凝集による水サンプルからの環境DNA(eDNA)の捕捉

サマリー

環境DNA(eDNA)は、通常、アルコール沈殿、ろ過、または凝集法を使用して水サンプルから捕捉されます。ここでは、塩化ランタンを使用して、真核細胞、原核細胞、およびウイルスを含む水サンプルから溶存核酸および粒子状結合核酸を収集できるようにする代替プロトコルを示します。

要約

環境DNA(eDNA)の分析は、種管理における問題解決に広く使用されているアプローチとなっています。侵入種や危険にさらされている種を含む謎の種を検出することが目標であり、通常は水と堆積物に特徴的なDNAシグネチャが存在するかどうかをテストすることによって達成されます。eDNAの捕捉には、信頼性と効率性に優れた手順が必要であり、特に、限られた訓練を受けた人員や市民科学者が現場で簡単に実行できる手順が必要です。メンブレンフィルトレーションを用いたeDNAの捕捉は、現在広く使用されています。このアプローチには、フィルターの材質と多孔性の選択、フィルターの汚れ、プロセスの実行に現場で必要な時間など、固有の問題があります。凝集は、限られた時間で広範な領域をカバーしようとするサンプリング体制に簡単に実装して適用できる代替手段を提供します。

概要

2000年代半ばまでは、「環境DNA」という用語は、水や土壌の微生物から得られるDNAを指すために一般的に使用されていましたが、糞便源の追跡や外来種の検出を目的としたヒトや動物のDNAの検出にも使用されるようになりました^1,2,3。現在、真核生物から剥がれた細胞のDNAを表すために環境DNAが一般的に使用されており、このDNAの分析は広く使用されている管理ツールになっています。侵入種や危険にさらされている種を含む謎の種を検出することが目標であり、通常は、標的種の特徴的なDNAシグネチャの存在について水や堆積物をテストすることによって達成されます。研究は、特定のPCRアッセイ(アクティブサンプリング)を使用して目的の1つの種に焦点を当てることもあれば、メタバーコーディングと超並列シーケンシングを使用して多くの種を同時に検出することもできます。

過去20年間に、環境DNA研究に関連するサンプル収集、サンプル処理、およびデータ解析の多くの改善が行われました。初期の研究では、^{水サンプルから}DNAを捕捉するためにアルコール沈殿法が用いられていた3。試行錯誤を重ねながらも、アッセイの感度を高めるために大量の水を分析する必要があるため、この方法は、水サンプルの各容量に対して2つの容量のエタノールが一般的に必要であるため、魅力的ではありません。

その後の研究では、一般に膜ろ過が使用されており、eDNAは細胞結合状態から自由に溶解した状態までの連続体に存在するが、溶解したDNAは急速な分解を受けやすいため、細胞結合DNAが最も重要な画分を表すことを合理化しています。フィルター材料と細孔径の最適化は、^{フィルター4,5,6}から捕捉されたeDNAを抽出するための最適な方法と同様に、広く議論され、議論されています。

環境DNA捕捉の3つ目のアプローチは凝集であり、これは水、ビール、ワインなどの液体を清澄化するために何世紀にもわたって使用されてきたプロセスです。いくつかの研究では、凝集を使用して、天然または飲料水源からウイルスを捕捉しています7,8,9,10,11。これらの研究では、通常、捕捉剤として事前に凝集したスキムミルクまたは塩化鉄を使用しています。塩化鉄法は、通常、PCR反応阻害^12,13により、下流の分析分子問題を引き起こします。予め凝集されたスキムミルクを使用する方法は、凝集剤の事前調製、pH制御が必要であり、これまでのところウイルス^7,8,9の捕捉にのみ適用されてきました。

近年、塩化ランタン(III)の使用に基づく細菌やウイルスの凝集捕捉が研究されている12,13,14,15。著者たちは、塩化ランタンの結合が低濃度(0.2 mM)で有効であったため、この方法で生存可能な病原体を収集できることを実証した。さらに、ランタンの凝集は、塩化鉄とは対照的に、温和な条件下でキレート化によって可逆的です。

したがって、塩化ランタンを使用して生物学的微粒子を捕捉する凝集は、少量の濃縮凝集剤を添加するだけで済み、厳密なpH制御を必要とせず、サンプル量がミリリットルからガロンまで拡張可能であることを考えると魅力的です。eDNAの捕捉に適用されると、細胞、細胞内(ミトコンドリアおよび葉緑体)、および溶解したDNAが容易に回収されます。細菌とウイルスは同時に収集されるため、病原体試験や(または)単一の水サンプルからの追加の生態学的研究が可能になります。水サンプルから溶解した核酸と粒子状結合核酸の収集を可能にする塩化ランタンを使用した凝集プロトコルが提示されます。

プロトコル

1. 装置の除染と凝集試薬の調製

1. すべてのボトル、チューブ、およびその他の以前に使用した機器を食器用洗剤とお湯で十分に洗います。
2. すべてのボトル、チューブ、およびその他の以前に使用した機器に6%クエン酸溶液をスプレーしてミネラル沈着物を取り除き、20分間放置して、水道水ですすいでください。
3. 10倍に希釈した家庭用漂白剤(0.5〜0.6%の最終濃度の次亜塩素酸ナトリウム)の溶液をすべてのボトル(容器容量の約10%)に加え、振とうし、少なくとも1時間放置してから、漂白剤の痕跡がなくなるまで水気を切り、水道水ですすいでください。その後、脱イオン水で一度すすいでください。
4. すべてのボトルを乾かします。
5. すべての収集ボトルとキャップを生物学的安全キャビネットに置き、紫外線殺菌ランプを使用して、各ボトルとキャップを30分ごとに15回転回転させて2時間照射します。
6. キャップをボトルに置き、緩くねじ込みます。各ボトルの重量を量り、その空虚重量をボトルに記録します。
7. 塩化ランタン(III)七水和物の100 mM溶液を調製し、3.71 gを100 mLの脱イオン水に溶解します。塩化ランタンは吸湿性であるため、化学物質の空気への曝露を最小限に抑えるために、使用の合間にボトルをテープで密封してください。
   注意: 塩化ランタンには、警告の危険性に関する注意喚起書が付いています。H315は皮膚の炎症を引き起こします。H319は深刻な眼刺激を引き起こします。H335は呼吸器刺激を引き起こす可能性があります。個人用保護具を使用してください。詳細については、資料のSDSを参照してください。
8. 84.01gの重炭酸ナトリウムを1Lの脱イオン水に溶解することにより、重炭酸ナトリウムの1M溶液を調製します。ろ過滅菌し、室温で保存します。

2. サンプルの収集および凝集

1. 各サイトからサンプルを採取し、さらに1つのフィールドブランク(汚染を制御するために現場で充填された飲料水を含むサンプル)を、適切なサイズのボトルに充填して収集します。実験デザインと意図された目的に応じて、採取するサンプルの数を調整してください。サンプルを凍結する場合に膨張を可能にするために、ボトルの肩を超えてボトルを過剰に充填しないでください。
2. 日付、時刻、GPS位置などの関連メタデータを記録します。サンプルコンテナにラベルを付けます。
3. 1 M重炭酸ナトリウム溶液を各サンプルとフィールドブランクに加えます。500 mLサンプルあたり10 mLを添加します。
4. ボトルにキャップをして混ぜます。
5. 100 mM の塩化ランタンを各サンプルとフィールドブランクに加えます。サンプル500 mLあたり1 mLを添加します。
6. キャップをしてよく混ぜます。電気テープを使用してキャップを固定します。
7. フィールドラボに戻るまで氷上に保存し、その後、サンプルはフロックがコンテナの底に沈殿するまで冷蔵して直立させて一晩保存するか、-20°Cで凍結してさらに処理するために2番目のラボに出荷します。サンプルは、液体の膨張を防ぎ、容器の破裂を防ぐために、直立させて凍結する必要があります。

3. フロックの処理

1. 凍結したサンプルを室温で冷却器で解凍するか、凍結しなかったサンプルを、サンプル上清を吸引するためのペリスタティックポンプとチューブのセットアップを含む適切な作業台エリアに移動します。蠕動ポンプを通るチューブが床の大きなバケツに排出されていることを確認します。摂取量には、摂取量を制御するための清潔なプラスチック製のストローを装備する必要があります。
2. 蠕動ポンプを使用して、ストローを使用して最初に液体表面のすぐ下に吸引を向け、ストローの吸気口を液面とともに下に移動することにより、上清を除去します。インテークを慎重に動かしてポンティル(ボトルの底にある隆起したくぼみ)に載せて、上清の最後を取り除きます。これにより、フロックが周辺に集まりながら、液体を最大限に除去できます ( 図 1 を参照)。

図1:単位重力に沈殿したフロックの集合体。 細胞材料とeDNAを含むフロックは、サンプルボトルの底に沈殿し、上清を除去した後に回収する準備が整います。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. 清潔なストローを取り付け、サンプルごとに上清の除去を繰り返します。
4. 清潔な20 mLピペットとピペットコントローラーを使用して、フロック懸濁液を50 mL遠心チューブに完全に移します。少量の脱イオン水リンス(約5 mL)を使用して、サンプルボトルから残留フロックが回収されるようにします。
5. すべての50 mLチューブを脱イオン水と等量に調整し、2,500 x g で20分間遠心分離してフロックを回収します。
6. 上澄みを注ぎ、清潔なペーパータオルの上にチューブを逆さまにして立たせ、水気を切ります。
7. ボルテックス混合により、0.5 M EDTA(pH 8.0)1 mLのフロックを再懸濁し、次にpH 8.0の1x TE溶液4 mLを加えて再度混合します。再懸濁したフロックを15 mLの円錐形遠心分離チューブに移し、50 μLの10%直鎖状ポリアクリルアミドとボルテックスを加えます。100%イソプロパノール5mLを加えて混合し、氷の上に20分間放置します。
8. 6,000 x gで20分間遠心分離し、DNAおよび細胞微粒子を収集します。上澄みを注ぎ、きれいなペーパータオルの上に逆さまにして置き、水気を切ります。少し乾かしますが、過度に乾燥させないでください。
9. 25 μgの容量を持つビーズビーキングとスピンカラム結合を採用した市販のキットを使用して、floc DNA抽出プロセスを開始します。
   1. まず、キットに付属の溶解バッファー800μLにフロックを再懸濁し、懸濁液をビーズビートチューブに完全に移します。ビードは、冷却を挟んで短時間でフロックサスペンションを打ち負かしました。ホモジネートは、この時点で凍結保存することも、キットのプロトコルを続行することもできます。
   2. 最初にスピンカラムからDNAを100 μLで溶出し、次にスピンチューブを通じて溶出液をリサイクルします。
   3. 最後に、カラムから残存するDNAを100 μLアリコートの溶出バッファーで溶出させ、総容量を200 μLにします。これにより、回復が最大化されます。
10. eDNAを収集、調製、分析して、このプロトコルの性能と、広く使用されているろ過法と比較した性能を実証します。
    1. 1x qPCR マスターミックス、25 μg/mL ウシトロンビン^14,16、0.4 μM フォワードおよびリバースプライマー、および 2 μL のテンプレート (回収したサンプル DNA の 1%) を含む反応液を調製します。バウチャーDNAを使用して生成した精製および定量PCRアンプリコンの段階希釈液を使用して、標準曲線を作成します。あるいは、ターゲットを商業的に合成することもできる。
    2. 標準品が利用できない場合は、比較定量法を使用してください。この例では、95 °C で 10 分間の反応条件を使用し、続いて 95 °C で 10 秒間、57 °C で 30 秒間、72 °C で 30 秒間の 40 サイクルを使用してサーモサイクリングを行いますが、これらの条件は他のアッセイで調整する必要があります。メーカーのソフトウェアを使用してデータを分析します。

結果

2匹の東部塗装カメ(Chrysemys picta picta)を飼育する水槽から採取した8つの500mL水サンプル(各450mL)を使用して、記載されたプロトコルを使用してeDNAを調製しました。別の 8 つの 500 mL 水サンプルを、バインダーを含まない 1.5 μm の空隙率の 47 mm ガラス繊維フィルターでろ過し、凝集プロトコルに使用したのと同じ抽出方法を使用して eDNA を抽出しました。両手法を用いて調製したDNAを、標的生物のミトコンドリア制御領域を標的とする定量的PCRを用いて解析し、標的生物に特異的なフォワードプライマーとリバースプライマーを用いた。このデモンストレーションの標的生物は Chrysemys picta picta であり、フォワードプライマーとリバースプライマーはそれぞれ(5'-CGTCCATGTAACAGATGGCGT-3')と(5'-AAACCACCGTATGCCAGGTT-3')の配列を持っていました。

最初に比較定量を使用して、標準曲線が不要なため、プロトコルの再現性を実証しました。凝集プロトコル...

ディスカッション

この手法は簡単ですが、成功にはいくつかの手順が重要です。フロックの収集と転送は、DNAを失わないように完全に行う必要があります。残留物は、戦略的なすすぎを使用して収集する必要があります。記載されたプロトコルは、凝集した材料の最終処理のための市販のDNA抽出キットを使用する。他の抽出方法も同様に性能を発揮するか、または性能が優れている可能性があるが、プロトコールのこの部分の修正は網羅的に試験されていない。

記載されているプロトコルは、サンプル間の時間差を最小限に抑えて広く分散したサイトからサンプルを採取する必要があるサンプリング戦略や、高レベルの懸濁沈殿物がフィルターを詰まらせやすい場合に有用です。このプロトコルの欠点は、現場で処理するためにフィールドからフィールドステーションに水サンプルを輸送するか、処理のために別の研究所に輸送する必要があることです。ろ過方法は、軽量でコンパクトなフィルターを製造し、結合したターゲット材料を運び、簡単に輸送および出荷できます。残念ながら、現場でのろ過では、水の状態に応じて、各サンプ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5M EDTA、pH 8.0	複数の商用ソースから
1 x TEバッファー、pH 8.0	複数の商用ソースから
15 ml コニカル遠心分離チューブ	使い捨て
16オンス PET クリアスクエアボトル	洗浄および除染
38/400 圧力に敏感なポリプロピレンキャップライナー	は使用するまで緩く取り付けたままにしておきます。感圧ライナーをシールするためにしっかりとキャップをします。
50 mLの円錐形の遠心分離機の管の	単一の使用法
% クエン酸の解決	再使用可能なサンプルびんからのミネラル沈殿物を取除くために使用。
糞便/土壌微生物キット	阻害剤除去樹脂またはカラム
を使用する 塩化ランタン(III) 七水和物	100 mM ストックソリューション
蠕動DCポンプ	任意の蠕動ポンプを行うか、またはサイフォンすることができます
ポリアクリルキャリア	10% 線形ポリアクリルアミド
重炭酸	ナトリウム1 M、フィルター滅菌済みで室温

入手可能入手可能で再利用可能 キャップ6で保管