方法論記事

ライブセル超解像顕微鏡と単一分子トラッキングのための従来のBODIPYコンジュゲート

DOI：

10.3791/60950

⸱

2020年6月8日

 ,  ,  , 
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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従来のBODIPYコンジュゲートは、一過性形成、赤シフト地盤状態ダイマーの開発を通じて、生細胞単一分子局在化顕微鏡(SMLM)に使用することができます。我々は、生きている哺乳類および酵母細胞における細胞内中性脂質および脂肪酸をナノスコピック長さスケールで追跡し、解決するための最適化されたSMLMプロトコルを提示する。

要約

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一分子局在化顕微鏡(SMLM)技術は、従来の蛍光顕微鏡の光学回折限界を克服し、細胞内構造と生体分子のダイナミクスを〜20nmの精度で解決することができます。SMLMの前提条件は、何千ものデータ取得フレームのそれぞれでポイントスプレッド機能の時空間的な重複を避けるために、暗い状態から蛍光状態に移行する蛍光HOREです。BODIPYは、従来の顕微鏡で使用される多数のコンジュゲートを備えた確立された染料です。赤シフトBODIPY地中状態ダイマー(DII)の一過性形成は、明るい単一分子放出をもたらし、単一分子局在顕微鏡(SMLM)を可能にする。ここでは、生きている酵母および哺乳類細胞における従来のBODIPYコンジュゲートを用いたSMLMのためのシンプルだが汎用性の高いプロトコルを提示する。この手順は、超解像画像を取得し、BODIPY-DII状態を追跡してBODIPYコンジュゲートの時空間的情報を抽出するために使用できます。この手順を応用して、ナノスコピック長さスケールで生きている酵母や哺乳動物細胞の脂質滴(LD)、脂肪酸、リソソームを解決します。また、他の蛍光プローブと併用した場合の、BODIPY色素によるマルチカラーイメージング能力を実証しています。我々の代表結果は、供給および断食条件下で酵母におけるBODIPY脂肪酸および中性脂質の差動空間分布および移動性を示す。SMLM用のこの最適化されたプロトコルは、市販の何百ものBODIPYコンジュゲートで使用することができ、この研究の用途をはるかに超えてナノスケールで生物学的プロセスを研究するのに有用なリソースです。

概要

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確率的光学再構成顕微鏡(STORM)や光活性化局在化顕微鏡(PALM)などの単一分子局在化顕微鏡(SMLM)技術は、アッベの光学回折限界1,22を超える情報を持つ超解像画像を生成する方法として、そして単一1生体分子33,44のダイナミクスを追跡する方法として浮上している。SMLMと互換性のあるプローブの要件の1つは、ポイントスプレッド関数(PSF)の空間的な重複を避けるために、アクティブフルオロフォアの数をいつでも制御できることです。何千ものデータ取得フレームのそれぞれで、各蛍光蛍光蛍光色素の位置は、その対応するポイントスプレッド関数をフィッティングすることによって〜20 nmの精度で決定されます。従来、フルオロフォアのオンオフ点滅は、確率的な光スイッチング11、2、5、2,5または化学的に誘発された固有の点滅6によって制御されてきた。他のアプローチとしては、蛍光物質活性化タンパク質77,8

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プロトコル

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注:酵母クローニングと内因性タグ付けについては、最近の出版物10を参照してください。

1. 酵母細胞サンプルのイメージング用調製

  1. w303酵母株の液体一晩培養液を調製する。滅菌木製スティックを使用して、酵母エキス-ペプトン-デキストロースを含む寒天プレートから少量の酵母細胞を、合成完全デキストロース(SCD)培地の〜2 mLで培養管に入れ、その中に少量の酵母細胞を見つけます。270rpmおよび30°Cの揺れインキュベーターでチューブを一晩インキュベートする。
  2. SCDで細胞の1:50朝希釈を行います。270rpmの振盪インキュベーターで30°Cで4時間希釈した細胞を培養し続け、細胞を指数相で増殖させ、〜0.6の光学密度(OD)に到達させる。
    注:この手順は、研究されている代謝状態によって異なる場合があります。BODIPY コンジュゲートは、指数成長段階で細胞を必要としません。.しかし、単一のBODIPY-DIIエミッタを分析するには強すぎるバックグラウンドシグナルを引き起こす可能性がありますので、静止期の間に死んだ細胞からの自己蛍光を認識してください。
  3. 断食細胞を研究するために、培地交換なしで2日間酵母培養を成長させます。
  4. 細胞をめっきする前に~30分で、室温で脱イオン化したH2Oに0.8mg/mLの無....

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結果

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ここでは、上記のプロトコルに基づいたBODIPYコンジュゲートを用いたSMLMの最適化されたサンプル調製、データ取得および分析手順を提示する(図1A)。SMLMデータを取得して分析するワークフローの例を示すために、酵母にBODIPY(493/503)を採用し、光回折限界を下回るLDを解決します(図1B-F)。-F図2に、GFP、mEos2などの他のプローブと組み合わせたBODIPYの異なるマルチカラーイメージングモードの例を示す。酵母の代謝状態を~48時間同じ培地で増殖させることで、酵母の代謝状態を操作し、BODIPY-C12が、供給条件下でのLDへの組み込みとは対照的に、断食時に細胞周辺において非移動性非LDクラスターを形成することを示す(図3)。さらに、BODIPYコンジュゲートのSMLM能力を哺乳動物細胞に拡張するために、生きたU2OS細胞でBODIPY-C12.......

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ディスカッション

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このプロトコルでは、従来のBODIPYコンジュゲートを使用して、空間解像度の桁違いの改善を伴うSMLM画像を得る方法を実証しました。この方法は、従来のBODIPY色素の以前に報告された赤シフトDII状態を利用することに基づいており、これは二分子的な出会いを通じて一時的に形成される。これらの状態は、特に赤ずれた波長で励起され、検出され、SMLMには十分にまばらで短命です。レーザーパラメータとともにBODIPYモノマーの濃度を調整することで、局在化と信号対雑音の最適な密度を実現できます。我々は、供給および絶食条件下で生きている酵母細胞において、脂肪酸類似体および中性脂質の細胞内分布と移動性を、約30nm分解能(理論上のトンプソンの公式)で解決した。また、BODIPY DII状態の約40%が20Hzで2つ以上のデータ取得フレームにとどまり、単一分子トラッキングが異なる条件下での移動性を定量化することを可能にすることがわかりました。我々の結果は断食時のBODIPY-FAの差異の局在および移動性を示し、脂肪毒性に対する保護メカニズムを示唆する。単一のBODIPY分子を追跡し、異なる代謝状態下で光学回折限.......

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開示事項

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著者らは競合する利益を宣言しない。

謝辞

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本論文で報告された研究は、国立衛生研究所の国立総合医学研究所が、受賞番号R21GM127965の下で支援した。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BODIPY C12ThermoFisherD3822緑色脂肪酸アナログ
BODIPY C12 RedThermoFisherD3835赤色脂肪酸アナログ
BODIPY(493/503)ThermoFisherD3922中性脂質マーカー
Concanavalin ASigma-AldrichC2010ガラス表面への細胞固定化
ドロップアウトミックス 窒素塩基なし 完全SCD
キストロースシグマ-アルドリッチG7021用炭素源SCD
エイトウェルCellvisC8-1.58-Nチャンバーカバーグラス
エイトウェル、Lb-Tek IIシグマ-アルドリッチチャンバーカバーグラス
ET525/50マバンドパス
フィルターET595/50マバンドパスフィルター
ET610/75クロマバンドパスフィルター
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco26140079Serum
FF652SemrockBeam スプリッター
FF731/137Semrockバンドパスフィルター
FluoroBrite DMEMThermoFisherA1896701Cell Culture Medium
Hal4000Zhuang Lab, Harvard Universityデータ収集ソフトウェア
Ixon89Ultra DU-897UAndorEMCCDカメラ 光子検出用
Laser 405, 488, 561, 640 nmCW-OBIS励起用レーザー
Insight3Zhuang Lab, Harvard University単一分子ローカリゼー
ションソフトウェア L-GlutamineGibco25030-081細胞培養に必要なアミノ酸
生細胞イメージングソリューションThermoFisherA14291DJイメージングバッファー
Lysotracker GreenThermoFisherL7526ボディベース リソソームマーカー
哺乳類 ATCC U2OS 細胞 (バージニア州マナッサス)Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.ANikonOil immersion目的
ペニシリン ストレプトマイシンGibco15140-122抗生物質
ピルビン酸ナトリウムGibco11360-070細胞培養用サプリメント
T562lpxrクロマビームスプリッター
トリプシン-EDTAGibco15400-054接着細胞の解離
W303 MATa 株Horizon-DharmaconYSC1058親酵母菌
酵母窒素ベースSigma-AldrichY1250アミノ酸なし窒素塩基
zt405/488/561/640rdcクロマクワッドバンド ダイクロイック ミラー
デクロクロ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.

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BODIPY C12

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