方法論記事

自動食物摂取モニタリングシステムを用いたラットにおけるショ糖嗜好と新規性誘発性低血圧試験

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DOI：

10.3791/60953

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2020年5月8日

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1Charité Center for Internal Medicine and Dermatology, Department for Psychosomatic Medicine, Charité-Universitätsmedizin, Corporate Member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin and Berlin Institute of Health, 2Department of Internal Medicine, Helios Clinic, 3Department of Psychosomatic Medicine and Psychotherapy, University Hospital Tübingen, 4Department of Quantitative Health Sciences, University of Massachusetts Medical School

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここに提示されたラットのうつ病のような行動とアンヘドニックな行動を研究するためのプロトコルです。これは、2つの確立された行動方法、スクロースの好みと新規性誘発性低phphagiaテストを組み合わせて、自動食品および液体摂取量監視システムを組み合わせて、代理パラメータを使用してげっ歯類の行動を間接的に調査します。

要約

うつ病の罹患率と罹患率は世界的に増加しており、約3億2,200万人の個人に影響を及ぼし、動物モデルにおける行動研究の必要性を強調している。このプロトコルでは、ラットにおけるうつ病様およびアンヘドニック挙動を研究するために、確立されたショ糖嗜好および新規発性誘発性低phphagia検査を、自動化された食物および液体摂取モニタリングシステムと組み合わせる。試験の前に、ショ糖好みのパラダイムにおいて、オスラットは、水道水に加えてスクロース溶液を消費するために少なくとも2日間訓練される。試験中、ラットは再び水とスクロース溶液に曝されます。消費は自動化システムによって毎秒登録されます。総水摂取量に対するスクロースの比率(ショ糖選好率)は、アンヘドニアの代理パラメータである。新皮性低血圧検査では、雄のラットは、口当たりの良いスナックにさらされるトレーニング期間を受ける。トレーニング中、げっ歯類は安定したベースラインスナック摂取量を示します。テスト日には、動物は自宅のケージから、既知の味わい深いスナックにアクセスできる新しい未知の環境を表す新鮮で空のケージに移されます。自動システムは、総摂取量とその基礎となる微細構造(例えば、スナックに近づくまでの待ち時間)を記録し、アンヘドニックおよび不安な行動に関する洞察を提供します。これらのパラダイムと自動測定システムの組み合わせにより、測定誤差を低減することで、より詳細な情報と精度を提供します。しかし、テストは代理パラメータを使用し、うつ病とアンヘドニアを間接的に描写するだけです。

概要

世界の人口の平均4.4%がうつ病の影響を受けています。これらの人は全世界で3億2,200万人を占め、10年前に比べて18%増加しました。世界保健機関(WHO)の推計によると、うつ病は2020年の障害調整寿命年のランキングで2位になります。情動障害の増加に対処し、新しい介入戦略を確立するために、この行動をさらに研究する必要があります。ヒトの検査の前および他に、動物実験が必要である。

うつ病行動の構成要素(すなわち、強制泳ぎ試験、尾懸濁試験、ショ糖好性試験、および新規発性誘発性低血圧)3,4,4の成分を研究するためにいくつかのモデルが確立されている。スクロース好み検査(SPT)および新規性誘発性低血圧(NIH)は、動物のうつ病様の行動を検出することができる。これらのテスト自体はげっ歯類のうつ病の状態を誘発しませんが、行動の急激な変化を描いています。SPTとNIHの両方がアンヘドニアとして知られているうつ病の特徴的な特徴を評価し、これは以下の関心の喪失である:やりがいのある活動、かつて個人5によって楽しまれた活動、および報酬6に対処する複雑な現象の1つの側面。両方のテストは、味わい深い食べ物の形でやりがいのある刺激に対する反応を研究します。消費の範囲は、アンヘドニア7、8,、9の代理パラメータとして機能します。9

アンヘドニアを調査するテストの値は、物質の重量の正確な測定から生じる消費の正確な決定に強く依存しています。従来、この測定は試験の前後に1回手動で行われる。ただし、これはいくつかの理由で誤った測定を行う傾向があります。まず、げっ歯類は食べ物を買いだめする傾向があり、すぐに食べ物を消費せずに食べ物を取り除き、安全な場所に隠すことを意味します。したがって、この食品の損失は、総消費量の計算に含まれてもよい。第二に、ラットは食物と水をこぼし、それぞれの消費なしに体重減少をもたらす。第三に、ボトルをケージから挿入および取り外すことによって、ボトルの取り扱いにより、意図しない液体の損失が生じる。

これらのエラー源を減らすアプローチでは、アンヘドニア(SPT33、4、NIH4 9)を評価する2つの一般的な試験と、自動食品および液体摂取量監視システムを使用した食品および水分摂取量の測定を組み合わせました。この手順は、口当たりの良い物質の消費の正確な調査を可能にするだけでなく、うつ病のような行動の特徴としてラットの喜びの経験に関する情報を提供します。手動測定に関連する上記のエラーは、後で詳しく説明する別のアプローチを使用して削減されます。

微細構造に関する情報を提供するために、このプロトコル10 で使用される自動摂取監視システムは、食品(±0.01g)を毎秒計量する。したがって、安定した体重は「食べない」と記録され、不安定な体重は「食べる」と表現される。「バウト」は、イベントの前後の安定した重量の変化として定義されます。食事は1つ以上の発作から成り、ラットの最小サイズは0.01gと定義された。食事は、ラットの別の食事から15分(標準化値)で分離される。したがって、食物摂取量は、15分以内に発作が起こり、体重変化が0.01g以上である場合の1食であると考えられる。このプロトコルで評価される食事パラメータには、食事の期間、食事に費やされた時間、吹き出物のサイズ、試合時間、吹き出物に費やされた時間、最初の試合までの待ち時間、およびバウトの数が含まれます。

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プロトコル

動物のケアと実験手順は、特定の制度倫理ガイドラインに従い、動物研究のための国家当局によって承認されました。

1. 自動監視システムの運用

注: 自動監視システムを操作する場合、アクションの直前にソフトウェアに含まれるコメントボックスに、すべてのアクションを文書化することが重要です。説明はコメント ボックスに入力し 、Saveキーを押すと特定のタイム ポイントで保存されます。タイムポイントは、システムが継続的に記録し、対象期間を分析のために指定する必要があるため、データを分析する際に重要です。

  1. 自動監視システムの設置、使用、保守
    注:このプロトコルは、体重250〜300g(約10週齢)の成人雄のスプレイグ・ドーレーラットを使用しています。順応期間中にラットを集団で収容することをお勧めします。環境条件は、6:00 A.M.のライトを点灯する12時間/12時間の暗/光サイクル、湿度45%~65%、温度21~23°C、水および標準げっ歯類食への アドリビタム アクセスのパラメータで制御する必要があります。毎日の取り扱いにより、動物は調査官に慣れることができました。
    1. すべての動物が個々のケージを持っているようにラットを分離します。すべてのラットがプロトコル中に分離されたままであることを確認します。
    2. ハウジングケージに通常の寝具を1~2cm厚い層で満たします。この(減少した)量は、マイクロバランスとホッパーのこぼれによる汚染の可能性を減少させ、それによって測定誤差を低減する。プラスチック管(直径8cmのプラスチック製排水管の長さ20cm)を加え、紙のティッシュを省略しながら、木材を濃縮して測定誤差を減らします。
    3. ケージの前面にあるカスタムメイドの穴にマイクロバランスを備えた2つの閉じたケージマウントを取り付けることで、自動固体および液体食品の取り込み測定のためにケージを準備します。ケージマウントに空のホッパーを2つ、チャウ用とボトル用のホッパーを2つ置きます。
      メモ:マイクロバランスは、コンピュータに接続された記録システムにケーブルで接続され、それぞれのソフトウェアがコンピュータにインストールされています。
    4. 記録を開始するには、"Monitor"を開いて [スタート] ボタンを押し、データを保存する場所を選択します。
    5. 自動摂取監視システムのキャリブレーション(プレス「キャリブレーション」機能)を使用して、ホッパーを取り外し、バランスを取ってケージマウントに2つの異なるゲージ重量を配置することで、すべてのバランスをキャリブレーションします。定期的な間隔で行います (毎週推奨)。
    6. 1ホッパーをチャウ(約100g)で完全に満たし、小さすぎるチャウピースや崩れを取り除きます。ボトル(約100mL)に水を入れ、もう一方のホッパーに入れます。
    7. 食品および水の位置を文書化する(例えば、バランス1:食品動物1、バランス2:水動物1)。
    8. ネズミをケージに入れ、ケージマウントのすべてのゲートを開けて、 アドリビタムを食べたり飲んだりできるようにします。
      注意:正確な測定のためには、こぼれからブラシで優しく清掃し、食品容器から小さな食品パン粉を取り除くことによって、毎日バランスとホッパーを維持する必要があります。これにより、誤った測定が大幅に減少します。毎日のメンテナンス中にすべてのゲートを閉じます。
  2. 実験後のデータへのアクセス
    1. 分析が必要な期間の開始タイムポイントと終了タイムポイント (トレーニング、テストなど) をコメントボックスで検索します。
    2. ソフトウェアの [データの表示] をクリックして、データ ビューアを開きます。
    3. [開始時刻] と [終了時刻] の下のボックスにタイム ポイントを挿入します。情報を記録した残高を示す左上隅の四角を押します。
    4. 「PSC の合計」をクリックして、マイクロストラクチャデータにアクセスします。[PSCテーブルのエクスポート] ボタンを押して、データをエクスポートします。
      注:自動監視を用いて個々の動物の微細構造(ストレスを受けていない場合とストレスを感じる)を比較するために、左上隅の適切な正方形を押すことで個々の動物を「データビューア」 で選択することができます。 PSC の合計は、 選択した動物の微細構造のみを示します。統計分析はシステムでは実行できません。データは、スプレッドシートプログラム/分析ソフトウェアに抽出する必要があります。

2. スクロース選好試験の実施

  1. トレーニング期間の実施
    注:テストの前に、動物はゲートを通ってホッパーの液体のための2つのボトルの入手可能性に慣れなければなりませんが、食べ物はケージの上から提供されるべきです(セットアップは 図1に示されています)。このトレーニング期間は、少なくとも2日間続く必要があります。動物が収容されている部屋のホームケージで行われます。
    1. すべてのゲートを閉じます。マイクロバランスから水筒と食品容器を取り除きます。
    2. ケージの上に計量済みの食品(50g)を置き、毎日の食品消費量を評価するために定期的なバランスを使用して、毎日その重量を文書化します。必要に応じて補充します。
    3. 透明な水でボトルを清掃し、約100mLの水で補充してください。ホッパーに戻します。
    4. 2番目のきれいなボトルに、作りたての1%スクロース溶液100mLを充填します。ホッパーの上に置きます。
      注:ボトルを注意深くマークし、その位置を文書化します(例えば、バランス1:水動物1、バランス2:スクロース溶液動物1)。
    5. すべてのゲートを開きます。監視システムでのトレーニングの開始を文書化します。ゲートを24時間開いたままにして、両方のボトルへの アドリビタム アクセスを行います。24時間後、ゲートを閉じてトレーニングの終了を記録します。24時間間隔のデータは、自動監視システムを使用して、 "開始時刻" と "終了時刻" を挿入することで評価できます。手順は、1時間のテスト間隔が評価されるときと同じです。
    6. ボトルは24時間ごとに清掃して補充してください。新鮮な1%スクロース溶液を毎日準備します。水とスクロース溶液ボトルの位置を毎日切り替えて、習慣効果を避けてください。
      注:優先比が1〜1に達するまで、すべての動物で少なくとも48時間の訓練を行います。ショ糖の好率は、トレーニング後に「データビューア」を使用して直接評価されます。これは、全体的な摂取量(水とスクロース摂取量)に対するスクロース摂取量の比率として計算されます。
    7. 試験の24時間前に、ラットが標準的なチャウと水のみにアクセスできるように、スクロース溶液でボトルを取り除きます。
    8. 水道水で満たされた新鮮なボトル1本と1%のスクロース溶液で満たされたものを、両方とも〜100 mLで準備します。
    9. テストを行う前に、すべてのゲートを閉じてください。
    10. ホッパーから水道水で満たされたボトルを取り出し、2つの新鮮なボトル(1本は水道水で満たし、もう1本は1%のスクロース溶液で満たされたもの)をホッパーに置きます。
    11. すべてのゲートを開き、監視システムでテストの開始を文書化します。ゲートは60分間開いたままにしておきます。60分後にゲートを閉じ、テストの終了を記録します。
    12. データを評価します(例えば、スクロース/総流体摂取量比)。
      注:テストは、トレーニングの間隔(少なくとも2日間)の間に数回繰り返すことができます。

3. 新規性誘発性低血圧検査の実施

  1. トレーニング期間の実施
    注: テストを行う前に、1 日 30 分のトレーニング期間を 5 日間お勧めします (セットアップは 図 2を参照してください)。目的は、実験の前に味わい深いスナック摂取量の安定したベースラインを達成することです。動物が収容されている部屋のホームケージで行われます。
    1. すべてのゲートを閉じて、標準的なチャウでホッパーを削除します。
    2. 新鮮なホッパーに味わい深いスナック(50g以上)を入れ替えます。クラッカーをホッパーに慎重に挿入して崩れないようにします。マイクロバランスの上にケージマウントにホッパーを置きます。
    3. ラットがスナックと水に アドリビタム にアクセスできるように、30分間ゲートを開きます。監視システムでのトレーニングの開始を文書化します。
      注:ラットは、トレーニング期間中に標準的なチャウにアクセスする必要はありません。
    4. 30分後にゲートを閉じ、監視システムでトレーニングの終了を記録します。スナックを標準的なチャウに置き換えます。
    5. 1)安定したベースラインの味わい深いスナック摂取量(例えば、1.5-2.0 g/30分)と2)の摂取量がトレーニング日数によって統計的に異ならないまで、これを毎日繰り返します。
  2. 新規性誘発性低血圧検査の実施
    1. 自動食品摂取監視システムに取り付けられた寝具や濃縮なしで、空の清潔なケージを準備します。水道水のボトルとホッパーとケージマウントに味わい深いスナックを置きます。
      注:新しいケージは、ラットが収容されているのと同じ部屋に置かれ、訓練を行う必要があります。ゲートを閉めておきなさい。
    2. ホームケージからラットを取り出し、新しいケージに入れます。
    3. すべてのゲートを30分間開きます。監視システムでのテストの開始を文書化します。
      注:スナックへのアクセスの30分の間に、スナック摂取量のサイズと基礎となる微細構造パラメータ(例えば、最初の食事への待ち時間)は、自動化された食物摂取監視システムを使用して記録されます。
    4. 30分後にゲートを閉じ、テスト終了を文書化します。ネズミをホームケージに戻します。
      注:テストは、トレーニングの間隔(少なくとも5日間)の間に数回繰り返すことができます。

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結果

データ分布をテストするために、コルモゴロフスミルノフ試験を使用した。T検定は、データが正規分布し、Mann-Whitney-Uテストが使用されていない場合に使用されました。一方向の分散分析と、Tukey後ホックテストの後に、正規分布の多重グループ比較に使用した。非正規分布の場合には、一方向の分散分析とダンの多重比較検定が使用されました。グループ間の違いは 、p < 0.05 の場合に有意であると考えられました。

SPTは、この研究でナイーブラットに対して行われた。スクロース溶液の消費量が増加し、水の摂取量はトレーニング期間中に減少しました (図 3)。トレーニング初日、ラットは24.40mL±3.48mLのスクロース溶液(図3A)、4.83mL±通常水0.89mL(図3B)を飲み、スクロースの好み比0.80±0.06(図3C)を得た。Fig...

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ディスカッション

スクロースの好みと新規性誘発性低phphagia検査は、ラットにおけるアンヘドニアを評価するための2つの確立された技術である。自動食品摂取監視システムとの組み合わせは、邪魔されないラットのより詳細な分析を可能にし、誤った測定を減らします。

エラーの発生率は、異なるアプローチによって減少します。まず、流出によるエラーに対処するために、フードホッパーとゲートの間のギャップは、かじり中に発生するパン粉が統合されたトレイに落ちるようにすることができます。ケージマウント上にこのこぼれを集めることによって、それらは測定に含まれる(こぼれはバランスに残っているので、測定に影響を与えない)。第二に、買いだめを防ぐために、ラットケージマウント開口部は、動物が開口部の中に頭を持つ食物ホッパーから食べることができるように十分な大きさですが、食べている間に動物が手を使用する能力を制限するのに十分小さいです。これは、食品を削除し、ケージにそれを持って来る能力を制限します。

第三に、システムは、プライミング後の液体ボトルが漏れ、蒸発が精密ステンレス鋼ボー...

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開示事項

A.S.はベルリン、ベーリンガー・インゲルハイム、武田、シュワベのコンサルタントです。利益相反はありません。

謝辞

この研究は、ドイツ研究財団(STE 1765/3-2)とシャリテ大学の資金援助(UFF 89/441-176、A.S.)の資金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アセンブリLHケージマウント - RAT-FOOD - ステンレス製ケージマウント、ホッパー、ブロッカー、カップリングを含むResearch Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABCMPRF01
アセンブリLHケージマウント アンプラグド - RAT - FOODには、ステンレス製ケージマウント、ホッパー、ブロッカー、アンプラグドアダプター、カップリングが含まれますResearch Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABCMUPRF01
ケージw / 2開口部 - RAT - costum修飾ケージ - ケージトップと標準ウォーターボトル研究ダイエット社、ジュールズレーン、ニューブランズウィック州、ニュージャージーBCR02シングルハウジング
データ収集ラップトップウィンドウズ- BioDAQソフトウェア研究ダイエット社、ジュールズレーン、ニューブランズウィック州、ニュージャージー州、米国BLT003
濃縮(プラスチックチューブ、かじる木材)動物施設
HoneyMaidグラハムクラッカークラムナビスコ、イーストハノーバー、ニュージャージー州、米国ASIN B01COWTA98:NIHテスト
低振動ポリマーラックResearch Diets、Inc.、Jules Lane、ニューブランズウィック、ニュージャージーBRACKR
オスのSprague DawleyラットEnvigo注文コード:002
モデル#2210 32xポートBioDAQセントラルコントローラー-ケーブルとキャリブレーションキットが含まれていますResearch Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABCC32_03
周辺機器センサーコントローラー - ケーブルを含むResearch Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABPSC01
SigmaStat 3.1Systat Software, San Jose, CA, USA統計分析
ステンレス鋼ブロッカーResearch Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABBLKR
10 kcal%の脂肪Research Diets、Inc.、Jules Lane、ニューブランズウィック州ニュージャージー州、米国D12450B
SPT用のスクロース粉末Roth4621.1
州、米国によって配布された州、米国を含む標準的なげっ歯類の食事療法

参考文献

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