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Summary

このプロトコルの目的は、ショウジョウバエの精細細胞を用いた細胞顕微鏡と固定細胞顕微鏡法により、無傷組織における細胞分裂を解析することである。このプロトコルは、ショウジョウバエ幼虫と初期の子犬から全体の無傷の精巣を分離する方法と、顕微鏡検査のためにそれらを処理し、マウントする方法を示しています。

Abstract

細胞分裂が発達、組織恒常性、疾患プロセスとどのように統合されているかを理解するには、生きている、無傷の組織および器官で分裂する細胞の実験的分析が不可欠である。梅毒を受けているショウジョウバエ精子細胞は、(1)精子細胞を含むショウジョウバエ精巣全体が顕微鏡の準備が比較的容易であり、(2)精子細胞の大きなサイズは高解像度イメージングに適しており、(3)強力なショウジョフィラ遺伝ツールを生体内分析と統合することができるため、この分析に最適です。ここでは、ショウジョウバエ第3インスター幼虫および早期の子犬からの精巣全体の調製のための容易にアクセス可能なプロトコルを提示する。精巣全体で大腸精子細胞を同定する方法と、タイムラプス顕微鏡で生きている様子を画像化する方法について説明する。また、精巣全体の固定および免疫染色のためのプロトコルも提供される。幼虫精巣の使用は、精子細胞分析のために成人精巣を使用する利用可能なプロトコルよりもいくつかの利点があります。最も重要なことは、幼虫精巣は成人精巣よりも小さく、細胞で混雑が少なく、これは精子細胞の高解像度イメージングを大幅に促進する。これらの利点およびプロトコルの応用を実証するために、時間経過共焦点顕微鏡で画像化された単一の精子細胞における細胞分裂中の紡錘微小管に対する小胞細管の再分配を示す結果を提示する。このプロトコルは、蛍光タグ付きタンパク質やオルガネラマーカー、遺伝子変異、その他の遺伝的ツールの発現と組み合わせることで、組織および器官全体の生理学的文脈における細胞分裂機構の分析に特に強力です。

Introduction

細胞分裂は、培養1で増殖した細胞株を用いて研究されることが多^い。これらの研究²から、我々は、これらの研究から、基本的なメカニズムの豊富な洞察力と理解を得ているが、培養で成長した細胞は、それが無傷の、生体組織で起こる細胞分裂の生理学を完全に再現することはできません。例えば、無傷の組織や臓器では、細胞は、子孫細胞が組織内に適切に位置するように適切な場所と適切なタイミングで分裂しなければならず、適切な分化または機能的プログラムを受けることができ、細胞増殖が組織の成長または恒常性³と適切に調整されるようにする。一方、培養で増殖した細胞については、細胞分裂は一般に培地⁴の成長因子によって調節されるため、生体内の環境因子(組織アーキテクチャや発育シグナル伝達など)が分裂過程にどのような影響を与えるかをこれらの細胞から学ぶことはできない。また、HeLaやU2OS細胞などの細胞分裂を研究するために使用される細胞株の多くは、転移性腫瘍⁵に由来していたことに注意することも重要である。したがって、これらの癌細胞の基礎生理学の多くの側面は、細胞周期調節機構および染色体安定性など、健康な細胞と比較して改変された可能性が高い。したがって、細胞分裂生理学の完全な理解は、生理学的調節機構および組織アーキテクチャを維持する生体環境における分裂細胞を研究する能力に依存する。

細胞分裂が無傷の組織や臓器内でどのように機能するかを理解する上での進歩は、生体内またはエクスビボ分析に固有の困難によって妨げられます。まず、大きな臓器や厚い組織内の顕微鏡分析のために分割細胞にアクセスすることは困難または不可能です。第二に、個々の細胞が生体内でいつ分裂するかを予測することはしばしば困難である。第3に、組織生理学は、元の生体培養中に急速に悪化する可能性がある。このプロトコルでは、完全に無傷の精巣内で細胞分裂を受けるショウジョウバエメラノガスター精子細胞の生きた固定分析のための容易にアクセス可能な方法について説明する。これらの細胞は、共焦点顕微鏡などの標準的な光学方法で容易にアクセス可能であり、予測可能な時間と場所で分裂し、無傷の精巣を約24時間までex vivo培養で維持できるため、生きているex vivo分析に最適です。さらに、ショウジョウバエ精子細胞は、分裂しても形が変わらない大きな丸い細胞(直径約20~30μm)であり、スピンドル装置や細胞質小器官などの細胞成分の高解像度、タイムラプスイメージングに最適です。これらの細胞は有糸分裂とは対照的に分裂を起こしますが、必須の細胞分裂プロセスの多くは、これら2つの細胞分裂機構⁶の間で非常に類似しています。これらの利点は、強力なショウジョウバエの遺伝的ツールと組み合わせることで、ショウジョウバエ精子細胞を紡錘形成および調節、サイトカネシス、および小器官改修および仕切り^{77、8、9、10、118,9,10,}を含む必須細胞分裂プロセスのex vivo分析のために広く使用されるモデルにした。¹¹

精子細胞は、精子形成の大精期にある細胞である。ショウジョウバエでは、精巣^12,13,の1極に小さな領域または「ハブ」に位置する生殖細胞幹細胞群から精子形成が始^まる。これらの細胞は非対称の有糸分裂によって分裂し、単一の分化された精子を生じさせる。精子は、その後、単一の嚢胞内に密接に関連付けられたままの16個の細胞のグループを生成するために4つの同期マイトースを受ける。この段階では、細胞は有糸分裂性から大細胞周期に移行し、精子細胞と呼ばれる。精子細胞は、細胞周期の拡張G2段階で約2〜3日間を過ごし、その間に劇的に成長し、2つの細分分裂とその後の精子形成^13、14,14に対する準備において細胞学的変化を受ける。単一の嚢胞内の16個の精子細胞のグループ全体が同時に最初の大腸分裂に入る。したがって、いくつかのメオティック精子細胞は、細胞分裂を進める間同時に画像化することができる。最初の大腸分裂は約1.5時間進行し、ほぼ即座に第2の大腸分裂が続き、成熟した精子に分化するために進む64の総精子が得られる。

精子細胞を使用して生きている無傷の組織で細胞分裂を研究するユニークな利点は、細胞のグループまたは嚢胞が精子形成の異なる段階を経て絶えず進行し、精子形成のすべての段階の細胞が通常任意の精巣で同定できることである(図3Aを参照)。したがって、精巣全体で大腸細胞を見つけることは比較的容易である。これらの細胞ははるかに大きく、高解像度イメージングに適しているため、第2の除細症とは対照的に、一般的に最初の分析に焦点を当てていますが、両方のmeiotic部門を含むプロセス全体を正常にイメージングすることができます。また、精巣の準備および培養のための一般的なプロトコルは、精子形成の他のプロセスを分析するためにも使用することができることに留意すべきである。¹⁵精子形成のこれらの側面の多くは、ショウジョウバエとヒト¹⁶の間で高度に保存されている。

ショウジョウバエ精子細胞は、ショウジョウバエ開発¹³の第3のインスター幼虫段階の間に精子形成のmeiotic段階に達し始める。したがって、第3のインスター幼虫から始まり、子犬と成人を含むライフサイクル段階から分離された精巣を、精子細胞の分裂の分析に使用することができる。いくつかの優れたプロトコルは、精子形成^{17、18、19,18,19}の生きている、固定分析のために、成人男性ハエからの精巣の抽出のために利用可能である。これらのプロトコルは、精子形成の後期段階を研究するために好ましいかもしれないか、または成人にのみ目に見える遺伝マーカーを使用しなければならない場合。これらの段階での精巣は、高解像度、タイムラプス顕微鏡による細胞分裂解析に特に関連するいくつかの利点を有するため、このプロトコルは、幼虫および早期の子犬からの精巣調製に焦点を当てる。まず、幼虫や子犬の精巣は成人の精巣よりも小さく、臓器内の細胞は混雑が少ない。このため、精子を分割することは、多くの場合、光散乱組織の複数の層を貫通することなく、幼虫精巣の外表面の近くで画像化することができます。第二に、成体精巣は付属の付属器官の収縮のためにリズミカルに動き、これらの動きは個々の細胞のタイムラプスイメージングを困難にする。第三に、幼虫精巣は、プパルまたは成人の致死を引き起こす遺伝子変異を研究する際に有利である。我々の方法は、顕微鏡段階で精巣の長期培養のために最適化され、同じ調製物中の精子形成の複数段階を通して細胞分裂の複数のラウンドまたは個々の細胞の進行のイメージングを可能にする。また、精巣全体の固定および免疫染色のためのプロトコルについても述べている。全体として、私たちのプロトコルは、無傷の組織における細胞分裂を研究することに興味がある人にとって特に有用であり、精子細胞分析と非常に難解なショウジョウバエ遺伝ツールを組み合わせる能力は、これを特に強力なアプローチにします。

Protocol

1. 動物、道具、メディアの解剖の準備 オスとメスのハエを交配して、所望の遺伝子型の子孫を得る。大腸精子細胞の同定およびステージングに有用なトランスジェニックマーカーは、クロムソーム8を標識するMeioticスピンドルおよびRFPヒストン2Aにラベルを付けるGFP-tubulinを含む。十字架あたり5〜10人のメスを使用し、3番目のインスター幼虫がバイアルの側面を這い上がり始めるまで、25°Cインキュベーターでバイアルで標準的なフライフードの十字架を維持します(4-5日)。初期の白い子犬は1日後に形成され始めます。 細かい先端を持つストレート鉗子の2組を得る。先端が鋭く、長さでもまっすぐであることを確認します(図1A)。これらの鉗子は、ディスセクションにのみ使用し、使用しない場合は10 μLピペットチップをキャップします。 メスツールを準備します。 黒い陽極酸化鋼の昆虫ピンの鈍い端をピンホルダーに挿入し、ホルダーのネジをねじってピンを所定の位置に固定します。一対の鉗子を用いて、解剖顕微鏡の下で、昆虫のピンを真ん中に持ち、それを曲げて135°の内部角度を形成する(図1B)。鋭い端はティッシュを切る、端は媒体の滴間のテストを移すのために使用される。 使用しない場合は1,000 μLピペットチップをキャップします。 組織培養フードで作業し、シュナイダーの培地の5 mLアリコートを準備し、使用時まで4°Cで保管してください。分節を開始する準備ができたら、1つの5 mLメディアアリコートを室温に温めます。その後、温めた解剖培地を10 mLのシリンジに移し、0.22 μmのシリンジフィルターを取り付けます。 2. 幼虫と早期の子犬からの精巣の解剖 メディア充填フィルタシリンジを使用して、ガラススライドの上部、中央、下部に3滴のメディア(それぞれ50 μL)を排出します。 解剖プローブを使用して、5〜10分の3番目のインスター幼虫または早期の子犬(まだ白または黄色の子犬)をトップドロップに移します。解剖プローブでメディアの幼虫と子犬を軽く攪拌し、食べ物や破片を取り除きます。 解剖顕微鏡の下で、解剖プローブで単一の幼虫または子犬を横に回し、身体の後部3分の1に楕円形の半透明構造として現れる2つの両側精巣が存在する場合、それを同定する(図2A,B)。精巣を欠いている動物はメスであり、捨てるべきです。 雄の幼虫や子犬が見つかり、清潔になったら、メディアの2番目のドロップに移動します。3または4人の男性の幼虫および/または子犬がメディアの2番目の滴に移されるまで繰り返します。 メディアの2番目のドロップで作業し、精巣の前に、その中間領域で鉗子のペアで単一の男性の幼虫または子犬をつかみます。2番目の鉗子を使用して、動物を半分に優しく引き裂きます。 幼虫または子犬の後端を鉗子でガラススライドに押し下げます。鉗子のすぐ隣から、メスツールの端を使用してキューティクルを押し下げ、メスを動物のカットエンドに向かって動かします。これは、腸、脂肪体、精巣を含む動物の内臓を追放します。 精巣を残りの器官からそっといじめる。精巣は、脂肪体のリボンに埋め込まれた楕円形の器官(図2C)である。 一度に1つずつ、3番目のメディアにテストを転送します。これを達成するには、脂肪体の下にメスの縁を挿入し、メディアから組織を持ち上げ、そしてすぐに3番目のドロップに移動します。 あるいは、精巣に十分な脂肪体が付着していない場合は、組織を正常に持ち上げるのに成功し、解剖培地で予め濡れたガラスパスツールピペットを用いて組織を穏やかに移送する。 メスツールの鋭い端を使用して、余分な脂肪体を精巣からそっとスライスし、脂肪の体の小さな縁を端の周りに残します(図2C)。脂肪の体のすべてを削除する必要はありません, そうしようとすることは、おそらく精巣の損傷や破裂につながるだろう. ガラススライド上のすべての雄の幼虫に対して上記の手順を繰り返します。 ステップ 3 またはステップ 5 に進みます。 3. ライブ顕微鏡イメージング用のテストの取り付け 注:この取り付け手順は、ショウジョウバエ・幼虫脳神経芽細胞20のイメージング用の最近公表されたプロトコルから適応された。このリファレンスでは、その他の詳細を参照してください。 フィルターシリンジを使用して、シュナイダーのメディア(約30 μL)を50mmのガス透過培養皿の中央に一滴入れます。 事前に湿ったパスツールピペットを使用して、準備された精巣をガス透過性皿のドロップに移します。精巣は一般に、落下の表面に浮動します。 メスツールを使用して、精巣をガス透過膜に静かに押し下げます。メスの鋭利な点で気体透過膜を破裂させないように注意してください。すべての精巣をドロップの中心に押し出します。 ハロカーボンオイルを充填した1 mLのシリンジを使用して、ガス透過膜に4滴(それぞれ約30 μL)の油を作ります。22 mmガラスカバースリップの四隅に対応するように、精巣を含むメディアの滴の周りに油の滴をスペースします。 22mmガラスカバースリップの角を4滴のハロカーボンオイルで並べ、カバースリップをメディアとオイルにそっと下げます。カバースリップが落ち着き、精巣を含むメディアが油滴の間に広がるようにします。 余分なメディアを取り除き、カバースリップを精巣の表面に落ち着かせる。解剖顕微鏡で精巣を観察しながら、繊細なタスクワイプのコーナーをカバースリップの下のメディアに挿入して、少量の液体を吸い取ります。ガラスカバースリップが最大の精巣の表面に接触するまで、十分なメディアを離れてウィック。これは精巣に圧力がかかり、破裂する原因となるので、あまりにも多くのメディアを取り外してカバースリップを下げすぎないようにすることが重要です(図5参照)。 4. 大精精子細胞の生撮像 注:精子細胞は、レーザースキャンまたは回転ディスク共焦点顕微鏡を使用して画像化することができる。システムは、蛍光タンパク質の光の切り落としや組織の光損傷を避けるために、十分な速度と感度を持っている必要があります。 精巣のすぐ上のガラスカバースリップに浸漬油を一滴置きます。皿の上にひっくり返して顕微鏡のステージに置き、顕微鏡の目的(40xまたは60x)を精巣のすぐ下に置くまでオイルに移します。透過光を使用して単一の精巣を見つけ、焦点を当てます。 共焦点で高速画像をキャプチャしながら、細胞の組織を調べるためにテストを動かします。精巣の一端は、多くの小さな、密に詰まった細胞を有するであろう。この末端には生殖細胞幹細胞と精子が含まれています。器官の反対側に向かって移動し、離散クラスターまたは嚢胞に組織された徐々に大きな細胞を同定する。これらの大きな細胞は精子細胞である(図3A)。 GFP-tubulinをイメージングする場合、細胞の皮質に位置する2つの明るい微小管アスター(すなわち、セントロソーム)の存在によって30〜60分以内に明治を開始する精子を同定する(図3B,C)。 大腸精子細胞の嚢胞が同定されたら、時間の経過とともに画像のZスタックをキャプチャするための取得パラメータを設定します。通常、Z次元で1.5μm離れた15〜20個の画像を取得すると、同じ嚢胞内の複数の精子細胞の全容を捕捉するのに十分である。 最初の細分化部全体をイメージングする場合は、2分ごとに完全なzスタックを取得します( 約1.5時間かかります)。特に特定の減気事象のみを分析する場合は、より速い取得率を使用することができます。ただし、試料をレーザー励起に繰り返し露光することによる光の漂白や光損傷を引き起こさないので注意してください。 連続的な自動焦点制御システムを使用して、長い時間の取得過程での焦点ドリフトを防ぎます。顕微鏡ステージ上の試料の温度制御は、一般的に、約22〜23°Cの室温を想定して、必要ではありません。温度制御が可能な場合は、顕微鏡ステージ上で25°Cに保存してください。 大動脈精子細胞が見つからない場合は、サンプルを25°Cインキュベーターに数時間または一晩保存し、再度画像を保存します。 5. 固定および免疫染色 上記のステップ2.10から、ガラスパスツールピペットを使用して、PBSTx中の8%パラホルムアルデヒドの0.5mLを含む9ウェルガラス解剖皿の井戸に精巣を移す(0.3%トリトンX-100のリン酸緩衝生理食塩水)。精巣が皿の底に置かれていることを確認します。注:パラホルムアルデヒドは有毒であり、ヒュームフードの手袋で扱う必要があります。 室温で20分間精巣を固定します。 0.5 mL PBSTxを含むウェルに精巣を移し、穏やかな攪拌で5分間洗浄します。新鮮なPBSTxでさらに2回、新しい井戸で洗浄ステップを繰り返します。 1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに5%のウシ血清アルブミン(BSA)を含む0.5 mL PBSTxで所望の濃度に一次抗体を希釈した。9ウェルガラス解剖皿から希釈された一次抗体のチューブに試験を移し、穏やかなロッキングまたはヌクテーションで4°Cで一晩インキュベートします。 9ウェルガラス解剖皿の井戸で5分間PBSTxの0.5 mLで精巣を洗います。新鮮なPBSTxでさらに2回洗浄ステップを繰り返します。 250 μL の PBSTx に 250 μL の 2 次抗体を 5% BSA を含み、9 ウェルガラスの解剖皿のクリーンウェルに分配します。必要に応じて、DAPIを添加してDNAを染色します。二次抗体を含むウェルに精巣を移し、ラップで覆い、室温で4時間穏やかな攪拌で暗闇の中でインキュベートする。 精巣を0.5 mLのPBSTxで満たされたきれいな井戸に移し、新鮮なPBSTxを5分間2回、30分間3回目洗います。 6. 固定テストの取り付け 最後の洗浄からパスツールピペットを使用してガラス顕微鏡スライドに精巣を移します。必要に応じて、メスツールのエッジを使用して、精巣をスライドの表面に押し下げます。 精巣から余分な液体を吸い取るために繊細なタスクワイプのコーナーを使用してください。できるだけ多くの液体を取り除きます。 30~50 μLの顕微鏡実装媒体を精巣に塗布します。 22 mm のカバースリップを取り付け媒体のドロップに置き、カバースリップを落ち着かせ、取り付け媒体をカバースリップの下に広げます。必要に応じてカバースリップに穏やかな圧力をかけ、余分な取り付け媒体を絞り出し、カバースリップを精巣の表面に置きます。 マニキュアを使用してカバースリップの端を密封します。

Representative Results

このプロトコルが正常に実行されると、精巣は共焦点顕微鏡または他の蛍光顕微鏡法によるイメージングのために完全に無傷のままです。図3Aに示すように、精巣の細胞組織は保存され、精巣の一端から精子、精子、およびハプロイド精子を含む他の端への細胞分化の進行が見える。GFP-tubulinは、分裂する精子を同定し、そして、細胞のマイオシスを通して細胞の進行の…

Discussion

我々は、精子細胞分裂の長期的な、生画像化のために最適化された幼虫または初期の小児性ショウジョウバエ精巣の調製のためのプロトコルを説明した。これは、無傷の組織の生理的文脈における細胞分裂の分析のための強力な方法である。この方法のパワーは、特定の遺伝子変異、組織特異的RNAi媒介抑制、および蛍光標識タンパク質およびオルガネラマーカーなどのショウジョ?…

Materials

5" Dissecting Probe	Fisher	08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet	Fisher	13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9703-100
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides	Fisher	12-544-2	Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100 mL
Lumox Dish 50	Sarstedt	SAR946077410	Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass	Fisher	12-541-B	22×22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-15	Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade	Electron Microsocopy Sciences	15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides	Fisher	12-549-5	Slides used for dissections
PYREX Spot Plates	Fisher	13-748B	9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium	Fisher	21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm	EMD Millipore	SLGS033SB
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Microscopy mounting medium