ここでは、線虫C.エレガンスにおける細胞タンパク質毒性ストレス応答を、蛍光転写レポーターの活性化を測定し、生理学的ストレスに対する感受性をアッテルすることによって特徴付ける。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
生物は環境の変動や細胞内恒常性の変化に晒されることが多く、タンパク質や生理学に有害な影響を及ぼす可能性があります。したがって、生物は損傷を修復し、恒常性を維持するために捧げられた標的と特定のストレス応答を進化させてきた。これらのメカニズムには、小胞体の展開されたタンパク質応答(UPRER)、ミトコンドリア(UPRMT)の展開されたタンパク質応答、熱ショック応答(HSR)、酸化ストレス応答(OxSR)が含まれる。ここで示すプロトコルは、線虫、C.エレガンスにおけるこれらの経路の活性化とその生理学的影響を検出し、特徴付ける方法を記述する。まず、経路特異的蛍光転写レポーターの使用について、迅速な細胞特性評価、薬物スクリーニング、または大規模な遺伝子スクリーニング(例えば、RNAiまたは変異型ライブラリー)について説明する。また、相補的で堅牢な生理学的アッセイが記載されており、これは特定のストレッサーに対する動物の感受性を直接評価するために使用することができ、転写記者の機能的検証として役立つ。これらの方法を組み合わせることで、細胞の迅速な特徴付けと、内部および外部のプロテオ毒性摂動の生理的効果を可能にします。
概要
生物が細胞内および細胞外環境の変化に対応する能力は、その生存と適応にとって極めて重要である。これは、細胞の完全性を確保する多数の保護経路を介して細胞レベルで達成される。多くの細胞成分がストレス関連の損傷を受ける一方で、細胞ストレス応答の主な関与の1つは、細胞プロテオームの恒常性を修復し、保護することです。しかし、タンパク質をオルガネラと呼ばれる特別な構造に分体化することは、細胞内のすべてのタンパク質が適切に折り畳まれ、機能することを保証するために、1つの一元化された形態のタンパク質品質管理に頼ることができないため、細胞にとって課題となっています。したがって、タンパク質の摂動に対処するために、オルガネラは、誤って折り畳まれたタンパク質を感知し、そのコンパートメント内のストレスを軽減しようとしてストレス応答を活性化することができる専用の品質管理メカニズムを進化させました。例えば、細胞質は熱ショック応答(HSR)に依存し、小胞体(ER)およびミトコンドリアはコンパートメント特異的に展開されたタンパク質応答(UPR)に依存する。OxSRは活性酸素種(ROS)の毒性作用を緩和する役割を果たす。各ストレス応答は、細胞の課題と環境侮辱の存在下で引き起こされ、調整された転写応答を誘発する。これらの応答の特徴は、適切なオルガネラに標的となる誤って折りたたまれたタンパク質(シャペロンなど)を再折り畳む分子を合成すること、またはタンパク質分解によって損傷したタンパク質を除去することを含む。これらのストレス応答を活性化しないと、損傷したタンパク質の蓄積、....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
1. 温度の標準的な成長条件 & OP50 対 HT115
- 標準の成長と拡大
- OP50の培養物をLB(表1)または周囲温度(〜22〜25°C)で24〜48時間の場合に選択した同等の培地で成長させます。OP50として室温で細菌を成長させるのはウラシル・オーソストロフであり、37°Cで増殖した場合の戻り物(例えば、サプレッサー変異体)の発生率が高い。OP50培養物の長期保存は推奨されません(4°Cで最大1週間)。
- 実験のために動物を拡大するために100mmプレートに100mmの培養物と1mLの飽和OP50培養を維持するために、飽和OP50培養液の体積を60mm NGMプレート(表1)にシードします。
- ベンチトップで皿を一晩乾かします。
注:100 mmプレートは、特に非通気プレートを使用する場合は、乾燥するためにより多くの時間が必要な場合があります。すべてのC.エレガンプレートを4°Cに保管した気密容器に保管してください。プレートの乾燥が発生するので、6ヶ月以上前のプレートを使用しないでください, これは、プレートの異なる浸透圧と硬さのためにプレート上の動物の生理学を変更します. - 標準的な維持のために、10-15の若い動物(卵、L1、またはL2段階)を60mmプレートに移動させるが、より低い胎児性を有する突然変異体またはトランスジェニック動物を....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
転写レポーターを使用したストレス応答の活性化測定
ここでは、蛍光転写レポーターが使用され、C.エレガンスのほとんどのストレス応答の活性化を測定するための堅牢なツールとして機能します。GFP発現は、コンパートメント固有のストレスへの対応に関与するマスター転写調節因子の正規標的のプロモーターの下で駆動される。一般的に使用される転写記者の包括的なリストは、表3に記載されています。
ER恒常性を乱すタンパク質や脂質二重層ストレスを介してER恒常性を乱すと、ER(UPRER)の展開されたタンパク質応答が活性化し、ERの品質と機能を回復させます。UPRERは、膜貫通センサーによって定義される3つの異なる分岐から構成されています:イノシトールを必要とするタンパク質1(IRE1)、活性化転写因子6(ATF6)、およびプロテインキナーゼ.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
ここでは、C.エレガンスにおける細胞ストレス応答を問い込む方法、蛍光転写レポーターおよび生理学的ストレス生存アッセイを用いて説明する。レポーターは、細胞ストレス応答の取り付けに関与する転写因子の下流転写標的のプロモーターの下で駆動されるGFP発現を利用する。Hsp-4p::GFPは、XBP-1s媒介UPRERによって変調され、hsp-6p::GFPはATFS-1媒介UPRMTによって制御され、gst-4p::GFPはSKN-1媒介性OxSRの下で、hsp16.2p::GFPとhsp-70p:GFP:HSF反応の下で説明される。他の標準化された転写レポーターは、表3に記載されています。ここで発表されたすべての転写記者は広いダイナミックレンジを有し、遺伝的摂動またはストレス誘発化学物質への暴露のいずれかを通じてストレスを適用することによって堅牢に活性化することができる。さらに、これらのレポーターは、採用したプロモーターの上流の転写因子のノックダウンによってす.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
R.BZ。EMBO長期フェローシップとラリー・L・ヒルブロム財団の支援を受けています。R.H.Sは、国立老化研究所(NIA)とグレン医学研究博士研究員財団を通じて5F32AG032023-02を助成金で支えています。A.F.は、NIAを通じてF32AG051355を付与することによってサポートされています。H.K.G.は、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムを通じて、DGE1752814の助成金によって支援されています。M.G.M.は1F31AG060660-01からNIAまでサポートされています。A.D.はトーマスとステイシー・シーベル財団、ハワード・ヒューズ医学研究所、NIAから4R01AG042679-04および5R01AG05891-02、およびNIEHSから5R01ES021667-09によってサポートされています。ラリー・ジョー、メリッサ・サンチェス、ナーメ・ケレット、アネル・エスキベルに対し、重要な技術支援をよろしくお願いします。私たちは、モリモト研究所とCGC(研究インフラプログラムP40 OD010440のNIH事務局が出資)に対して、株に感謝します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アンチマイシン A | シグマ・アルドリッチ | A8674 | ミトコンドリアストレス |
| 用 バクト・ペプトン | ・フィッシャー 科学 | DF0118072 | NGMプレート用 |
| BD Difco 粒状寒天 | VWR | 90000-782 | NGMプレート |
| 塩化カルシウム二水和物 | VWR | 97061-904 | NGMプレート用 |
| カルベニシリン | バイオパイオニア | C0051-25 | RNAi用 |
| コレステロール | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGMプレート用 |
| COPASバイオソーター | ユニオンバイオメトリック | 350-5000-000 | 488nmの光源を装備。 |
| COPAS洗浄液 | ユニオンバイオメトリック | 300-5072-000 | COPAS |
| シース溶液 | ユニオンバイオメトリック | 300-5070-100 | COPASと一緒に使用する |
| シ | グマ-アルドリッチ | 472301薬 | 用溶剤 |
| IPTGジオキサンフリー | デンビルサイエンティフィック | CI8280-4 | RNAi |
| LBブロスミラー | ッシャーサイエンティフィック | LB | |
| M205FAステレオスコープ | BP1426500 | ライカ | 10450040、ライカDFC3000G単色CCDカメラ、標準ライカGFPフィルター(ex 395-455、EM 480 LP)、LAS Xソフトウェアを装備 |
| NGMプレート用 | 硫酸マグネシウム七水和物 | VWR | EM-MX0070-3 |
| 酸化/ミトコンドリアストレス用 | Paraquat | Sigma-Aldrich | 36541 |
| 塩化カリウム | 漂白剤用 | フィ | ッシャーP217-500 |
| リン酸カリウム二塩基性 | VWR | EM-PX1570-2 | NGMプレート用 |
| リン酸カリウム一塩基性 | VWR | EM-PX1565-5 | M9 |
| 用 回転 | ECHO | 75990-514 | リンパス4x Plan Fluorite NA 0.13対物レンズ、標準オリンパスFITCフィルター(ex 470/40; em 525/50;DM 560)、およびカメラおよびECHOソフトウェアを駆動するためのiPad Pro |
| Sigma-Aldrich | 71289-50G | ||
| NGMプレート用の塩化ナトリウム | EMDミリポア | SX0420-5 | 、M9 |
| ナトリウム二塩基性 | VWR | 71003-472 | |
| 酸化ストレス | |||
| 用のM9 Tert-ブチルヒドロペルオキシドSigma-Aldrich 458139 | RNAiツ | Sigma-Aldrich | T7660-5G |
| ERストレス用 | Sigma-Aldrich | T7765-50MG |
参考文献
- Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A Futile Battle? Protein Quality Control and the Stress of Aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
