近接ライゲーションアッセイを用いたC.エレガンス生殖細胞系列におけるリボヌクレオプロテイン複合体集合体のSITU検出

サマリー

このプロトコルは、C.エレガンス生殖細胞リンにおけるその場でのタンパク質相互作用をプローブするための近接ライゲーションアッセイの使用を実証する。

要約

タンパク質相互作用(PPI)がいつどこで起こっているのかを理解することは、細胞内のタンパク質機能を理解し、開発などのより広範なプロセスがどのように影響を受けるかを理解するために重要です。カエノハブディティス・エレガンス生殖細胞系列は、幹細胞の調節、髄膜炎、および発達に関連するPPIを研究するための素晴らしいモデルシステムです。標準的な抗体による認識のために目的のタンパク質をタグ付けすることを可能にする様々な開発された技術があり、このシステムは近接ライゲーションアッセイ(PLA)反応に有利です。その結果、PLAは、PPIが代替アプローチよりも効果的に生殖系列で空間的および時間的に起こる場所を示すことができる。ここで説明するC. エレガンス生殖細胞系列の PPI をプローブするこの技術の適用および定量化のためのプロトコルです。

概要

タンパク質の80%以上が他の分子1との相互作用を有すると推定^{されており、細胞2}における特定の生物学的機能の実行においてPPIがいかに重要であるかを強調している。一部のタンパク質は、細胞生存に必要なより大きな複合体の組立を促進するハブとして機能する¹.これらのハブは複数の PPI を仲介し、細胞³の特定の機能を容易にするネットワークにタンパク質を整理するのに役立ちます。タンパク質複合体の形成は、特異的相互作用パートナー⁴の有無、細胞シグナル伝達事象、および細胞の発達段階などの生物学的文脈によっても影響される。

C.エレガンスは、開発を含む様々な研究のためのモデル生物として一般的に使用されています。この動物の単純な解剖学は、生殖腺、腸、透明キューティクルを含むいくつかの器官で構成されており、ワームの発達の分析を容易にする。生殖腺に存在する生殖細胞は、生殖細胞幹細胞が胚に成長し、最終的には次世代の子孫に^{成長するジ}テ5に成熟する方法を研究するのに最適なツールです。生殖細胞系列の遠位先端領域には、自己更新幹細胞のプールが含まれています(図1)。幹細胞がニッチを離れると、それらは大乳頭蓋に進行し、最終的には若年成人期に卵母細胞に発展する(図1)。生殖細胞系列におけるこの開発プログラムは、RNA結合タンパク質(RRP)6によって促進される転写後調節ネットワークを含む異なるメカニズムを介して厳しく調節される。⁶PPPは、RPPが他の補因子と関連付けて機能を発揮するので、この規制活動にとって重要です。

ワームの PPI をプローブするために使用できる方法はいくつかありますが、それぞれに固有の制限があります。インビボ免疫沈降(IP)は、ワーム抽出物全体からタンパク質-タンパク質複合体を分離するために使用することができます。ただし、このアプローチは、ワーム内で PPI が発生する場所を示すものではありません。さらに、開発の特定の段階または限られた数の細胞の中で一過性で唯一形成されるタンパク質複合体は、共免疫沈降法によって回収することが困難であり得る。最後に、IP実験では、アフィニティーマトリックス上のタンパク質のリシスおよび非特異的保持後のタンパク質複合体再分類の懸念に対処する必要があります。

PPIのインシチュ検出における代替アプローチは、共免疫染色、フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)、および二分子蛍光相補(BiFC)である。コ免疫染色は、固定ワーム組織での目的とする2つのタンパク質の同時検出と、シグナルの共局在化の程度の測定に依存します。標準的な顕微鏡検査⁷よりも詳細な超解像顕微鏡の使用は、200-300^nm8の回折限界障壁を越えてタンパク質の共局在化をより厳格にテストするのに役立ちます。しかし、従来の顕微鏡と超解像顕微鏡の両方を使用した共同免疫染色は、明確に定義されたローカリゼーションパターンを持つタンパク質に最適です。対照的に、拡散分散型の相互作用パートナーにとってはあまり有益ではありません。重複に基づいてシグナルの共局在化を測定しても、タンパク質が互いに複雑であるかどうかについては正確な情報を提供しません^9,,10.

さらに、タンパク質複合体の共免疫沈降と共免疫染色は定量的ではなく、そのような相互作用が有意であるかどうかを判断することは困難です。FRETとBiFCは、いずれも蛍光ベースの技術です。FRETは、あるFP(ドナー)からのエネルギーが別のFP(アクセプタ⁾¹¹に伝達されるスペクトル重複を有する蛍光タンパク質(FP)と関心のあるタンパク質をタグ付けすることに依存する。このエネルギーの非放射移動は、それぞれの発光波長で検出することができるアクセクサFPの蛍光をもたらす。BiFCは、インビボの蛍光タンパク質の再構成に基づいています。これは、ヘリックス1-10とヘリックス11¹²などの2つの相補的な断片にGFPを分割し、その後、対象となる2つのタンパク質に融合することを必要とします。これら2つのタンパク質が相互作用する場合、GFPの相補的な断片は、折り畳み式と組み立てに十分近く、GFPフルオロフォアを再構成するほど近くなります。再構成されたGFPは、蛍光として直接観察され、PPIが発生した場所を示す。

そのため、FRETとBiFCの両方が、タグ付きタンパク質の機能を破壊する可能性のある大きな蛍光タグに依存しています。さらに、FRETとBiFCは、正確なデータを得るためにタグ付きタンパク質の豊富で同等の発現を必要とします。FRETは、一方のパートナーが他方を超えている実験には適しておらず、高い背景¹³につながる可能性がある。BiFC実験における過剰発現は、背景の増加をもたらす非特異的アセンブリ¹⁴を誘発する可能性もあるので、避けるべきである。どちらの手法でも、タグ付きタンパク質の発現条件と画像化条件の最適化が必要であり、実験の完了に必要な時間が長くなる可能性があります。

近接ライゲーションアッセイ(PLA)は、上述の技術の限界に対処できる代替アプローチである。PLAは、目的のタンパク質(またはそのタグ)を認識する一次抗体を利用します。これらの一次抗体は、40nm(または短い)距離¹⁵内で互いにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを含む二次抗体によって結合される。得られたハイブリダイズされたDNAはPCR反応を通じて増幅され、DNAを補うプローブによって検出される。これは顕微鏡によって視覚化される病巣で起因する。この技術は、複雑な組織(すなわち、ワーム生殖腺)においてPPIを検出することができ、これは、開発および分化の様々な段階で細胞を含む組立ラインとして組織される。PLAを使用すると、PPIは固定ワーム生殖腺で直接視覚化することができ、開発の特定の段階でPPIが発生するかどうかを調査する上で有利です。PLAは、正確な測定に最適な共ローカリゼーションベースのアッセイとは対照的に、PPIの解像度を高めます。使用する場合、超解像顕微鏡は、細胞内のPLA病巣の位置についてのより細かい詳細を提供する可能性を有する。もう1つの利点は、PLA反応に起因する病巣をImageJベースの解析ワークフローで数えることができることであり、この技術を定量化する。

ダイニン軽鎖のLC8ファミリーは、最初にダイニンモーター複合体¹⁶のサブユニットとして記述され、貨物アダプタとして機能すると仮定した。^,最初の発見以来、LC8はダイニンモーター複合体^{17、18、19、20,18,19}に加えて複数のタンパク質複合体で発見された。²⁰LC8相互作用モチーフ¹⁹を含むタンパク質配列のスキャンは、LC8^,が^,17、18、19、20、21、22の異なるタンパク質の広い配列との多くの相互作用^{17,18,1921を22}有し得る可能性があることを示唆している。²⁰その結果、LC8ファミリータンパク質は現在、より大きなタンパク質複合体^19,22,22の組立を促進するのに役立つハブと考^{えられている。}

1つのC.エレガンスLC8ファミリータンパク質は、ダイニン軽鎖-1(DLC-1)が、多くの組織にわたって広く発現しており、特異的な細胞下構造^23,24,24では濃縮されていない。その結果、C.エレガンスにおけるDLC-1の生体内パートナーの生物学的に関連する同定は、いくつかの理由で困難である:1)共免疫沈降は、相互作用が起こる組織源を示さない。2)特定のパートナーの限定的な発現または一時的相互作用は、共免疫沈降による相互作用を検出する能力を妨げる可能性がある;3) DLC-1の拡散分布は、共免疫染色により、潜在的なパートナータンパク質と非特異的な重複を招く。これらの課題に基づいて、PLAは、DLC-1とのインビボ相互作用をテストするための理想的なアプローチです。

DLC-1はRNA結合タンパク質(RRP)FBF-223およびGLD-1²⁵と直接相互作用し、補間因子として機能することが以前に報告²⁵されている。我々の研究は、ハブタンパク質として機能するDLC-1のモデルをサポートし、DLC-1がdynein^19,22,22を超えた相互作用ネットワークを促進することを示唆している。GST プルダウンアッセイを使用して、OMA-1 という名前の新しい DLC-1 相互作用 RBP が²⁶と特定されました。OMA-1は、卵母細胞の成長および大動脈成熟²⁷および多数の翻訳リプレッサーおよび活性化剤²⁸と共に機能する重要である。FBF-2およびGLD-1は幹細胞領域および重症パキテーン領域でそれぞれ発現しているが、OMA−1は、大母細胞²⁷を通る大動脈パキテーンから生殖細胞で拡散的に発現される(図1)。これは、DLC-1が生殖腺の異なる領域にRMPを有する複合体を形成することを示唆している。また、インビトロで観察されたDLC-1とOMA-1の間の直接相互作用は、in vivo IPによって回収されないことも判明した。PLAは、C.エレガンス生殖細胞系列におけるこの相互作用をさらに研究するための代替アプローチとしてうまく使用されており、その結果、PLAを使用してワーム内の他の多くのPPIを探査できることを示唆している。

プロトコル

注: このプロトコルは、潜在的な相互作用パートナーの両方がタグ付けされているC.elegans株を使用します。1つのタグ付きタンパク質が別のタグ付き候補相互作用パートナーと相互作用することが期待されない陰性対照株を使用することを強くお勧めします。ここで、GFP単独は、DLC-1がワーム内のGFPと相互作用するとは考えられていないので、バックグラウンドを評価するための陰性制御として使用された。GFPタグ付きOMA-1は、実験株として使用され、予備データがDLC-1との相互作用を示唆している。3xFLAG タグ付き DLC-1 を持つ対照タンパク質とテストタンパク質を共発現する線虫株は、このテキストでは 3xFLAG::DLC-1 と呼ばれます。GFP と 3xFLAG::DLC-1;OMA-1:::GFP(要求に応じて利用可能な株、材料表の詳細)それぞれ。ここでは、3xFLAG タグと GFP タグが使用されます。しかし、他のタグは、それらの抗体がPLAキット試薬と互換性がある限り置換され得る。

1. 動物のケア

1. 大腸菌のOP50株を播種した線虫増殖培地(NGM)プレートにワームを保管し、GFPの最適な発現のために24°Cで維持します。
2. 2〜3日ごとに成虫のワームを通過させ、ワームを伝播し、十分に餌を与え続ける。

2. 同期文化の準備

1. よく供給された、グラビッド雌雄同体のプレートを漂白することによってワームを同期させます。漂白プロトコルはポルタ・ド・ラ・リヴァら²⁹に記載されています。M9最小培地(M9)バッファーの10 mLで終わりを回転させながら、胚を24°Cの遠心分離管で一晩孵化させます。これは逮捕されたL1幼虫の文化を生み出すでしょう。
2. 逮捕されたL1ステージの幼虫のチューブを氷の上に10分間インキュベートし、氷冷1x M9でチューブを上に置きます。
3. 遠心分離機を使用して幼虫を600xgで4°Cで5分間ペレットします。 g上清の1-2 mLのみが残るように上清を慎重に吸引する。
4. 幼虫のペレットを再懸濁し、マイクロピペットを使用して2μLの懸濁幼虫培養液をガラススライドに移します。ステップ2.5でワームの播種を導くのに役立つ幼虫培養の密度を決定するために、いくつの幼虫が存在するかを数えます。
   注:10-15 L1幼虫/1μLの密度は、播種に適しています。
5. マイクロピペットを使用して、約100-120 L1ステージの幼虫を60mmOP50プレートに播種するのに必要な幼虫培養量を移送します。例えば、10 L1幼虫/1μLの培養密度を有する幼虫培養の種子10μL。
   注:幼虫を播種するために40 μLのボリュームを超えないようにしてください、または余分な液体はOP50芝生を破壊します。培養量が40μLを超える場合は、ステップ2.3~2.4を繰り返して、さらに体積を減らし、幼虫培養の密度を高めます。
6. 24°Cでワームを育てる。L1sがプレートに播種された時刻を記録し、定期的に開発段階をチェックして解剖の理想的な時期を特定します。
   注:L1sの播種後52時間で、24°Cで培養されたワームは、通常、生殖腺標的PLAの解剖に理想的な段階である若年成人期である。しかし、同期されたワームが成人期に達する実際の時間は、株や潜伏温度によって異なる場合があります。

3. 解剖/生殖腺押出

注:生殖腺を標的とするPLAが正常に動作するためには、生殖腺を押し出すために解剖が必要です。このアプローチは、PLAのためにこのプロトコルを使用して動作する胚を解放することもできます(詳細については、議論を参照してください)。解剖後、陰性対照および実験サンプルの両方を固定し、同時にPLAのために処理される。また、目的とするタンパク質パートナーの発現パターンを実証するために、蛍光共免疫染色²³の目的のために追加のサンプルセットを調製することも示唆される。

1. 1x M9 + レバミソール(2.5 mM最終濃度)の500 μLを含む時計ガラス皿に30〜40の若い成虫を選びます。ワームを収集した後、慎重に除去し、ワームと一緒に転送される細菌を除去するためにメディアのほとんどを破棄します。
2. 1x M9 + レバミソールの新鮮な500 μLを加え、ピペットを使用して穏やかに描画し、メディアを分配してワームをすすきます。慎重に除去し、ワームと一緒に転送される細菌をクリアするために、メディアのほとんどを破棄します。
   1. すべての細菌が除去されるまで、このステップ2x-3xを繰り返します。水和を保つために、約100μLの培地にワームを残します。
      注:これは解剖中に生殖腺の押し出しを損なうため、ワームが7分以上メディアに座らせないでください。顕微鏡を解剖して、虫が失われないようにメディアの除去を監視する方法で、打ち上げを行います。
3. ガラスまたはポリエチレンピペットを使用して、0.001%ポリL-リジンでコーティングされた25 mm x 75 mm顕微鏡スライドにワームを移す(この手順で使用されるスライドはエポキシコーティングされた周長を有し、3つのワークスペース、それぞれ14 mm x 14 mmを残す)。余分なメディアを取り除き、約10~15μLのメディアが残るようにします。
4. 解剖顕微鏡の助けを借りて、2つの261/2ゲージ針を使用して、端がハサミを形成するように片方の針をもう一方の針の上に置きます。この方法で向いた針を使用して、細菌を解放するために咽頭の後ろにワームをカットします。5分以内にすべてのワームを解剖します。
   注: 解剖の実行方法の詳細については、Gervaise と Arur³⁰の前の文書で見つけることができます。
5. すべてのワームを解剖した後、スライドに対して垂直になるように、スライドの上に22 mm x 40 mmのカバースリップをそっと置きます。カバースリップの端部がスライドから垂れ下がるはずです。
6. ドライアイスに保持されている冷やされたアルミニウムブロックのスライドを少なくとも20分間凍らせます。

4. 固定/ブロック

1. 固定の準備ができたら、鉛筆や他の鈍い刃のツールでカバースリップをフリックし、すぐに新鮮な氷冷メタノール(-20°Cに冷やして)を含む瓶にスライドを1分間浸します。
2. サンプルを取り囲むスライドの端を静かに拭き取り、次の試薬がサンプルの周りの表面張力によって保持されるようにします。150 μL の固定液(2% ホルムアルデヒド 100 mM KH₂PO_4、pH = 7.2)を RT で 5 分間塗布します。
   注:メタノール/アセトン固定手順^31、32をテストし^、PLA32反応と互換性があることを発見しました。
3. 固定剤がスライドから飛び出してペーパータオルに吸収できるように、スライドをペーパータオルに90°垂直にタッチします。1x PBS/1% トリトンX-100/1%ウシ血清アルブミン(PBT / BSA)の50 mLを持つコプリン瓶のRTで15分間2倍のスライドをスライドさせます。
   注:このブロッキングステップとセクション6-9の洗浄手順には、コプリン瓶やその他のタイプの染色瓶をお勧めします。これらはサンプルとのブロッキングまたは洗浄バッファーの効率的な交換のための十分な量を提供する。
4. 10%の正常なヤギの血清を含むPBT/BSA溶液とのブロックスライド。スライドを囲むエッジを静かに拭き取り、100 μLのソリューションをスライドに適用します。湿度の高いチャンバーでRTで1時間インキュベートする。
   注:このステップは、αFLAG一次抗体で染色する場合に強くお勧めします。湿気の多い部屋は、それらがインキュベートとして置くためにスライドのためのテープでガラスピペットを固定することによって構築されます。減衰したタスクワイプ(材料表)は、蒸発を防ぐためにトレイの内部湿度を上げるためにトレイに置かれます。蓋とトレイは、光に敏感なステップの間に光からサンプルを保護するためにホイルで覆われています。
5. ペーパータオルの上にスライドを置き、PBT /BSA/10%NGS溶液をスライドから外し、スライドの端を静かに拭きます。スライドをブロックするには、ブロッキング試薬(材料表)を使用します。14 mm x 14 mm のスペースに 1 滴を塗布します。湿気の多いチャンバーで37°Cで1時間の間のインキュベートスライド。

5. 一次抗体インキュベーション

注:最良のPLA結果と最小限の背景を得るためには、一次抗体の希釈因子は最適化を必要とするかもしれません(詳細については、議論を参照)。さらに、PLAに使用される二次抗体の特異性に一致する異なる宿主において、一次抗体を育てるべきです。

1. ペーパータオルの上にスライドを置き、ブロッキング試薬をスライドから外し、端を静かに拭きます。抗体希釈剤(材料表)を使用して、一次抗体を希釈します。14 mm x 14 mm スペースあたり 40 μL の一次抗体溶液を塗布します。
2. 4°Cで一晩湿気の多いチャンバーに滑り込み。.

6. PLAプローブ(二次抗体)インキュベーション

メモ:手順6~9では、RTで洗浄バッファAとBを使用してください。バッファーが4°Cで保存されている場合は、使用する前にRTに温めてみましょう。

1. コップリン瓶のRTで50 mLの1x洗浄バッファーA(材料表)で5分間スライド2倍を洗浄します。軌道シェーカーのコプリンジャーを60 rpmに設定します。
2. ペーパータオルの上にスライドを置き、洗浄バッファーをスライドから流し、端を静かに拭きます。PLUSおよびMINUSプローブを含む40μL溶液を調製(抗体希釈剤で1:5希釈)。14mm x 14 mmの各スペースに溶液を塗布します。
3. 37°Cで1時間湿度の高いチャンバーに滑り込みスライドをインキュベートする。

7. ライゲーション

1. コップリン瓶のRTで50 mLの1x洗浄バッファAで5分間スライド2倍を洗います。軌道シェーカーのコプリンジャーを60 rpmに設定します。
2. ライゲーションバッファー (材料表) を超純水で 1:5 希釈します。このバッファーを使用してリガーゼ(材料表)1:40 を希釈し、ライゲーション溶液の作業ストックを調製します。
   1. ペーパータオルの上にスライドを置き、洗濯バッファーをスライドから流し、端を静かに拭きます。各14 mm x 14 mm のスペースに、40 μL のライゲーション溶液を塗布します。
3. 37°Cで30分間、湿気の多いチャンバーに滑り込みスライドをインキュベートします。

8. 増幅

注:赤い蛍光体(材料表)を含む検出試薬を使用すると、C.エレガンス組織の背景の量が最も少ないです。

1. コップリン瓶のRTで50 mLの1x洗浄バッファAで5分間スライド2倍を洗います。軌道シェーカーのコプリンジャーを60 rpmに設定します。
2. 増幅赤バッファー(材料表)を超純水で1:5希釈します。このバッファーを使用してポリメラーゼ(材料表)1:80 を希釈し、増幅液の作業ストックを調製し、光から保護します。
   1. ペーパータオルの上にスライドを置き、洗濯バッファーをスライドから流し、端を静かに拭きます。各14mm x 14mmのスペースに40μLの増幅液を塗布します。
3. 37°Cで1時間40分間、湿気の多いチャンバーに滑り込み。.湿気の多いチャンバーが光からサンプルを保護するためにホイルで覆われていることを確認してください。

9. 最終の打ち上がり

1. コップリン瓶のRTで1x洗浄バッファーB(材料表)の50 mLで10分間スライド2倍を洗浄します。軌道シェーカーのコプリンジャーを60 rpmに設定します。
2. コップリン瓶のRTで0.01x洗浄バッファBの50 mLで1分間スライド1倍を洗います。軌道シェーカーのコプリンジャーを60 rpmに設定します。この緩衝液は、洗浄緩衝液Bを超純水で希釈して調製する。

10. カバースリップマウント

1. 余分な洗浄バッファーをペーパータオルにスライドから流し、スライドのエポキシコーティングされた周囲に残っている残りのバッファーを拭き取ります。
2. 10 μLの取り付け媒体(材料表)を加えてサンプルを取り、カバースリップを上にそっと置き、取り付け媒体を広げます。
3. カバースリップとスライドを密封するためにマニキュアでカバースリップの端の周りにペイントします。生殖細胞系を損傷するカバースリップを動かさないようにマニキュアの塗布に優しくしてください。マニキュアはRTで少なくとも20分間硬化させ、スライドは光から保護してから顕微鏡で見ます。
4. PLA ラベルのサンプルは光に敏感なので、暗い容器またはスライドホルダにスライドを保管します。メーカーは、スライドが長期保存のために-20 °Cで、短期保存のために4°Cで保存することができることを示唆しています。このプロトコルを使用して作成したスライドは、20°Cで保存すると少なくとも2ヶ月間持続します。

11. 画像の取得

1. 定量化を目的として、共焦点顕微鏡を使用して、明確な視界、損傷のない、遮るもののない突出性生殖細胞の画像をキャプチャします。Z平面の生殖細胞系列全体に及ぶ生殖細胞系列のZスタックをキャプチャし、定量に使用する最大投影画像を生成します。
   注意:共焦点顕微鏡は、蛍光顕微鏡を用いて得られるものに比べ、背景の少ないPLA画像を取得し、定量するのに理想的です。
   1. 生殖細胞系列が1つの視野に収まらない場合は、必要に応じて重なり合う視野を捉えて、生殖細胞系列全体を画像化する。これらの画像の最大投影は、フィジーで一緒にステッチすることができます。
2. 画像解析中の病巣の識別に適した適切な閾値を設定するために、コントロールと実験サンプルの間で画像処理条件を同じに保つようにしてください。
   注: PLA定量の統計分析を容易にするために、各サンプルから反復ごとに少なくとも8-10の生殖細胞を記録してください。PLAが信頼性の高い一貫した定量的結果を得るためには、少なくとも3つの生物学的複製が推奨されます。

12. フィジー/イメージJを用いた画像分析と定量

注: 次のワークフローは、イメージが .czi 形式で保存される共焦点顕微鏡上の 40x 目的を使用して取得した画像に基づいています。これらの .czi イメージとそれに付随するメタデータ (寸法を含む) は、フィジー/ImageJ でアクセスして開いて、さらに分析することができます。フィジーが特定のユーザが利用できる共焦点からコンフォーカルファイルのフォーマットを受け入れるかどうかをチェックする必要があります。そうでなければ、.tiff形式の画像を分析に使用することもできますが、ユーザーは、フィジー/ImageJで手動で画像のスケールを設定する必要があります (分析 |スケールを設定します。すべての陰性コントロール イメージを最初にまとめて分析し、背景のレベルを設定することをお勧めします。

1. まず、すべての負のコントロール画像を分析して解析ワークフローを開始し、次に実験サンプルに進みます。分析するフィジー/ImageJで最大投影画像を開きます (図 2A)。czi ファイルを使用している場合は、バイオフォーマットインポートオプションボックスが表示されます。
   1. イメージを開くには、次のオプションを含めます。カラーモード =カラー化.イメージが表示されたウィンドウがスライド バー付きに開き、共焦点 (DAPI や PLA など) によってキャプチャされた異なるチャネルを切り替えるようになりました。
   2. 画像をステッチする必要がある場合は、マウスで画像を右選択し、[Duplicate](複製)ウィンドウを開く場合は[Duplicate](複製)を選択して、各画像から各チャンネルの複製を作成します。PLA または DAPI チャネルに対応するチャネル番号 (c) のみを指定し (例えば、2)、ハイパースタックの複製のチェックボックスをオフにします。
   3. 両方の画像を開いてステッチして、プラグインを選択 |ステッチング |非推奨 |2Dステッチ.[2D 画像のステッチ]ウィンドウが開きます。ステッチに使用する画像を選択し、ウィンドウでプリセットされているデフォルトのパラメータを使用して、[OK]を選択します。結果の画像は、組み立てられたグレースケールイメージになります。
      注: サブイメージが完全に整列しない場合は、パラメータを調整します(つまり、チェックするピーク数を5から500に増やすか、融合方法をリニア ブレンドから Max に変更します)。強度)は、所望の画像を得るのに役立つかもしれません。他のステッチツールは利用できますが、この方法では画像の次元が保持されるため、定量化に重要です。
2. キーボードのTキーを押して ROI (対象地域) マネージャーを開きます。ROI マネージャという名前の新しいウィンドウが開きます。
3. フィジーツールセットボックスからポリゴンツールを選択します。生殖細胞系列の周囲をドロップして、それをアウトライン化して ROI を生成します (図 2B)。最後のドットを最初のドットに接続して、完全な ROI を生成します。
   注意:画像が暗い場合は、より正確に輪郭を描くことができるように、(可逆的な)生殖細胞系列の可視性を向上させるためにコントラストを調整すると便利です。
   1. ROI が完了したらすぐに ROI マネージャに移動し、[追加][t]を選択して ROI を保存します。ROI のポイントの追加/削除、ROI およびポイントの移動など、ROI に対する変更は、次の手順に進む前に更新 ([ROI マネージャから更新] を選択) することが不可欠です。ROIとそのポイントの操作に関する詳細は、FIJI/ImageJユーザーガイドを参照してください。
4. ROI の向きを設定したら、ROI マネージャで ROI 名を選択し、[詳細] をクリックして後で参照できるように保存できます。保存 |(ファイル名を指定し、保存先を指定します)。保存された ROI を ROI マネージャで開くには、[その他] を選択します。開く |(ファイルを選択する)
5. ROI マネージャから ROI 名を選択し、ROI マネージャの[測定]ボタンを選択して、ROI 内の領域を測定します。結果ウィンドウが開き、画像(μM²⁾⁽図2Bのインセット)でカバーする領域を含むROIに関する情報が表示されます。この情報をスプレッドシートに記録して、後続の計算を行います。
   注: ROI の正しいサイズが収集されるように、イメージのスケールが正しく設定されていることを確認してください。[結果] ボックスに報告された測定の種類は、[分析] |測定を設定します。
6. PLA チャンネルのみの複製イメージを開くには、PLA イメージを右クリックし、[複製] を選択します (図 2C)。複製ウィンドウが開きます。PLA チャネルに対応するチャネル番号 (c) のみを指定し (例えば、2)、ハイパースタックの複製のチェックボックスをオフにします。元のイメージが変更されないように、このイメージの複製を使用することをお勧めします。
   注:これらのオプションは、FIJI /ImageJで複数のチャンネルを含む画像を表示する場合にのみ表示されます。別のアプローチは、チャンネルを分割する画像 |色 |[チャネルを分割] をクリックしますが、元のイメージ ファイルが変更されます。
7. 選択したPLAチャンネルの画像のみで、画像|調整 |しきい値:イメージのしきい値ウィンドウが開きます。しきい値の方法として[既定値]を選択し、色として[赤] を選択し、[背景の濃い] ボックスをオンにします。ウィンドウの上部のトラックを使用して、すべてのPLAの病巣が画像で明確にハイライトされるまで、右に向かってバーをスライドさせます。
   1. 上部トラックの右側にあるボックスに値を記録し、しきい値の設定に使用された値をメモします。しきい値ウィンドウで[適用]を選択してしきい値を確定すると、画像は黒い点として表示されるしきい値フォシのみを含む白い背景に変換されます(図2D)。複数の陰性制御イメージでしきい値をテストし、定量前に画像から画像まですべてのPLA病巣をキャプチャするのに適していることを確認します。
      注: 白い背景に黒い点としてしきい値の病巣を表示するには、プロセス |バイナリ |オプション.をクリックし、[黒の背景] ボックスをオフにします。30~40のしきい値は、生殖細胞系列のPLAを識別するための良い出発点です。ただし、理想的な値は背景によって異なる場合があります。
8. PLA の病位を定量化するには、ROI マネージャ ウィンドウから ROI 名を選択して、ステップ 12.3~ 12.3.1 から生成された ROI をしきい値イメージに適用します。ROI のアウトラインは、ソース イメージと同じ場所にイメージに表示されます (図2E)。
   1. 分析に移動|パーティクルの解析:[パーティクルの解析] ウィンドウが開き、次のパラメータが選択されます。 0-Infinity 0.00-1.00 Nothing[集計] ボックスをオンにします。
   2. [OK]を選択すると、ROI に関する情報 (つまり、PLA 病巣の合計数、ROI 内の PLA 病巣の内部占有領域、PLA 病巣の平均サイズ、および PLA 病巣が占める領域の割合をROIのサイズに対して占める割合) に関する情報が表示されます (図 2Eの設定値)。これらの測定値をスプレッドシートに記録します。
9. 同じしきい値を使用して、複数の負のコントロール イメージについて手順 12.1 ~ 12.8 を繰り返します。
   1. すべての陰性対照画像を解析したら、負のコントロールによって決定されたのと同じ閾値を使用して、すべての実験サンプルについてステップ 12.1~12.8 を繰り返し、PLA病巣を特定して定量します。

結果

両方の 3xFLAG::DLC-1 の共同免疫染色;GFP と 3xFLAG::DLC-1;OMA-1::FLAG抗体とGFP抗体を用いたGFP生殖細胞は、生殖細胞系列における発現パターンを明らかにした(図3Aii-iii,3Bii-iii)。GFPは生殖細胞系列全体に発現した(図3Aiii),OMA-1::GFP発現は後期パキテネ及び卵母細胞に限定された(図3AiiiBiii)27。²⁷FLAG免疫染色は、3xFLAG::DLC-1が両方の株で生殖細胞系列全体に発現したことを示す(図3Aii,3Bii)。共免疫染色によって、3xFLAG::DLC-1とO...

ディスカッション

C.エレガンス生殖細胞系列でPPIを研究する際、PLAが提供する高解像度は、共免疫染色と比較して、生殖細胞系列で相互作用が起こる場所の視覚化と定量化を可能にする。DLC-1は、IN VITRO GSTプルダウンアッセイ²⁶を使用してOMA-1と直接相互作用することが報告されました。しかし、この相互作用は in vivo プルダウンでは回復されませんでした。3xFLAG::DLC-1の蛍光共免疫染色;OMA-1::GFP生殖細胞系は、DLC-1とOMA-1の発現パターンに重複を示す。しかし、生殖細胞系列でどこで相互作用が起こるかの兆候はなく、重複自体は3xFLAG::DLC-1とGFPの間のタンパク質(陰性対照)との間のそれより大きくはない。Situ PLAを用いて、DLC-1が生殖細胞系列のOMA-1と相互作用することが判明し、PLAは他のアプローチと比較してPPIの検出に対してより敏感である可能性があることを示唆した。このアプローチを通じて、RBPの補因子としてのDLC-1の新たな役割を拡大し続けています。この研究は、生殖細胞系列中の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
16% パラホルムアルデヒド溶液	電子顕微鏡サービス	15710	4% 作業溶液
1M KH2PO4	Sigma	P0662	1M ワーキングストック
1x M9	様々な		10x ストックとして調製 1x 1x で使用され、プロトコル
1x PBS	の wormbook.org 様々な		を参照してください。プロトコル
26.5ゲージニードルエク	セルインターナショナル	26402	wormbook.org 解剖に使用される針
BSA	ランパイア	7500802
遠心チューブ	サーモサイエンティフィック	05-529C	50ml オークリッジ遠心分離管同期に使用される
共焦点顕微鏡	ツァイス	880
Coplin	ジャーPolyLab	62101
サンプル凍結用カバースリップ	Globe Scientific	1411-10	22x40mm、No. 1
スライドシール用カバースリップ	Globe Scientific	1404-15	22x22mm、No. 1.5
免疫蛍光ベクター用DAPI封入剤		H-1200
リガーゼ	Sigma-Aldrich	DUO82029	Duolink 1x Ligase, Comes as the Part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kitDUO92008
増幅赤色バッファー	Sigma-Aldrich	DUO82011	Duolink 5x Amplification 赤色バッファーは、Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Ligation Buffer	Sigma-Aldrich	DUO82009の 5x	Ligation バッファーの一部として提供され、Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
抗体希釈剤	Sigma-Aldrich	DUO82008	Duolink抗体希釈剤、DUO92004とDUO92002が付属しています、注:1x PBS / 1%BSA溶液も抗体を希釈するための代替品として使用できます。
ブロッキングソリューション	Sigma-Aldrich	DUO82007	Duolinkブロッキングソリューション、PLA用DUO92004およびDUO92002
封入剤	Sigma-Aldrich	DUO82040	付きDuolink In Situ封入剤
	Sigma-Aldrich	DUO92004	Duolink In Situプローブ Anti-Mouse
MINUS PLUSプローブ	Sigma-Aldrich	DUO92002	Duolink In Situプローブ抗ウサギPLUS
洗浄バッファーA	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink In Situ洗浄バッファーA
洗浄バッファーB	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink In Situ洗浄バッファーB
ポリメラーゼ	Sigma-Aldrich	DUO82030	Duolinkポリメラーゼは、ライカ
			のエピ蛍光顕微鏡DUO92008 Duolink In Situ検出試薬レッドキットの一部として提供されますDFC300Gカメラ、DM5500B顕微鏡
ヤギ反マウス Alexa 594	JacksonImmuno	115-585-146	1:500で使用
ヤギ反ウサギ Alexa 488	JacksonImmuno	111-545-144	1:200で使用
画像処理ソフトウェア	Adobe		Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
ガラスピペット	コーニング	7095B-5X
レバミゾール	ACROS有機物	187870100	250mMの作業用ストックを準備し
メタノール	フィッシャーサイエンティフィック	A454
マウス 抗FLAG	シグマ	F1804	免疫蛍光とPLAのために1:1000で使用し、正常なヤギの血清で事前にブロックすることをお勧めします
マニキュア	L.A.カラー	CNP195
線虫成長培地 (NGM)	さまざまな		wormbook.org を参照してくださいプロトコル
正常なヤギ	の血清 JacksonImmuno	005-000-121
ポリエチレン パスツールピペット	地球	科学 135030
Poly-L-リジン	Sigma-Aldrich	P1524	水で0.1%のストック溶液として調製され、-20°Cで保存され、水で1:100に希釈されてスライドをコーティングします
ペトリ皿	Tritech	PD7060	直径60
mmのウサギ抗GFP	サーモフィッシャー	G10362	免疫蛍光法は1:200、PLAスライドは1:4000で使用
	サーモフィッシャー	30-2066A-ブラウン	バー付き3角14x14mmオートクレーブ可能なスライドは、フィッシャーサイエンティフィックを通じてカスタムオーダーされています。ポリ-L-リジンは、ラボのスライドに追加
亜塩素酸ナトリウム溶液	フィッシャーサイエンティフィック	SS290-1
タスクワイプ		Kimtech34120	4.4x8.4インチタスクワイプトレイ
(242x241x20mm)	サーモフィッシャー	240845	湿度の高いチャンバートリ
トンX-100	ACROS有機物	327372500
超純水	Milli-Q		Milli-Q Integral Water Purification System
Watchglass	Carolina Biological	742300-20
°から得られた超純水。C冷凍庫
-80°;C冷凍庫
OP50株大腸菌
オービタルシェーカー
テープ
この研究で使用した線虫株(どちらもリクエストに応じて利用可能)
mntSi13[pME4.1] II;UNC-119(ED3)III;teIs1 [pRL475]		UMT 376	dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP;参考文献 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III		UMT 422	dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+);参考:本研究