このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

水/空気界面で疎水性有機分子をドープしたハイブリッド脂質膜の自己集合

3.5K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/60957

⸱

2020年5月1日

 ,  ,  , 
1Research Institute of Electrical Communication, Tohoku University, 2Advanced Institute for Materials Research, Tohoku University

この記事について

サマリー

我々は、脂質二重層を銅(II)2,9,16,23-テトラ-tert-ブチル-29H,31H-フタロシアニン(CuPc)分子でドーピングすることにより、水/空気界でハイブリッド脂質膜を産生するためのプロトコルを報告する。得られたハイブリッド脂質膜は、脂質/CuPc/脂質サンドイッチ構造を有する。このプロトコルは、他の機能性ナノ材料の形成にも適用することができる。

要約

極薄な厚さ(3-4 nm)、超高抵抗、流動性、自己集合性などの特性により、脂質二重層は容易に機能し、バイオセンサーやバイオデバイスなどの様々な用途に使用されています。本研究では、銅(II)2,9,16,23-テトラ-タートブチル-29H,31H-フタロシアニン(CuPc)を導入し、脂質膜をドープする平面有機分子を導入しました。CuPc/脂質ハイブリッド膜は自己組立によって水/空気インターフェイスで形成される。この膜では、疎水性CuPc分子は脂質分子の疎水性の尾の間に位置し、脂質/CuPc/脂質サンドイッチ構造を形成する。興味深いことに、空気安定型ハイブリッド脂質二重層は、ハイブリッド膜をSi基板上に移すことによって容易に形成することができる。ナノ材料を脂質二重層系に組み込む方法を簡単に報告し、バイオセンサーやバイオデバイスの製造に関する新しい方法論を示す。

概要

細胞膜の不可欠なフレームワークとして、細胞の内部は脂質二重層システムによって外装から分離される。このシステムは、親水性リン脂質から構成され、親水性リンエステル「ヘッド」と疎水性脂肪酸「尾」で構成されています。水性環境における脂質二重層の流動性と自己集合性が顕著に原因で、1,2、人工脂質二重層は、簡単な方法3、4を用いて形成することができる。イオンチャネル、膜受容体および酵素などの様々なタイプの膜タンパク質が人工脂質二重層に組み込まれ、細胞膜5,6の機能を模倣・研究している。最近では、脂質二重層がナノ材料(例えば、金属ナノ粒子、グラフェン、およびカーボンナノチューブ)を用いて、機能性ハイブリッド膜7、8、9、10、11、12、13を形成している。このようなハイブリッド膜を形成するために広く使用されている方法は、改変されたAuナノ粒子7またはカーボンナノチューブ11などの疎水性物質を含むドープ脂質小胞の形成を含み、その後、得られた小胞を平板支持脂質二重層に融合させる。しかし、このアプローチは複雑で時間がかかり、ハイブリッド膜の潜在的な用途は制限されます。

この研究では、脂質膜を有機分子でドープし、自己集合によって水/空気界面で形成されるハイブリッド脂質膜を作製した。このプロトコルには、混合溶液の調製、水/空気界面でのハイブリッド膜の形成、および膜をSi基板に伝達する3つのステップが含まれます。以前に報告された他のメソッドと比較すると、ここで説明する方法は単純であり、洗練されたインストルメンテーションを必要としません。この方法を用いると、より大きな面積を有する空気安定型ハイブリッド脂質膜を、より短時間で形成することができる。本研究で用いられるナノ材料は、半導体有機分子である銅(II)2,9,16,23-テトラ・テルトブチル-29H,31H-フタロシアニン(CuPc)であり、太陽電池、光検出器、ガスセンサーおよび触媒14を含む多くの用途で広く使用されている。CuPcは、平面構造を有する小有機分子であり、その疎水性特性に対するリン脂質デュオの「尾」に対する高い親和性を有する。他のグループは、CuPc分子が高度に順序付けられた構造16、17の形成と単結晶表面上で自己集合できることを報告している。したがって、CuPc分子が自己集合を通じて脂質二重層に組み込まれる可能性が高い。

膜形成に用いる手順の詳細な説明を提供し、この手順を円滑に実施するための提案を提供する。また、ハイブリッド脂質膜の提示結果を提示し、この方法の潜在的な応用について考察する。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. ハイブリッドソリューションの調製

  1. 4 mL の使い捨てガラスバイアルとスクリューキャップ(PTFE コーティングシール付き)を、蒸留水(ろ過システムで精製)で 10 分間超音波浴に洗浄し、次にエタノールとクロロホルムを洗います。ガラスバイアルとキャップを窒素ガスの流れで乾燥させます。
  2. 嫌気性グローブボックスで、粉末状のCuPcをクロロホルムに溶解して、洗浄ガラスバイアルにCuPcストック溶液(10mg/mL)を調製します。
  3. CuPc溶液を0.2 μmのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜でフィルター処理します。
  4. ろ過した溶液を窒素で満たされた洗浄ガラスバイアルに保管し、バイアルをパラフィルムで密封します。
  5. 購入した1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC)クロロホルム溶液(25mg/mL)を-80°C冷蔵庫から取り出し、室温まで温めます。
  6. 2300 rpmで10 sの場合は、ボルテックスミキサーを使用してDPhPC溶液を攪拌します。
  7. クロロホルムでガラスマイクロ注射器を5回リンスします。
  8. DPhPCクロロホルム溶液200μLを洗浄したシリンジを使用して、あらかじめ洗浄されたガラスバイアルに移します。窒素の穏やかな流れとバイアル内の溶媒を蒸発させます。
  9. クロロホルムでガラスマイクロシリンジを5回リンスします。
  10. 洗浄したシリンジを使用して、DPhPCでガラスバイアルに202.6 μLのクロロホルムを追加します。
  11. 47.4 μLのろ過済10 mg/mL CuPc溶液をDPhPC溶液に加えます。CuPc に対する DPhPC のモル比は 10:1 である必要があります。
  12. クロロホルムでガラスマイクロシリンジを5回リンスします。
  13. 250 μL のヘキサンをシリンジを使用して溶液に加えます。溶液の最終濃度は10mg/mLでなければなりません。
  14. 2300 rpmで10sのボルテックスミキサーを使用して調製した溶液を混合する。
  15. CuPc溶液を0.2 μmのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜でフィルター処理します。
  16. ガラスバイアルをパラフィルムで密封します。窒素を入れたグリップ密封袋に入れ、グリップ密封袋を-20°Cの冷凍庫に入れます。
    注:ステップ1.13の後、DPhPCとCuPcを混合溶媒に溶解し、クロロホルムとヘキサン(体積比1:1)で構成しました。また、CuPcに対するDPhPCのモル比は10:1に限定されない。脂質の一定濃度(10 mg/mL)を使用すると、異なるモル比を使用することができます。これまでの実験結果によれば、高品質のハイブリッド脂質膜を形成するためには10:1~3:1の範囲が好ましい。

2. 水/空気界面でのハイブリッド膜の形成

  1. SiウエハーからSi基板(3cm x 3cm)をカットします。
  2. 精製水で10分間超音波浴中の3cm x 3cm Si基板を洗浄し、エタノールとクロロホルムを続けます。表面から吸着した有機材料を除去し、親水性を改善するために5分間、O2 プラズマでSi基板を処理します。
  3. 内径7.5cmのテフロンビーカーを、精製水を3分間流して洗います。
  4. 洗浄されたSi基板を洗浄されたPTFEビーカーに入れます。基板は水平に30°の角度で傾いています。
  5. Si基板全体が水没するまで、十分な量の精製水をテフロンビーカーに注ぎます。
  6. 準備したハイブリッド溶液を冷凍庫から取り出し、室温まで温めます。
  7. 2300 rpmで15sの渦ミキサーを使用してハイブリッド溶液を攪拌します。
  8. クロロホルムでガラスマイクロシリンジ(50μL)を5回リンスします。
  9. 3~5 μLのハイブリッド溶液を水面に滴下し、シリンジを使用して浮遊ハイブリッド脂質膜を形成します。
    注:溶液を落とすときは、水面に近い(1cm未満)液滴を保持することが重要です。また、単層ハイブリッド膜は肉眼では見えないが、多層ハイブリッド膜は薄く青色の膜として現れる。多層ハイブリッド膜をSi基板に転移させるためには、混合溶液をなるべくSi基材に近づけることが重要である。

3. 膜をSi基板に移す

  1. 有機溶媒の蒸発後(2秒未満で)、ペリスタチックポンプで駆動されるゴムチューブを通して水を送り出して水位を3mm/minの速度で下げ、浮遊ハイブリッド膜をSi基板に移します。
  2. 移送プロセスが完了したら(約5分)、Si基板をクリーンルームワイパーの上に置き、残留水のすべてを蒸発させます。
    注:このような低い速度で水位を下げることは、水の乱流を最小限に抑え、膜を保護するのに役立ちます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

この形成された膜はCuPc分子の存在により均一な水色を有する。着色膜の面積は、通常、数平方センチメートルです。 図1A および 図1Bにおいて、Si基板上のハイブリッド脂質膜の顕微鏡像及び原子間力顕微鏡(AFM)像(高さプロファイルを含む)を示す。AFM画像では、左上の膜は厚く、厚さは79.4nmで、右下は薄く、厚さは4.9nmです。薄膜は、洗浄されたSi基材の表面粗さを示すRa=0.4nmの表面粗さを示す。さらに、複数の測定値に基づいて、膜厚は5nmインクリメント18の離散分布を示す。報告されたDPhPC脂質二重層膜の厚さは約4nm19であるため、5nmの薄膜はCuPcドープ脂質二重層膜であり、厚い膜はドープ脂質二重層のスタックで構成されていると結論付けることができる。

エネルギー分散型X線(EDX)分析を用いて、Si基質上のハイブリッド膜の組成をさらに調べた。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

ハイブリッド膜の前駆体溶液では、純粋なクロロホルムではなく混合有機溶媒(クロロホルムとヘキサン)を用いて脂質とCuPcを溶解する。純粋なクロロホルムを使用する場合、前駆体溶液の密度は水よりも高くなります。そのため、水面に広がるのではなく、水の底に沈む可能性が高いです。前駆体溶液に低密度溶媒であるヘキサンを添加すると、溶液が水面に浮遊し、溶媒の蒸発後に均一なハイブリッド膜を形成することが保証されます。また、溶液が水面に接触した直後に、膜の広がりや有機溶媒による表面波が常に観測され、水の表面張力が変化する可能性もあることにも留意すべきである。ハイブリッド膜は極めて薄く壊れやすいので、小さな乱れは目に見える亀裂が形成されている膜の無傷性を損なうであろう。そのため、さらなる損傷を防ぐためには、膜の周りの気流を最小限に抑え、ハイブリッド膜の形成後の水の振動を避けることは非常に重要です。可能であれば、テフロンビーカーは振動分離テーブルの上に置く必要があります。

よく確立されたLangmuir-Blodgett(LB)法は、疎水性の尾部が空気に向いている間、脂質の親水性頭部が水に向いている水/空...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

本研究は、日本科学技術庁のCRESTプログラム(JPMJCR14F3)と日本科学振興会の助成(19H00846、18K14120)によって支援されました。この研究の一部は東北大学電気通信研究所ナノエレクトロニクス・スピントロニクス研究所で行われました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
クロロホルム和光 化学薬品033-08631
CuPcSigma-Aldrich423165
DPhPcAvanti Polar Lipids850356C
スクリューキャップ付きガラスバイアル日電理硝子有限公司6-29801
ヘキサン和光 化学薬品084-03421
メンブレンフィルターMerck Millipore Ltd.
シリンジハミルトン80530
蠕動ポンプ東京理垣会
ボルテックスミキサーサイエンティフィック・インダストリーズ・インクSI-0286
R8CA42836マイクロ11914199

参考文献

  1. Israelachvili, J. N., Mitchell, D. J., Ninham, B. W. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 470 (2), 185-201 (1977).
  2. Venable, R. M., Zhang, Y., Hardy, B. J., Pastor, R. W. Molecular dynamics simulations of a lipid bilayer and of hexadecane: an investigation of membrane fluidity. Science. 262 (5131), 223-226 (1993).
  3. Ide, T., Ichikawa, T. A novel method for artificial lipid-bilayer formation. Biosensors and Bioelectronics. 21 (4), 672-677 (2005).
  4. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  5. Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
  6. Demarche, S., Sugihara, K., Zambelli, T., Tiefenauer, L., Voros, J. Techniques for recording reconstituted ion channels. Analyst. 136 (6), 1077-1089 (2011).
  7. Sakaguchi, N., Kimura, Y., Hirano-Iwata, A., Ogino, T. Fabrication of Au-nanoparticle-embedded lipid bilayer membranes supported on solid substrates. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (17), 4474-4481 (2017).
  8. Schulz, M., Olubummo, A., Binder, W. H. Beyond the lipid bilayer: interaction of polymers and nanoparticles with membranes. Soft Matter. 8 (18), 4849-4864 (2012).
  9. Wang, J., Wei, Y., Shi, X., Gao, H. Cellular entry of graphene nanosheets: the role of thickness, oxidation and surface adsorption. RSC Advances. 3 (36), 15776-15782 (2013).
  10. Vögele, M., Köfinger, J., Hummer, G. Molecular dynamics simulations of carbon nanotube porins in lipid bilayers. Faraday Discussions. 209, 341-358 (2018).
  11. Kanomata, K., Deguchi, T., Ma, T., Haseyama, T., Miura, M., Yamaura, D., Tadaki, D., Niwano, M., Hirano-Iwata, A., Hirose, F. Photomodulation of electrical conductivity of a PCBM-doped free-standing lipid bilayer in buffer solution. Journal of Electroanalytical Chemistry. 832, 55-58 (2019).
  12. Barnoud, J., Rossi, G., Monticelli, L. Lipid Membranes as Solvents for Carbon Nanoparticles. Physical Review Letters. 112, 068102(2014).
  13. Dichello, G. A., et al. Preparation of liposomes containing small gold nanoparticles using electrostatic interactions. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 105, 55-63 (2017).
  14. Sullivan, P., Heutz, S., Schultes, S. M., Jones, T. S. Influence of codeposition on the performance of CuPc−C60 heterojunction photovoltaic devices. Applied Physics Letters. 84 (7), 1210-1212 (2004).
  15. Miyata, T., Kawaguchi, S., Ishii, M., Minami, T. High sensitivity chlorine gas sensors using Cu−phthalocyanine thin films. Thin Solid Films. 425 (1-2), 255-259 (2003).
  16. Barrena, E., de Oteyza, D. G., Dosch, H., Wakayama, Y. 2D supramolecular self-assembly of binary organic monolayers. ChemPhysChem. 8 (13), 1915-1918 (2007).
  17. Xiao, K., et al. Surface-induced orientation control of CuPc molecules for the epitaxial growth of highly ordered organic crystals on graphene. Journal of the American Chemical Society. 135 (9), 3680-3687 (2013).
  18. Feng, X., Ma, T., Yamaura, D., Tadaki, D., Hirano-Iwata, A. Formation and characterization of air-stable lipid bilayer membranes incorporated with phthalocyanine molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6515-6520 (2019).
  19. Wu, Y., He, K., Ludtke, S. J., Huang, H. W. X-ray diffraction study of lipid bilayer membranes interacting with amphiphilic helical peptides: diphytanoyl phosphatidylcholine with alamethicin at low concentrations. Biophysical Journal. 68 (6), 2361-2369 (1995).
  20. Zaitseva, S. V., Bettini, S., Valli, L., Kolker, A. M., Borovkov, N. Y. Atypical film-forming behavior of soluble tetra-3-nitro-substituted copper phthalocyanine. ChemPhysChem. 20 (3), 422-428 (2019).
  21. Ghani, F., Gojzewski, H., Riegler, H. Nucleation and growth of copper phthalocyanine aggregates deposited from solution on planar surfaces. Applied Surface Science. 351, 969-976 (2015).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

さらに記事を探す

自己組織化プロセス銅フタロシアニン脂質二重層システム共焦点顕微鏡法原子間力顕微鏡法エネルギー分散型X線分析シリコン基板転写バイオセンサ作製
水/空気界面で疎水性有機分子をドープしたハイブリッド脂質膜の自己集合
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。