カートリッジを粘着フィルムで丁寧に密封します。カートリッジをサーモサイクリング室に積み込み、閉じます。
  10. 実行する qPCR インストゥルメントを設定します。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

セクション1に記載されたプロトコルに従い、花頭および葉から植物DNAを、95°Cでの回収管の熱インキュベーション後に上清に10分間抽出した。現在の研究では、上清は花と葉の両方に黄色と緑がかった色を示し、植物DNAを用いて様々な天然化合物が上清に放出されたことを示す(図6)。確かなPCR増幅は、後に、全てのフィールド抽出DNA鋳型に対して三重化で達成されたが、DNA品質評価は参照として実験室で行った。蛍光測定によって決定される花頭DNA抽出物の濃度は3.69〜5.36 ng/μL、葉DNA抽出物の濃度は6.42〜9.29 ng/μLの範囲でした。A260/A280及びA260/A230の花および葉のDNA抽出物の吸光度比を分光光度法により測定した。しかし、DNAと植物化学UV吸収スペクトルとの重複のために、これらの比率は信頼性を測定することができなかった(データは示していない)。

インターカレル蛍光色素を用い、標的断片の増幅をリアルタイムでモニタリングした。特定のプライマー M.シャモミラとC.ノビレの両方が、植物ゲノムに数十〜数百部のコピーを有する内部転写スペーサ2(ITS2)領域を標的とするため、25のPCR増幅サイクルはカモミール種の同定に十分なアンプリコンを生成するのに十分である。図7において、M.シャモミラ同定試験におけるM.シャモミラ陽性対照のCt値は25(GCP_GCT)未満であったが、一方、25回の増幅サイクル後、同一対照の蛍光は検出閾値(GCP_RCT)を下回った。一方、25サイクル後、M.チャモミラ同定試験におけるC.ノビレ陽性対照の蛍光は検出閾値(RCP_GCT)を下回り、C.ノビレ同定試験における同一対照のCt値は25(RCP_RCT)未満であった。それぞれのアッセイにおける標的および非標的陽性制御の増幅は、M.シャモミラ同定アッセイの特異性を示す。サンプルDNAの場合、フィールドフラワーヘッドと葉のDNA抽出物は、それぞれM.シャモミラ同定試験で15.18および19.41のCt値を得た(Sample1(FLOWER)_GCTおよびSample2(LEAF)_GCT)。これらのサンプルはいずれもC.ノビレ同定試験(サンプル1(FLOWER)_RCTおよびサンプル2(リーフ)_RCT)では増幅されなかった。両サンプルの増幅パターンは、M.シャモミラ陽性対照の増幅パターンと一致した。陰性コントロールは、PCR汚染によって引き起こされる偽陽性の可能性を除いて、M.シャモミラおよびC.ノビレ同定試験(NC_GCTおよびNC_RCT)の両方で増幅されなかった。陽性制御およびサンプルにおける特異的増幅をさらに確認するために、各ウェルからのPCR末産物の画分を、実験室で2%アガロースゲル上で実行した(図8)。M.シャモミラ同定試験では、両方のフィールドサンプルがM.chamomilla陽性対照と同じ位置で実行されるアンプリコンを100bp(理論サイズ102 bp)をわずかに上回る推定サイズで生成した。C.ノビレ同定試験の場合、非標的種C.ノビレ陽性対照は、50〜100bpの間のバンドを生じ、理論サイズ65bpに適合した。残りの車線は、フィールドテストで観察されるように、これらの井戸の蛍光シグナルの欠如と一致していた特定の増幅産物を示さなかった。

PCR増幅後、融解曲線解析を行い、加熱時の二本鎖DNA(dsDNA)の解離特性を評価した。メルトカーブ解析の最終サイクル中に温度が上昇するにつれて、温度が上昇すると二本鎖アンプリコンの解別が起きました。インターカレーション蛍光色素を徐々に溶液中に放出し、蛍光強度を低下させた(図9A)。第1誘導曲線の変曲点を用いて、溶融温度(図9B)を決定し、これは主にDNA断片長およびGC含有量に依存する。Ct値と融解温度を組み合わせることで、qPCR分析の特異性を高めることができます。現在の研究では 、M.シャモミラ 陽性対照PCRアンプリコンの融解温度ピークは85.6°C(GCP_GCT)で発生し、79.1°C(RCP_RCT)における C.ノビレ 陽性対照PCRアンプリコンの融解温度ピークとは異なっていた。フィールドフラワーヘッドと葉のPCRアンプリコンは、それぞれ85.2°Cと84.8°Cで融解温度のピークを生成しました(Sample1(FLOWER)_GCTとサンプル2(LEAF)_GCT)。ポータブルqPCRシステムで測定した融点変動を評価するために、試料融解温度がM. シャモミラ 陽性対照(2°C以内)から得られる融点に常に近く 、C.ノビレ 正気制御アンプリコンの融解温度から遠く離れていることを確認するために、追加のデータポイントを収集した(図10)。融解温度ピークは、他の井戸で報告された。しかし、それらのCt値は25以上であり、融解温度ピークは M.シャモミラ または C.ノビレ 陽性対照(2°C以上離れている)に近いではなかった。

要約すると、フィールド M. チャモミラ 識別検定は 、表 5に要約された決定規則に基づいて解釈できます。すべての陽性対照は、推定植物種に陽性、他の種に対して陰性、および陰性対照試験陰性で、両方のフィールドサンプルは M.チャモミラ を含むが C.ノビレを含まないと決定された。さらに、フィールドテスト結果を他の分析技術と一致させるために、フィールド結論は、以前に検証されたDNAバーコード方式25( データは示されていない)によってさらに確認された。

figure-results-1
図1:植物材料の形態学的同定(A)ハイビスカス・ローザ・シネンシスの花、クルクマロンガの根、マルヴァ・シルヴェストリスの葉、ロスマリヌス・オフィシナリスの葉、コリンドラム・サティバム種子、ジンギバー・オフィシナールの根。(B)ペトロセリナムクリスプとアピウム砂利石片は区別が困難である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:植物材料の化学的同定()HPTLC機器と代表的なHPTLCクロマトグラム。(B)HPLC装置および代表的なHPLCクロマトグラム。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:マトリカリアシャモミラとチャマエムラム・ノビレ(A)マトリカリア・シャモミラは、ウィキペディアからCC BY-SA 3.0の下で適応した、https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg。(B)カマエムム・ノビレは、CC BY-SA 3.0のウィキペディアから適応した、https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:M.チャモミラ植物部品を現場から回収する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5
図 5: デモでのテスト井戸のレイアウトこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-6
図6:採取管内のフィールドDNA抽出物植物組織は元のチューブに残り、黄色がかったDNA抽出物で覆われています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-7
図7:25サイクルにわたるサーモサイクリングのPCR産物の蓄積を示す蛍光プロット。M.シャモミラ 陽性対照および C.ノビレ 陽性対照は、それぞれ M.シャモミラ および C.ノビレ 同定試験において25未満のCt値を示す。フィールドの花と葉のサンプルは、15.18と19.41のCt値を有する M.シャモミラ 同定試験によって増幅された。残りの井戸は増幅されなかった。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-8
図8:フィールドPCR増幅産物のゲル電気泳動この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-9
図9:溶融温度解析(A)各ウェルの蛍光シグナルは温度上昇に伴って減少する。(B)PCR産物の同一性を、融解曲線解析における融解温度ピークにより確認した。フィールドの花と葉のサンプルは、85.2 °Cと84.8 °Cでピークを示しています。 これらは、M.シャモミラ陽性対照によって生成されたピークに近いです。C.ノビレ陽性対照は、他の3つのサンプルとは異なる79.1°Cでピークを生み出した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-10
図10:正の制御とフィールドサンプルの間の溶融温度ピーク変動。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

段階サイクル温度時間
一定温度195°C60 年代
増幅2595°C30 代
60°C30 代
融解曲線160°Cランプ 0.05 °C/s
95°C

表 1:M.シャモミラおよびC.ノビレ 同定試験のqPCR熱サイクル条件

試験プライマー名シーケンス 5'-3'位置地域アンプリコンサイズ
マトリカリア・リカティータZL3CCGTCGGTCGCAAGGATAAG転送ITS2102 bp
ZL4タアクトカグッガグタグタグタグタル逆
チャマエメルム・ノビレZL11TGTCGCACGTTGCTAGGAAGCA転送ITS265 bp
ZL12TCGAAGCGTCATTAAGACAAC逆

表 2:M.シャモミラ と C.ノビレ 同定試験用プライマーペア。

まあ位置よく名前説明
1GC_PosCtrl_GC_TestGC試験下のドイツカモミール陽性制御
2GC_PosCtrl_RC_TestRC試験下のドイツのカモミール陽性制御
3RC_PosCtrl_GC_TestGC試験下のローマカモミール陽性制御
4RC_PosCtrl_RC_TestRCテスト下のローマカモミール陽性制御
5Field_Sample_GC_TestGC試験下の葉組織のサンプル
6Field_Sample_RC_TestRC試験下の葉組織のサンプル
7Field_Sample_GC_TestGC試験下の花組織のサンプル
8Field_Sample_RC_TestRC試験下の花組織のサンプル
9NegCtrl_GC_TestGCテスト下の陰性制御サンプル
10NegCtrl_RC_TestRCテスト下の陰性制御サンプル

表 3:M.シャモミラ と C.ノビレ 識別試験の種類と説明。

試薬GC_TestRC_Test
ユニバーサル qPCR ミックス*10 μL10 μL
ZL3プライマー(10μM)0.4 μLNa
ZL4プライマー(10μM)0.4 μLNa
ZL11 プライマー (10 μM)Na0.4 μL
ZL12 プライマー (10 μM)Na0.4 μL
H2O (ヌクレアーゼフリー)7.2 μL7.2 μL
*ホットスタートTaq DNAポリメラーゼが含まれています

表 4:M.シャモミラ および C.ノビレ 同定試験用のマスターミックス組成物。

ウェルネーム期待される結果正の結果の抽出条件負の結果の抽出条件
検出/現在検出されない/存在しない
GC_PosCtrl_GC_Test検出Ct < 25 と 84 <= Tm <= 86-
GC_PosCtrl_RC_Test検出されませんでした-25 サイクル以内に Ct 値なし
RC_PosCtrl_GC_Test検出されませんでした-25 サイクル以内に Ct 値なし
RC_PosCtrl_RC_Test検出Ct < 25 と 79 <= Tm <= 81-
Field_Sample_Leaf_GC_Test存在Ct < 25 と 84 <= Tm <= 8625 サイクル以内に Ct 値なし
Field_Sample_Leaf_RC_Test欠席-25 サイクル以内に Ct 値なし
Field_Sample_Flower_GC_Test存在Ct < 25 と 84 <= Tm <= 8625 サイクル以内に Ct 値なし
Field_Sample_Flower_RC_Test欠席-25 サイクル以内に Ct 値なし
NegCtrl_GC_Test検出されませんでした-25 サイクル以内に Ct 値なし
NegCtrl_RC_Test検出されませんでした-25 サイクル以内に Ct 値なし

表 5: qPCR 結果解釈の規則

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プライマーとテンプレート選択の設計は、効率的かつ特異的なqPCR増幅を得る上で重要なステップです。適切なテンプレートを同定した後、プライマー設計ソフトウェアは、典型的には、プライマー長、融解温度、およびGC含有量33、34,34などの設計変数に基づいてプライマーの選択を支援するために使用される。最適化および検証は、PCR反応35の特異性、感度、および堅牢性を確保するために、アッセイの予想される実験条件の下で行うことができる。最適でないプライマー設計はプライマーダイマー形成をもたらし、プライマー相互作用が非特異的な産物を生成する36.

この研究で使用されるテンプレートなし制御(NTC)は、DNA汚染とアッセイに影響を与える可能性のあるプライマーダイマーの存在の両方をチェックします。結果は増幅を示さなかった、DNA汚染およびプライマーダイマーの両方が懸念されないことを示す良い徴候である。DNA汚染およびプライマーダイマーは、テンプレートコントロールを通らず、正のコントロールのメルトカーブの余分なピークとしてメルトカーブに現れます。一般的に、正のコントロールのメルト曲線は、テンプレート内のATリッチサブドメインが不均一な融解を引き起こさない限り、単一のピークを含むことが期待される。uMELTソフトウェア37を用いて融解アッセイをシミュレートすることで、二重ピークを予測できる。本研究では、アガロースゲル上でPCR産物を実行するゴールドスタンダードを用いて、標的PCR産物の存在および汚染およびプライマーダイマーの存在を確認した。

植物材料分子解析における大きな課題は、植物DNA抽出プロセスに従って良質DNAを得ることです。植物材料は、健康上の利点に関連付けられている活性化学化合物のために取引され、消費されます。.DNA抽出の過程で、これらの化学化合物もDNA抽出溶液中に放出され、PCR阻害を引き起こす可能性があり、これによりPCR増幅の失敗を引き起こす可能性があります。有機溶媒およびカラムを用いた各種植物DNA精製キットは、植物由来の化学化合物38を除去するために開発されている。しかし、これらのキットを支援するために必要なヒュームフードと高速遠心分離機は、フィールドでは利用できません。

現在のプロトコルでは、簡略化されたDNA抽出方法は、市販の植物DNA抽出キットを使用しています(詳細については 、材料表 を参照)。それは再現可能な結果のために一般的な阻害物質を中和する能力を有し 、M.シャモミラ および C.ノビレ のための一貫した結果を生み出した。 M.シャモミラ と C.ノビレ の両花頭と葉は、特定の溶融ピークを有するPCRアンプリコンを生じ、PCR阻害剤の存在が懸念されないことを示す。PCR阻害剤のレベルが高い他の植物の場合、元の抽出でDNAを増幅することは効率が悪いかもしれません。阻害を低減し、増幅効率を向上させるために、植物全体へのアクセスを伴い、より低い多糖類およびポリフェノール含有量を有する他の植物部分も同定目的に使用することができる。異なる植物部分へのアクセスが限られている場合、花の頭から解剖された若い葉や花びらは、典型的には、より低いフェノール含有量39を有する、成功のより良いチャンスを提供するかもしれない。DNA配列は植物全体で一貫しているため、種の同一性を確認するために任意の植物部分を使用することができます。PCR増幅がまだ最適でない場合、元のDNA抽出物はPCRの前にさらに希釈することができ、より高度な実験室浄化プロトコルを使用することができます。

PCR 分析のもう 1 つの課題は、DNA 汚染によって引き起こされる偽陽性の結果であり、データ解釈に悪影響を与える可能性があります。通常、アクティブなハウスキーピング、専用機器の使用、指定されたエリアへの作業の制限によって制御されます。qPCRを使用すると、すべてのPCR分析を閉じたシステムで行うことができるため、十分に制御されていない環境でのPCRアンプリコン汚染の可能性を大幅に低減できます。また、以前の検証研究40によると、環境DNAはまた、アッセイの特異性のために偽陽性を示すべきではない。

改善の余地がある。ここで提示するプロトコルでは、中間色素を使用して、標的断片増幅をリアルタイムで示した。この方法の特異性は 、M.シャモミラ と C.ノビレ アンプリコンの間で明確である特徴的な融解温度によってさらに確認される。そのため、インターカレート色素ベースPCRは、現場で「この植物種は何ですか」という質問に効率的に答えることができます。しかし、現場から隔離された単一の植物に対して植物同定を行う必要性に加えて、多くの状況において、倉庫内の植物粉末または抽出物は、現場での迅速な識別評価の恩恵を受ける。この種の材料については、「この材料には何が含まれているのか」、「私が探している植物種が含まれているのか」、「避けたい汚染物質が含まれているのか」、「有害な他の植物種によって部分的に置き換えられるのか」など、追加の質問に対処する必要があります。インターカレート色素を使用する代わりに、異なるqPCRプローブは、アッセイの高い特異性と効率を維持しながら、1つの反応系で異なる植物からのアンプリコンを標的にするように設計することができます。プローブベースのqPCRの開発と、複数のチャネル検出を提供するポータブルqPCRシステムの利用により、より複雑な質問に答えるために、植物材料倉庫や流通センターなどのより広範な環境環境に対する目的に適合するアッセイとしてのフィールドテストの適用をさらに拡張することができます。さらに、複数のプローブを使用すると、ユーザーは各反応系に内部増幅を含めることができるように、PCR阻害が疑われる場合により多くの情報が利用可能になる。

ここで示すプロトコルは、同じ目的で使用される既存の技術と比較して、次の利点があります。まず、従来の形態学的および化学的同定法では、手順とその結果を専門家が行い、解釈する必要があります。qPCRベースの同定試験は、基本的な分子生物学の訓練を受けた人々によって行われ、より標準化された方法で解釈することができます。第二に、実験室で通常行われるqPCRベースの種同定と分化と比較して、ポータブル機器を用いたフィールド識別プロトコルは、高速遠心分離機、DNA品質評価装置、蛍光検出器付きサーマルサイクラー、および特別なソフトウェアを実行するコンピュータのような大きなフットプリントを有する機器を必要としない。従って、DNAベースの種同定は、遅延なく任意の設定で行うことができる。第三に、植物材料の探索は、グローバルな操作を必要とするタスクです。クラウド サービスと人工知能の進歩により、ポータブル デバイスは、研究室の専門家によって開発および検証された方法を受け取り、遠隔地の専門家が運用し、第三者から客観的な認定を取得する可能性があります。したがって、このオプションは、リモート作業がトレンドになる中で、これまで以上に魅力的です。

要約すると、ここでのプロトコルは、ポータブルqPCRシステムを使用して M.チャモミラ のフィールド識別を実証した。この技術の成功した適用は植物の識別に非常に正確な結果を生成し、植物の製造業者およびサプライヤーが適時かつコスト効率の高い方法で植物材料を修飾するのを助ける。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

鄭秀陽、鄭権、ティファニー・チュア、レオ・リー、ヤンジュン・ザン、シルバ・ババジャニアン、トリシア・チュア、ピーター・チャン、ゲイリー・スワンソン、鄭飛・ルーがハーバライフ・インターナショナル・オブ・アメリカ社の従業員であることを証明します。フランチェスコ・ブオンジョルノ、イザベラ・デッラ・ノーセ、ロレンツォ・コロンボは、この記事で使用されるポータブルqPCR機器を生産するハイリス株式会社の従業員であることを証明しています。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ジェームズ・シャンのフィールドビデオ録画の努力に感謝します。ジョン・バイロンとマシュー・セメラウのビデオ編集の仕事に感謝します。アンセン・ルオ、ハリー・デュ、フランク・デンがテストフィールドを見つけてくれたことに感謝します。私たちは、原稿全体に彼女の貴重なコメントのためにマリア・ルビンスキーに感謝します。すべての認められた人は、ハーバライフ・インターナショナル・オブ・アメリカ社の従業員です。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
バッテリーTNE78000mAhフィールド電源を提供
bCUBEHYRISbCUBE 2.0ポータブル qPCR 機器
カートリッジ(16 ウェル)HYRISNAbCUBE
電動ピペットエッペンドルフ NA取り扱い液体
Extract-N-Amp<>supTM プラント PCR キットSIGMAXNAP2-1KT植物DNA抽出キット
ジャーマンカモミール(Matricaria chamomilla L) 花 植物標準物質AHP2264ポジティブコントロールとして使用
ミニドライバスYooningMiniH-100LDNA抽出用
ヌクレアーゼフリー水AMBIONAM9937qPCR反応
プライマーサーモフィッシャーサイエンティフィックNAqPCR反応
ローマカモミール (Chamaemelum nobile) 花の植物標準物質ChromaDexASB-00030806-005ポジティブコントロールとして使用
Luna universal qPCR master mixNEBM3003LqPCR reaction

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, T., Gillespie, M., Eckl, V., Knepper, J., Reynolds, C. Herbal supplement sales in US increase by 9.4% in 2018. HerbalGram. 123, 62-73 (2019).
  2. Israelsen, L. D. The challenge of regulation, globalization and climate change on botanicals and traditional medicines: respecting tradition while embracing change. Planta Medica. 74 (3), 36(2008).
  3. Cardellina, J. H. Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry. Journal of Natural Products. 65 (7), 1073-1084 (2002).
  4. Foster, S. Exploring the peripatetic maze of black cohosh adulteration: a review of the nomenclature, distribution, chemistry, market status, analytical methods and safety. HerbalGram. 98, 32-51 (2013).
  5. Vanherweghem, J. L. Misuse of herbal remedies: The case of an outbreak of terminal renal failure in Belgium (Chinese herbs nephropathy). The Journal of Alternative and Complementary Medicine. 4 (1), 9-13 (1998).
  6. Vanherweghem, J. L., et al. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs. The Lancet. 341 (8842), 387-391 (1993).
  7. Khan, I. A., Smillie, T. Implementing a "quality by design" approach to assure the safety and integrity of botanical dietary supplements. Journal of Natural Products. 75 (9), 1665-1673 (2012).
  8. Applequist, W. The Identification of Medicinal Plants: A Handbook of the Morphology of Botanicals in Commerce. , Missouri Botanical Garden Press. (2006).
  9. Upton, R., Graff, A., Jolliffe, G., Länger, R., Williamson, E. American Herbal Pharmacopoeia: Botanical Pharmacognosy - Microscopic Characterization of Botanical Medicines. , CRC Press. (2016).
  10. Frommenwiler, D. A., et al. Comprehensive HPTLC fingerprinting for quality control of an herbal drug - the case of angelica gigas root. Planta Medica. 84 (6-7), 465-474 (2018).
  11. Heyman, H. M., Meyer, J. J. M. NMR-based metabolomics as a quality control tool for herbal products. South African Journal of Botany. 82, 21-32 (2012).
  12. Lazarowych, N. J., Pekos, P. Use of fingerprinting and marker compounds for identification and standardization of botanical drugs: strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products. Drug Information Journal. 32 (2), 497-512 (1998).
  13. Tankeu, S., et al. Hyperspectral imaging and support vector machine: a powerful combination to differentiate black cohosh (actaea racemosa) from other cohosh species. Planta Medica. 84 (6-7), 407-419 (2018).
  14. Rodman, J. E., Cody, J. H. The taxonomic impediment overcome: NSF's Partnerships for Enhancing Expertise in Taxonomy (PEET) as a model. Systematic Biology. 52 (3), 428-435 (2003).
  15. Chen, S., et al. A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA. Biotechnology Advances. 32 (7), 1237-1244 (2014).
  16. Li, X., et al. Plant DNA barcoding: from gene to genome. Biological Reviews. 90 (1), 157-166 (2015).
  17. Madesis, P., Ganopoulos, I., Sakaridis, I., Argiriou, A., Tsaftaris, A. Advances of DNA-based methods for tracing the botanical origin of food products. Food Research International. 60, 163-172 (2014).
  18. Newmaster, S. G., Ragupathy, S., Janovec, J. A botanical renaissance: state-of-the-art DNA bar coding facilitates an automated identification technology system for plants. International Journal of Computer Applications in Technology. 35 (1), 50-60 (2009).
  19. Parveen, I., Gafner, S., Techen, N., Murch, S. J., Khan, I. A. DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: strengths and limitations. Planta Medica. 82 (14), 1225-1235 (2016).
  20. Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. A pocket-sized convective PCR thermocycler. Angewandte Chemie International Edition. 46 (23), 4316-4319 (2007).
  21. Almassian, D. R., Cockrell, L. M., Nelson, W. M. Portable nucleic acid thermocyclers. Chemical Society Reviews. 42 (22), 8769-8798 (2013).
  22. Benítez-Páez, A., Portune, K. J., Sanz, Y. Species-level resolution of 16S rRNA gene amplicons sequenced through the MinION portable nanopore sequencer. Gigascience. 5 (1), 4(2016).
  23. Emanuel, P. A., et al. Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using a hand-held PCR thermocycler. Journal of Clinical Microbiology. 41 (2), 689-693 (2003).
  24. Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228(2016).
  25. Lu, Z., et al. Single-laboratory validation of a two-tiered DNA barcoding method for raw botanical identification. Journal of AOAC International. 102 (5), 1435-1447 (2019).
  26. Sgamma, T., et al. DNA barcoding for industrial quality assurance. Planta Medica. 83 (14-15), 1117-1129 (2017).
  27. Wallinger, C., et al. Rapid plant identification using species-and group-specific primers targeting chloroplast DNA. PLoS One. 7 (1), 29473(2012).
  28. Newmaster, S. G., et al. Recommendations for validation of real-time PCR methods for molecular diagnostic identification of botanicals. Journal of AOAC International. , (2019).
  29. Singh, O., Khanam, Z., Misra, N., Srivastava, M. K. Chamomile (Matricaria chamomilla L.): an overview. Pharmacognosy Reviews. 5 (9), 82(2011).
  30. Mills, S. Y., Bone, K. The Essential Guide to Herbal Safety. Elsevier Health Sciences. , 325(2004).
  31. Avula, B., et al. Quantitative determination of phenolic compounds by UHPLC-UV-MS and use of partial least-square discriminant analysis to differentiate chemo-types of Chamomile/Chrysanthemum flower heads. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 278-288 (2014).
  32. Guzelmeric, E., Vovk, I., Yesilada, E. Development and validation of an HPTLC method for apigenin 7-O-glucoside in chamomile flowers and its application for fingerprint discrimination of chamomile-like materials. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 108-118 (2015).
  33. Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. Genome Research. 3 (3), 30-37 (1993).
  34. Untergasser, A., et al. Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3. Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 71-74 (2007).
  35. Bustin, S., Huggett, J. qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).
  36. Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3235-3241 (1997).
  37. Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), Oxford, England. 1019-1020 (2011).
  38. Heikrujam, J., Kishor, R., Mazumder, P. B. The chemistry behind plant DNA isolation protocols. Biochemical Analysis Tools - Methods for Bio-Molecules Studies. , (2020).
  39. Blum-Silva, C. H., Chaves, V. C., Schenkel, E. P., Coelho, G. C., Reginatto, F. H. The influence of leaf age on methylxanthines, total phenolic content, and free radical scavenging capacity of Ilex paraguariensis aqueous extracts. Revista Brasileira de Farmacognosia. 25 (1), 1-6 (2015).
  40. Lu, Z., et al. Validation of a targeted PCR method for raw and processed botanical material identification: an example using matricaria chamomilla (chamomile). Journal of AOAC International. 102 (6), 1787-1797 (2019).

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

DNA qPCR

関連記事