この研究は、臓器の発達を研究するための2つの方法、培養胚器官およびオルガノイドの血管化を可能にする鳥類胚からの絨毛球膜(CAM)の改善された異種移植セットアップと、新しい固定z方向を説明する。高解像時間経過共焦点イメージングを可能にする改変実験条件を有する臓器培養法。
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方法論記事
血管化、拡張開発、および顕微鏡イメージングの改善のための腎オルガノイドおよびオルガノイド培養の最適化
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
胚性腎臓の有機的培養、特に多能性幹細胞由来の腎臓オルガノイドは、発達過程および腎臓病のモデリングに優れたツールである。しかし、モデルは血管化と機能性の欠如によって制限されています。これに対処するために、血液の血管化と回復を得るために鳥の胚の絨毛管内膜(CAM)に細胞および組織を異種移植する方法のための改良されたプロトコルが開発された。移植片はCAMにサンプルを固定し、乾燥から移植片を保護する培養媒体とそれらを供給するカスタムメイドのミニ貯蔵所と重ねられる。改善された培養法により、異種移植片は最大9日間増殖する。また、この原稿は、以前に発表された固定Z方向(FiZD)法を用いて、腎オルガノイドおよび有機的培養物の長期的な共焦点イメージングに最適な条件を提供する方法についても説明しています。この方法は、ガラスカバースリップと膜の間の胚器官またはオルガノイドを大量の媒体で穏やかに圧縮し、最大12日間のイメージングに優れた条件を提供します。これらの方法は、共焦点イメージングを改善した腎オルガノイドおよび有機的な腎臓培養物への血管化および血流を可能にする。ここに記載されている方法は、腎臓ex vivoの基本的および応用機能を研究するために非常に有益である。どちらの方法も、様々なタイプの組織やオルガノイドに適用可能です。
概要
胚性腎臓のオルガノーチ培養は、数十年前2、2、3年前に腎生年月1日を研究する重要なモデルとなった。,3腎オルガノイドは、健康で病気の腎臓の発達を研究するための高度なモデルシステムを表す4.しかし、両方の方法の主な欠点は、どちらの方法も腎臓の主な機能である血液濾過を再現していないということです。腎血管系と腎血管系は、生体内開発の初期段階と同様に、腎オルガノイドおよび有機的培養で発達する。しかし、体外で形成された糸球体は血管5のままである。元生体胚性腎臓および腎組織性の血管化は、インビボ条件下でのみ移植実験において以前に実証された。例えば、マウス腎臓カプセルの下でヒト多能性幹細胞由来の腎オルガノイドを移植することにより、機能ステージ6へのオルガノイド中のネフロンの開発が可能になる。
純粋にインビトロ培養と生体内移植方法の中間的アプローチは、鳥類胚のCAMへの異種移植である。インタクトマウス腎臓原始の血管化は、このシステム77,88を用いて....
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プロトコル
動物のケアと手順は、実験動物の使用に関するフィンランドの国内法、実験およびその他の科学的目的のために使用される脊椎動物の保護のための欧州条約(ETS 123)、およびEU指令86/609/EECに従っていました。
1. 鶏CAM上でマウス胚性腎臓及び腎オルガノイドを培養するためのミニリザーバーの製造と異種移植実験の実施
- 6ウェルまたは12ウェルプレート用に設計されたトランスウェル細胞培養インサートを使用してください。
注: 特定の実験に応じて、大小のミニ貯蔵所を使用できます。最大8つの胚性腎臓を異種移植したり、同じ鶏の胚に複数のミニ貯蔵所を置いたりする場合(例えば、同じ鶏CAM上の実験および制御サンプル)に小さなミニリザーバーを使用するのが最善です。 - 円形の鋸刃または手鋸を備えた回転式マルチツールを使用して、挿入物の側面を切り取り、透過性膜が取り付けられた高さ2mmのプラスチックリングを作成します。
- メスや鋭利なナイフでこれらのミニ貯水池の端を磨きます。
- ミニ貯蔵器を70%エタノールで少なくとも1時間殺菌する。
- ミニリザーバーをオートクレーブされた二重蒸留水で洗い、薄層フードで乾燥させます。
- PBSおよび培養培地(高グルコースDMEM/10%FBS/1%ペニシリンストレプトマイシン)でミニリザーバをリンスします。
- ペトリ皿にリザーバ....
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結果
ここで提示されるCAM培養プロトコルは、鶏CAMの異種移植の結果として腎オルガノイドおよび胚性腎臓の高効率な血管形成を可能にした(図1、動画1)。培養培地を含むミニリザーバは、ドナー組織に栄養素を供給し、適切な血管化前の期間中に乾燥から保護した。この方法は、ドナー由来の内皮細胞が増殖するための寛容な条件を提供した。したがって、移植された腎臓およびオルガノイドにおける腎血管系は、主に、排他的ではないが、ドナー特異的細胞によって表された(図2B、C、F)。CFより成熟した糸球体血管系は、腎性素性培養よりもCAMに移植された腎臓および腎オルガノイドで得られた(図2D、E)。E
FiZDプロトコルは、高解像度共焦点顕微鏡を用いた、エキビボ胚性腎臓および腎オルガノイドの長期のタイム.......
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ディスカッション
古典的な腎性素培養法を改良し、血管化、拡張開発、および最適4D(すなわち、3D画像および時間)ex vivo胚性腎臓およびオルガノイドのイメージングを可能にする2つの詳細なプロトコルが提示される。このセクションでは、この方法の重要な手順を説明し、トラブルシューティングについて説明します。
他のCAM培養法とこの改良された鶏CAM培養法との有意な違いは、CAMへの胚性腎臓および腎臓オルガノイドの異種移植におけるカスタムメイドのミニリザーバーの使用である。変更されたトランスウェルインサートの膜底部は、サンプルを鶏CAMに対して押し付け、所定の位置に保ちます。挿入物の側面は、乾燥から移植片を保護する培養培地のための貯蔵所として機能する。この方法は、ミニ貯蔵所を配置することができるCAMのより広い領域を露出させ、血管化プロセス12、13に視覚的に従うことを容易にするので、13元ovo培養胚鶏CAMへの異種移植が強く推奨される。
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、スオメン・アカテミア(フィンランドアカデミー)(206038、121647、250900、260056)によって財政的に支援されました。センター・オブ・エクセレンス助成金2012-2017 251314、ムヌアイサテオ - フィンランド腎臓肝臓協会、シグリッド・ジュセリュクセン・セーティオ、ビクトリアスティフテルセン、フィンランドのスウェーデン文化財団、 ノボノルディスク、シェーパヤイェシュト(フィンランド癌学会)、欧州共同体第7枠組みプログラム(FP7/2007-2013;FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608)、H2020マリー・スクロスカ・キュリー・アクション・トレーニング・イノヴェーティナル・ネットワーク「RETRACT3著者らはポーラ・ハイプス、ヨハンナ・ケコラハティ=リヤス、ハンネレ・ヘルクマンの技術支援に感謝している。
図3、4、映画2は開発の許可を得て復刻される。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 調整可能なスペードドリルビット | ボッシュ | 2609255277 | 直径20mmの穴あけ用 |
| 自動エッグターナー | OLBA B.V.、オランダ | AT-42 | ex ovoセットアップ前の卵のインキュベーション用。 |
| セルインキュベータ | パナソニック | 13090543 | 温度を37°Cに設定。C、湿度90%、CO2 |
| 細胞インキュベーター | SANYO | 10070347 | Chicken CAM培養インキュベーター。温度は37°Cに設定されています。C、湿度90%、CO2 |
| Cellstar 6ウェルプレート | Greiner | M9062 | と一致するウェルの深さ16 mm |
| Dremel回転工具用丸鋸刃 | Dremel | SC690 | |
| 共焦点顕微鏡 | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell 透過性ポリカーボネートメンブレンインサート付きマルチウェルプレート | Corning | 10301031 | 6ウェルプレート用。40 &マイクロ;mの細孔のサイズ |
| 皿穴ドリルビット | Craftomat、Bauhaus | 22377902 | 磨くこと(20.5 mm、1/4 "、HSS) |
| のための使い捨て可能なガラス毛細管 | Blaubrand | 7087 33 | |
| 使い捨てメス | Swann-Morton | 0501 | |
| 解剖顕微鏡 | Olympus | SZ61 | |
| 鋭い機械 | Bosch | GSR 18 V-ECプロフェッショナル | |
| ダルベッコのモディファイドイーグルのミディア | シグマ | D777 | グルコース |
| 卵インキュベーターコンパクトS84 | バッハ、ドイツ | 8012 | exovoセットアップ前の卵のインキュベーション用。温度は38°Cに設定されています。相対湿度が60%以上に設定されたC |
| エタノール(70%) | VWR | ||
| 受精卵 | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | ゼルBBAD02200220#A1TBCMNZ#0# | 22x22 mm |
| ヒストアクリル接着剤 | ブラウン | 1050052 | |
| マトリゲル | コーニング | 356230 | |
| 上のインキュベータ | ーOkolab | 大胆なライン、カスタムメイド | |
| PBS -/- | コーニング | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | ミニリザーバーを洗浄します。 |
| ペニシリンとストレプトマイシン | シグマ | P4333 | |
| ポリスチレンビーズ | 小体 | 1000263-10 | 70 µ直径のm |
| ロータリーマルチツールシステム | ドレメル | 4000 | |
| んだごて | ウェラーTCP | S | 加熱ガラスキャピラリーも使用できます |
| Thincert 12ウェル細胞培養インサート 0.4 & マイクロ;m-pore ポリスチレンメンブレン | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6 ウェル細胞培養インサート 0.4 & micro;M孔ポリスチレンメンブレン | Greiner Bio-One | 657610 |
参考文献
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Nat....
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再版と許可
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