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方法論記事

ライブセル超解像顕微鏡と単一分子トラッキングのための従来のBODIPYコンジュゲート

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DOI:

10.3791/60950

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2020年6月8日

 ,  ,  , 
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

従来のBODIPYコンジュゲートは、一過性形成、赤シフト地盤状態ダイマーの開発を通じて、生細胞単一分子局在化顕微鏡(SMLM)に使用することができます。我々は、生きている哺乳類および酵母細胞における細胞内中性脂質および脂肪酸をナノスコピック長さスケールで追跡し、解決するための最適化されたSMLMプロトコルを提示する。

要約

一分子局在化顕微鏡(SMLM)技術は、従来の蛍光顕微鏡の光学回折限界を克服し、細胞内構造と生体分子のダイナミクスを〜20nmの精度で解決することができます。SMLMの前提条件は、何千ものデータ取得フレームのそれぞれでポイントスプレッド機能の時空間的な重複を避けるために、暗い状態から蛍光状態に移行する蛍光HOREです。BODIPYは、従来の顕微鏡で使用される多数のコンジュゲートを備えた確立された染料です。赤シフトBODIPY地中状態ダイマー(DII)の一過性形成は、明るい単一分子放出をもたらし、単一分子局在顕微鏡(SMLM)を可能にする。ここでは、生きている酵母および哺乳類細胞における従来のBODIPYコンジュゲートを用いたSMLMのためのシンプルだが汎用性の高いプロトコルを提示する。この手順は、超解像画像を取得し、BODIPY-DII状態を追跡してBODIPYコンジュゲートの時空間的情報を抽出するために使用できます。この手順を応用して、ナノスコピック長さスケールで生きている酵母や哺乳動物細胞の脂質滴(LD)、脂肪酸、リソソームを解決します。また、他の蛍光プローブと併用した場合の、BODIPY色素によるマルチカラーイメージング能力を実証しています。我々の代表結果は、供給および断食条件下で酵母におけるBODIPY脂肪酸および中性脂質の差動空間分布および移動性を示す。SMLM用のこの最適化されたプロトコルは、市販の何百ものBODIPYコンジュゲートで使用することができ、この研究の用途をはるかに超えてナノスケールで生物学的プロセスを研究するのに有用なリソースです。

概要

確率的光学再構成顕微鏡(STORM)や光活性化局在化顕微鏡(PALM)などの単一分子局在化顕微鏡(SMLM)技術は、アッベの光学回折限界1,22を超える情報を持つ超解像画像を生成する方法として、そして単一1生体分子33,44のダイナミクスを追跡する方法として浮上している。SMLMと互換性のあるプローブの要件の1つは、ポイントスプレッド関数(PSF)の空間的な重複を避けるために、アクティブフルオロフォアの数をいつでも制御できることです。何千ものデータ取得フレームのそれぞれで、各蛍光蛍光蛍光色素の位置は、その対応するポイントスプレッド関数をフィッティングすることによって〜20 nmの精度で決定されます。従来、フルオロフォアのオンオフ点滅は、確率的な光スイッチング11、2、5、2,5または化学的に誘発された固有の点滅6によって制御されてきた。他のアプローチとしては、蛍光物質活性化タンパク質77,88への過渡的結合時の蛍光物質の誘導活性化と、全内部反射蛍光(TIRF)またはライトシート励起における標識DNAオリゴマーのプログラマブル結合結合(TIRF)が含まれる。最近、従来のホウ素二重火メタン(BODIPY)コンジュゲート11、12、1312,13の赤シフト二量体(DII)状態が一時的に形成され、赤シフト波長で特異的に励起され検出されるSMLM10の新しい多目的なラベリング戦略を報告しました。11

BODIPYs は、細胞下の区画と生体分子14,,15,,16に特異的に標識する何百もの変異体を有する色素として広く使用されている。生細胞での使いやすさと適用性のために、BODIPY変異体は従来の蛍光顕微鏡で市販されています。ここでは、何百もの市販のBODIPYコンジュゲートをライブセルSMLMに使用する方法に関する詳細かつ最適化されたプロトコルについて説明します。BODIPYモノマーの濃度を調整し、励起レーザーパワー、イメージング、データ解析パラメータを最適化することにより、生細胞で高品質の超高解像度画像と単一分子追跡データが得られます。低濃度(25-100 nM)で使用する場合、BODIPYコンジュゲートは、赤シフトチャネルのSMLMと従来の発光チャネルにおけるコナルコンルジェンス用蛍光顕微鏡に同時に使用することができます。得られた単一分子データを分析して、不動構造の空間的組織を定量化し、生細胞17における分子の拡散状態を抽出することができる。緑色と赤色の両方の形態のBODIPYプローブの利用可能性は、他の互換性のあるフルオロフォアとの適切な組み合わせで使用する場合、マルチカラーイメージングを可能にします。

本レポートでは、複数色のBODIPY-C 12、BODIPY(493/503)、BODIPY-C12赤、リソトラッカーグリーンを使用して、ライブセル12SMLMデータを取得および分析するための最適化されたプロトコルを提供します。生きている酵母細胞や哺乳動物細胞の脂肪酸と中性脂質を、30nmの分解能で分解します。さらに、酵母細胞が代謝状態に応じて外部付加脂肪酸の空間分布を調節することを実証する。加えたBODIPY-脂肪酸(FA)は、摂食条件下で小胞体(ER)および脂質液滴(LD)に局地的に局部化するのに対し、BODIPY-FAは断食時に血漿膜中に非LDクラスターを形成することを発見した。我々は、生きている哺乳動物細胞におけるリソソームおよびLDを画像化するために、この技術の応用をさらに拡大する。従来の BODIPY コンジュゲートを使用した SMLM 用の最適化プロトコルは、使用可能な無数の BODIPY コンジュゲートを使用してナノスケールで生物学的プロセスを研究するのに役立つリソースになります。

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プロトコル

注:酵母クローニングと内因性タグ付けについては、最近の出版物10を参照してください。

1. 酵母細胞サンプルのイメージング用調製

  1. w303酵母株の液体一晩培養液を調製する。滅菌木製スティックを使用して、酵母エキス-ペプトン-デキストロースを含む寒天プレートから少量の酵母細胞を、合成完全デキストロース(SCD)培地の〜2 mLで培養管に入れ、その中に少量の酵母細胞を見つけます。270rpmおよび30°Cの揺れインキュベーターでチューブを一晩インキュベートする。
  2. SCDで細胞の1:50朝希釈を行います。270rpmの振盪インキュベーターで30°Cで4時間希釈した細胞を培養し続け、細胞を指数相で増殖させ、〜0.6の光学密度(OD)に到達させる。
    注:この手順は、研究されている代謝状態によって異なる場合があります。BODIPY コンジュゲートは、指数成長段階で細胞を必要としません。.しかし、単一のBODIPY-DIIエミッタを分析するには強すぎるバックグラウンドシグナルを引き起こす可能性がありますので、静止期の間に死んだ細胞からの自己蛍光を認識してください。
  3. 断食細胞を研究するために、培地交換なしで2日間酵母培養を成長させます。
  4. 細胞をめっきする前に~30分で、室温で脱イオン化したH2Oに0.8mg/mLの無菌コンカナバリンA(ConA)の80 μLのチャンバーカバーグラスをインキュベートします。30分後、脱イオン化したH2Oでカバーグラスを3回洗います。
  5. イメージングの30分前に、チャンバーカバーグラス上の細胞をピペットし、新鮮なSCDの正しい体積で〜0.12の光学密度を達成する(通常、OD〜0.6で240 μL SCDで60 μL酵母培養)。細胞を落ち着かせ、ConA表面に30分間接着させます。
  6. 所望のBODIPYコンジュゲートをチャンバーカバーグラスに直接加え、最終濃度の100 nMで加えます。
    注:特定のセルラーコンパートメントのBODIPYsローカル密度に応じて、BODIPY濃度最適化実験が必要な場合があります。

2. SMLMイメージング用哺乳動物細胞の調製

  1. T25フラスコで10%胎児ウシ血清、4 mMグルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、1%ペニシリンストレプトマイシン抗生物質を用いて、非蛍光性DMEMの哺乳動物U2OS細胞を維持します。
    注:細胞は、10%のウシ胎児血清および1%ペニシリンストレプトマイシン抗生物質を用いてDMEMで維持することもできるが、非自己蛍光溶液でイメージングする前に培地を交換する必要がある。
  2. 70-80%の合流率1:5で細胞を8ウェルプレートの単一のウェルに分割します。8ウェルプレートの細胞をイメージング前に12〜24時間培養する。
  3. 画像化の10分前に、100 nM(ジメチルスルホキシド[DMSO]のストック溶液)の最終濃度で、BODIPY-C 12、LysoTracker Greenまたは他のBODIPYコンジュゲートを追加します。この時間は、所望の実験に応じて変化し得る。
    メモ:ライブセルイメージングソリューションを使用して、周囲温度(23°C)でイメージングを行うことができます。しかし、37°Cおよび5%CO2での2非蛍光性DMEMでのイメージングは、10%のウシ胎児血清、4mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムおよび1%ペニシリンストレプトマイシン抗生物質を混合して、細胞を生理学的状態に近づけ、生物学的結論を下すために好ましい。

3. 設備準備

  1. 使用されている BODIPY の放出色に基づいて、適切なフィルタ セットをエミッション パスにマウントします。
    メモ:クワッドバンド二色ミラー(zt/405/488/561/640rdc)は、最初に励起と発光光を分離します。次に、緑の放出(525 nm)と赤の放出(595 nm)は、二色性ロングパスビームスプリッター(T562lpxr)によって、次いでグリーンチャネルのバンドパスフィルタET525/50、赤チャネルのET 595/50によって分割されます。2つのチャンネルは、同じカメラチップの異なる領域に投影されます。同様に、赤い放射(595 nm)と遠赤色の放出は、最初に二色性ロングパスビームスプリッター(FF652-Di01)によって分割され、次いでバンドパスフィルタET 610/75が赤色で、FF731/137は遠赤色チャネルで分割されます。
  2. 顕微鏡、顕微鏡ステージ、レーザー(488 nm、561 nm)、カメラをオンにします。ここでは、完璧なフォーカスシステムと-68°Cに冷却されたEMCCDカメラを備えた反転顕微鏡が使用されています。
  3. 顕微鏡の目的に浸漬油の滴を加える。
  4. 明視野イメージング、レーザーパワー、レーザーシャッター、イメージング用カメラ設定のLEDライトを制御するHal4000ソフトウェア(材料表参照)を開きます。EMCCDゲインを30に、カメラ温度を-68 °Cに設定します。20 Hzで映画を録画するためにカメラと対応するソフトウェアを準備します。
    注:この技術は、光活性化局在化顕微鏡(PALM)および確率的光学再構成顕微鏡(STORM)イメージングが可能な広視野顕微鏡に適用されます。対応するソフトウェアは異なる場合があります。
  5. 顕微鏡ステージヒーターをオンにし、37°Cの温度とCO2レベル5%に設定します。目的の補正カラーを適宜調整します。
  6. サンプルを顕微鏡ステージに取り付け、フォーカスシステムがかみ合うまで焦点を合わせます。正常なセルが視野に表示されるまで、ステージコントローラーを使用してステージを移動します。
    注:室温で酵母細胞をイメージングする場合、ヒーターまたはCO2コントロールをオンにする必要はありません。
  7. モノマーとダイマーの励起に適したレーザーをオンにします。BODIPYグリーンまたはライソトラッカーグリーンの場合、SMLMのDII状態を励起するために561 nmレーザーを使用し、従来の蛍光のためにモノマーを励起するために488 nmレーザーを使用します。
    注:BODIPY赤色の場合は、640 nmレーザーを使用してSMLMのDII状態を励起し、561 nmレーザーを使用して従来の蛍光のためにモノマーを励起します。BODIPY 赤の場合は、561 nm および 640 nm レーザーパワーを調整して、赤チャネルのバルク蛍光を視覚化し、遠赤色チャネルで単一分子バーストを表示します。561 nmの典型的な電力は、640 nmの場合は〜0.06 W/cm2、〜5 kW/cm2です。BODIPYグリーンの場合、561 nm励起の下の緑の放出チャネルで従来の蛍光も見ることを期待する。BODIPY赤色の場合、640 nm励起下の赤色チャネルに従来の蛍光が見えることを期待する。この信号は、連続的なレーザー励起を伴うモノマー/ダイマーの共局在画像に有用となる抗ストークス発光から生じる。

4. データ取得

  1. モノマーとダイマーの励起のためのロードレーザーシャッターシーケンス。
    注: 通常、561 nm で 9 つの単一分子励起フレームを使用し、その後に 488 nm で 1 つの従来の励起フレームを使用します。これは明るい従来の蛍光シグナルを提供し、多色画像化の適用の赤い単一分子の検出チャネルに緑の蛍光蛋白質(GFP)のような別の488 nmの興奮性蛍光色素の漏出を避ける。あるいは、561 nmレーザーを連続的にオンにし、短波長チャネルの従来の画像に対する抗ストークス発光に依存します。
  2. 561 nm励起下の赤ずれた発光チャネルで単一分子蛍光バーストが検出されるようにレーザーパワーを調整し、488nm励起の緑色放射チャネルに従来の蛍光が現れます。561 nmレーザーの典型的なレーザーパワーは、SMLMでは約0.8-1 kW/cm2、従来の蛍光イメージングモードでは488 nmレーザーの場合は0.035-0.07 W/cm2です。2
  3. 映画の保存先フォルダを選択し、5,000~20,000 の取得フレームを記録して、超高解像度イメージを再構築するのに十分なローカリゼーションを収集します。
  4. 別の視野に移動し、上記の手順を繰り返して、より多くのセルからデータを収集します。

5. データ分析と単一分子トラッキング

  1. ムービーを SMLM 解析ソフトウェアにロードします。
    注: 任意のソフトウェア18を使用できます。私たちは、INSIGHT (資料の表を参照)を使用し、imageJ (フィジー) の ThunderSTORM19プラグインを使用して結果をクロス検証します。
  2. 映像を視覚的にスクリーニングし、単一分子蛍光点滅が見えるようコントラスト設定を調整する。必要に応じて、サンプルの一部が継続的に蛍光を発している場合、SMLMデータ分析のための領域またはフレーム範囲を制限する。
  3. 2D ガウス PSF(ROI: ピクセル サイズ 160 nm、幅 260~650 nm、高さ > 50 光子を持つ 7 x 7 ピクセル)に適合するための単一分子識別パラメータを設定します。いくつかのフレーム例を視覚的にスクリーニングして識別パラメータを確認し、単一分子の蛍光バーストを確実に検出する(図1Cを参照)。
    注: 高さや幅などの特定の識別パラメータは、視覚的に知覚された単一分子蛍光シグナルの認識を最適化するために、わずかに調整することができます。
  4. 最適化された識別パラメータを使用して SMLM 画像解析を実行し、検出されたフォトン数の逆平方根によって幅が重み付けされた 2D ガウシアンとして各分子をレンダリングします。
  5. データの品質を評価します。制限されたフレーム範囲を使用して、より特定のインスタンスでの単一分子分布を時間的に観察します。これは、データ取得中のオルガネラの動きを説明することができます。
  6. さらに、分子分布の空間分布とダイナミクスを分析するには、取得した分子リストをエクスポートし、その座標、外観のフレーム、光子、幅、および高さを含む局在化します。カスタムの作成された分析手順で分子リストをインポートします。
  7. 単一分子分布の空間情報を得るためには、放射状距離20の関数としての局在の密度を表す放射状分布関数ρ(r)を計算する。ρ(r)を得るために、すべてのローカリゼーションのユニークな対方向距離を計算し、高さH(ri)でriを中心としたビンを持ち、幅drで2πri*drで除算してヒストグラムを構築します。(ρ(ri)= H(r i)/π(ri+dr)2-ri2)。iラジアル分布関数を使用して、クラスターの度合いとクラスターの特性サイズを定量化し、比較することができます。
  8. 分子の拡散に関する動的な情報を得るために、連続したデータ取得フレーム内の例えば3ピクセル(0.48 μm)以内に現れる局在化をリンクして、単一分子の痕跡を作成します。
    注: リンク距離は、分子の拡散と局在の密度によって異なります。最大リンク距離は、各フレーム21,22,22における局在の密度を分析することによって推定することができる。平均密度はμmあたり0.043の局在性を2と判断した。したがって、半径0.48μmは、異なる分子が相互にリンクされていないことを保証するのに十分な低密度の範囲内でした。
  9. 少なくとも 3 回のラグタイムを持続する複数のトレースからの異なるラグタイム Δt の変位を平均して、平均平方変位(MSD)と Δt プロットを作成します。MSD と Δt の曲線を式 MSD = 4DΔt + σ2に合わせて、平均拡散係数 D3を計算します。

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結果

ここでは、上記のプロトコルに基づいたBODIPYコンジュゲートを用いたSMLMの最適化されたサンプル調製、データ取得および分析手順を提示する(図1A)。SMLMデータを取得して分析するワークフローの例を示すために、酵母にBODIPY(493/503)を採用し、光回折限界を下回るLDを解決します(図1B-F)。-F図2に、GFP、mEos2などの他のプローブと組み合わせたBODIPYの異なるマルチカラーイメージングモードの例を示す。酵母の代謝状態を~48時間同じ培地で増殖させることで、酵母の代謝状態を操作し、BODIPY-C12が、供給条件下でのLDへの組み込みとは対照的に、断食時に細胞周辺において非移動性非LDクラスターを形成することを示す(図3)。さらに、BODIPYコンジュゲートのSMLM能力を哺乳動物細胞に拡張するために、生きたU2OS細胞でBODIPY-C12...

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ディスカッション

このプロトコルでは、従来のBODIPYコンジュゲートを使用して、空間解像度の桁違いの改善を伴うSMLM画像を得る方法を実証しました。この方法は、従来のBODIPY色素の以前に報告された赤シフトDII状態を利用することに基づいており、これは二分子的な出会いを通じて一時的に形成される。これらの状態は、特に赤ずれた波長で励起され、検出され、SMLMには十分にまばらで短命です。レーザーパラメータとともにBODIPYモノマーの濃度を調整することで、局在化と信号対雑音の最適な密度を実現できます。我々は、供給および絶食条件下で生きている酵母細胞において、脂肪酸類似体および中性脂質の細胞内分布と移動性を、約30nm分解能(理論上のトンプソンの公式)で解決した。また、BODIPY DII状態の約40%が20Hzで2つ以上のデータ取得フレームにとどまり、単一分子トラッキングが異なる条件下での移動性を定量化することを可能にすることがわかりました。我々の結果は断食時のBODIPY-FAの差異の局在および移動性を示し、脂肪毒性に対する保護メカニズムを示唆する。単一のBODIPY分子を追跡し、異なる代謝状態下で光学回折限...

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開示事項

著者らは競合する利益を宣言しない。

謝辞

本論文で報告された研究は、国立衛生研究所の国立総合医学研究所が、受賞番号R21GM127965の下で支援した。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BODIPY C12ThermoFisherD3822緑色脂肪酸アナログ
BODIPY C12 RedThermoFisherD3835赤色脂肪酸アナログ
BODIPY(493/503)ThermoFisherD3922中性脂質マーカー
Concanavalin ASigma-AldrichC2010ガラス表面への細胞固定化
ドロップアウトミックス 窒素塩基なし 完全SCD
キストロースシグマ-アルドリッチG7021用炭素源SCD
エイトウェルCellvisC8-1.58-Nチャンバーカバーグラス
エイトウェル、Lb-Tek IIシグマ-アルドリッチチャンバーカバーグラス
ET525/50マバンドパス
フィルターET595/50マバンドパスフィルター
ET610/75クロマバンドパスフィルター
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco26140079Serum
FF652SemrockBeam スプリッター
FF731/137Semrockバンドパスフィルター
FluoroBrite DMEMThermoFisherA1896701Cell Culture Medium
Hal4000Zhuang Lab, Harvard Universityデータ収集ソフトウェア
Ixon89Ultra DU-897UAndorEMCCDカメラ 光子検出用
Laser 405, 488, 561, 640 nmCW-OBIS励起用レーザー
Insight3Zhuang Lab, Harvard University単一分子ローカリゼー
ションソフトウェア L-GlutamineGibco25030-081細胞培養に必要なアミノ酸
生細胞イメージングソリューションThermoFisherA14291DJイメージングバッファー
Lysotracker GreenThermoFisherL7526ボディベース リソソームマーカー
哺乳類 ATCC U2OS 細胞 (バージニア州マナッサス)Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.ANikonOil immersion目的
ペニシリン ストレプトマイシンGibco15140-122抗生物質
ピルビン酸ナトリウムGibco11360-070細胞培養用サプリメント
T562lpxrクロマビームスプリッター
トリプシン-EDTAGibco15400-054接着細胞の解離
W303 MATa 株Horizon-DharmaconYSC1058親酵母菌
酵母窒素ベースSigma-AldrichY1250アミノ酸なし窒素塩基
zt405/488/561/640rdcクロマクワッドバンド ダイクロイック ミラー
デクロクロ

参考文献

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