方法論記事

骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する

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DOI：

10.3791/61002

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2020年5月7日

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1Department of Physiology, Amsterdam UMC, 2Department of Kinesiology and Physical Education, Faculty of Education, McGill University, 3IONOptix BV

この記事について

サマリー

ここで提示されるプロトコルは、ナノニュートン分解能を有する線条筋筋筋線維の収縮特性を評価する。このプロトコルは、干渉法ベースの光学力プローブを用いたセットアップを採用しています。この設定は、高い信号対雑音比を持つデータを生成し、myofibrilsの収縮運動の評価を可能にします。

要約

ヒトや動物の活動には、線条筋細胞が不可欠です。単一の筋線維は、筋の中で最も小さい収縮ユニットである連続的に連結されたサルコメアで構成される筋線維で構成される。肉体機能障害は、肉体タンパク質をコードする遺伝子の変異を有する患者の筋力低下に寄与する。筋線維力学の研究は、単一の筋線維の収縮性を測定する際に損傷を受けた隣接する筋線維の潜在的な交位効果なしにアクチンとミオシン相互作用の評価を可能にする。筋線維の超構造的損傷および不整列は収縮性の障害に寄与する可能性がある。筋細動体に構造的損傷が存在する場合、分離手順中または実験中に壊れる可能性が高い。さらに、myofibrilsの研究は、サルコメアの幾何学的制約の存在下でのアクチンとミオシン相互作用の評価を提供する。例えば、筋線維の測定は、筋膜機能不全が肉体タンパク質の突然変異の主な効果であるかどうかを解明することができる。さらに、カルシウム溶液または化合物の灌流は、ミオフィブリルの小径のためにほぼ瞬時に行われる。これは、筋線維は、力の生産中に活性化および弛緩の速度を測定するために非常に適しています。本論文に記載されたプロトコルは、ナノニュートンの範囲で力を測定することができるファブリー・ペロ干渉計の原理に基づく光学力プローブを採用し、ピエゾ長モータと高速ステップ灌流システムと組み合わせる。このセットアップは、高分解能測定で筋知見力学の研究を可能にする。

概要

線条筋細胞は日常生活に欠かせないものです。四肢の動き、呼吸機能、心臓のポンピング運動は、筋肉細胞によって生成される力に依存する。骨格筋は、単筋線維の束を含む筋の筋線維からなる(図1A)。これらの筋線維は、連続的に連結されたサルコメアによって形成される筋線維で構成される(図1B,D)。サルコメアには薄くて厚いフィラメントが含まれています。これらは主にアクチン分子とミオシン分子の鎖から成り、それぞれ(図1B)。アクチンとミオシンの相互作用は、筋肉の力を発生させる能力を担っています.肉リン、アクチン、トロポニンTなどの肉体タンパク質をコードする遺伝子の変異を有する患者は、収縮性機能不全1による筋力低下に苦しんでいる。

筋肉の収縮の質は、生体内の筋肉全体からインビトロ運動アッセイにおけるアクチンミオシン相互作用に至るまで、組織の様々なレベルで研究することができます。過去数十年の間に、いくつかの研究グループは、個々のmyofibrils,,,,,22、3、4、5、6、7、8、9、103,4の契約性を決定するためのセットアップ9を10開発しました。5678これらの設定は、ミオフィブリルの収縮によって引き起こされるカンチレバーからのレーザー偏向(すなわち、光ビーム偏向)の変化の検出に基づいている(詳細については、Labudaら11参照)。myofibrilsの収縮機能を決定することはいくつかの制限を有するが(例えば、筋原線維の上流にある励起収縮結合過程のダイナミクスが欠けている)、このアプローチには複数の利点がある。これらには、1)サルコメアの幾何学的制約の存在下でアクチンとミオシンの相互作用を評価する能力が含まれる。2)損傷の潜在的な交交効果なしにアクチンミオシン相互作用を評価する能力、隣接する筋線維(単一の筋線維の収縮性を測定する場合、筋線維の超構造的損傷およびミスアライメントが収縮障害に寄与する可能性がある)(図1D);3)筋線維の小径(〜1μm、図2A)および膜の欠如は、サルコメアへのほぼ瞬時のカルシウム拡散を可能にする。さらに、筋細柱に構造的な損傷が存在する場合、それらは孤立中または実験中に壊れる可能性が高い。したがって、筋線維性収縮性を評価することは、筋肉収縮の基本的なメカニズムを研究し、障害のあるアクチンとミオシンの相互作用が肉体タンパク質の突然変異によって引き起こされる筋肉疾患の主な原因であるかどうかを理解するためのエレガントな方法です。

このプロトコルは、ナノニュートン分解能(すなわちOptiforce)を用いたカンチレバー力プローブを組み込んだmyofibrilsの収縮性を決定するために新しく開発されたセットアップを提示する。この力プローブは、干渉法の原理に基づいています。干渉測定は比較的堅い片持ち面の使用を可能にする。これにより、カンチレバーの偏向が少なく、ミソフィブリルの等方体収縮に近づく力を測定することが可能になる。このプローブは、人間の被験者を含む異なる筋肉生検から分離された単一の筋線維性によって生成される低受動および活動的な力を高いシグナル対雑音比で評価することを可能にする。このセットアップに組み込まれた光学カンチレバー力プローブは、ファブリ・ペロ干渉計12に基づいています。干渉計は、フェルールに取り付けられた光ファイバと金被覆のカンチレバーとの間の小さな変位を検出する(図3)。光ファイバーとカンチレバーの間のギャップは、ファブリ・ペロキャビティと呼ばれます。Myofibrilsは2つの接着剤コーティングされたガラス取り付け繊維を使用して、プローブとピエゾモーターの間に取り付けられます。ミオフィブリルによって生じる力は、干渉計データから数学的に導き出すことができる。干渉法は、2つ以上の波の重ね合わせまたは干渉に基づいています(このセットアップでは3つの光波)。波長が1,528.77~1,563.85nmのレーザー光は干渉計から放射され、光ファイバを通して送られます。プローブでは、光は光ファイバと媒体の間の界面で反射される(図3A)。2)媒体およびカンチレバーのインターフェイスで(図3B);3)カンチレバーの金属と金のコーティングの間の界面で(図3C)。インターフェイス A および B での反射は、プローブが沈み込む媒体の屈折率(n)に依存します。3つの重ね合わせ反射からなる光は、干渉計のフォトダイオードに戻ります。フォトダイオードは、光の強度を測定し、これは3つの重畳反射の干渉パターンの結果である。収縮力が筋炎を活性化または伸ばすことによって生成されると、ミオフィブリルはカンチレバーを引っ張る。この動きは、キャビティサイズ(d) を変更し、その結果、空洞に収まる波長の数を変更します。片持ち面で反射した光は相が異なり、異なる干渉パターンが生じます。フォトダイオードは、この干渉パターンの強度の変化をボルトの変化として記録します。続いて、ミオブリル力の生成は、片持ち剛性を考慮して、この変化から計算される。力プローブは、取り付け針の先端を押し、片持ちの自由手渡し端に取り付け、カンチレバーの曲げを読み出しレーザー13の波長の倍数に保ちながら計量スケールに対して製造業者によって較正される。したがって、干渉法は、ナノニュートン分解能で力の測定を可能にする、距離の小さな変化を検出する非常に敏感な方法です。この分解能により、高い信号対雑音比を持つ筋線維力の評価が可能になります。従来の干渉法では、測定範囲が干渉曲線の線形部分に制限されますが、ロックインアンプとレーザー波長の変調を使用すると、この制限を克服します14。これについては、ディスカッションのセクションで詳しく説明します。

ミオフィブリル活性緊張を測定するために、高速ステップ灌流システムを組み込んで、ミオフィブリルをカルシウム溶液に曝露した(図4A)。高速ステップ灌流システムは10 msの範囲内で起こる解決の変更を可能にする。その小さな直径のために、マイフィブリルへのカルシウム拡散はほぼ瞬時です。したがって、このシステムは、活性化および弛緩中の放出中のアクチン-ミオシン結合の速度を測定するのに特に適している。活性化率(kACT)および弛緩(kREL)は、活性化緩和曲線から決定することができる。また、濃度を高めるカルシウム溶液にミオブイブリルを曝露することにより、力とカルシウムの関係とカルシウム感受性を決定することができる。

さらに、ピエゾ長モーターは、筋形筋の速い伸縮および短縮を可能にする。これは、筋線維性の粘弾性特性(すなわち、受動的緊張)を研究する可能性を提供するとともに、筋線維の急速な短縮および再伸縮を行い、緊張再発達率(kTR)を決定する。活性および受動緊張実験の両方から得られるパラメーターは、肉体タンパク質の遺伝子変異によって変化させることができる。

このカスタム構築されたセットアップは、健康な人間、患者、およびマウス骨格筋から分離されたmyofibrilsのアクティブおよび受動的な収縮特性を測定するために使用されました。

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プロトコル

ヒト生検を得るための議定書は、VU大学医療センター(#2014/396)の機関審査委員会によって承認され、被験者から書面によるインフォームド・コンセントが得られた。動物の筋肉の生検を得るためのプロトコルは、VU大学の地元の動物倫理委員会によって承認されました (AVD114002016501)

1. 準備と筋整ブリルの分離

注:生検をグリセリン化する、異なるカルシウム濃度(pCa)溶液7、16、1716,17を調製し、筋線維722、1818を分離する前に説明した方法を使用します。

  1. リラックス(pCa 9.0、Rx)および活性化(pCa 4.5、Act)溶液ならびに阻害剤(1 M E64、1 M DTT、1 Mロイペプチン、1 M PMSF)を解凍し、-80°Cで保存する。
  2. 約1mm3 の縞状筋生検のグリセリン片を取り、1:1 Rx /グリセロール(v/v)溶液で小さなペトリ皿に入れ、ペトリ皿を4°Cの冷たいプレートに置きます。
  3. 解剖顕微鏡と鉗子を使用して筋肉の一部を解剖し、単一の筋線維を筋肉の部分から分離せずに分離する。
    注:できるだけ多くの脂肪と結合組織を除去して、マイオブリル懸濁液の汚染を防ぎます。
  4. 解剖した組織の一部を、1.5 mLの抑制剤(1μL/mL E-64、1 μL/mLロイペプチン、1 μL/mL DTT、125 μL/mL PMSF)のリラックス液を含む5 mLチューブに移します。組織を約4°Cで1時間焼き戻す。
  5. インキュベーション中に、両方の PC を起動し、デバイスの電源を入れ、関連するソフトウェアを開きます ( 資料一覧を参照)。
  6. ペトリ皿に超純水に力プローブを沈め、プローブを較正します。
    1. 干渉計の [スタート ウィザード] を押して、画面の指示に従います。 キャリブレーションを押した後、顕微鏡のステージをタップします。
      注:顕微鏡のステージをタップすると、片持ちが偏向し、フリンジを通過します。これにより、プローブのキャリブレーションが可能になります。
    2. キャリブレーション後、ペトリ皿の超純水にプローブを水没させます。
  7. ピエゾモーターの位置を初期化します。これを行うには、以下の手順のいずれかに従います。
    1. ピエゾモーターをkTR 張力に使用する場合は、長さを0μmに設定します。
      信号発生器の設定は、表1、図5Aにあります。
    2. 圧電モーターを受動的な張力に使用する場合は、長さを50μmに設定します。
      信号発生器の設定は 、表1にあります。
      注:ステップ間の違いは、ピエゾ長モーターの初期位置です。筋形筋を伸ばすために、ピエゾモーターは両方の取り付け針間の距離を増加させ、筋形筋を長くするために引っ張る必要があります。筋形筋を緩めるために、ピエゾモーターは両方の取り付け針間の距離を短くし、筋形筋を短くするために押す必要があります。
  8. 顕微鏡スライドを準備します。ピペット150 μLのポリヒドロキセチルメタクリレート(ポリヘマ)溶液(95%エタノールで5%ポリHEMA、w/v)を顕微鏡スライドにスライドさせてスライド全体に広げ、すべてを覆います。
    注:ミオブリルサスペンションがコーティングされていない顕微鏡スライドにピペットとして入っている場合、底に沈む筋細BRILSは顕微鏡スライドに貼り付け、接着することはできません。
  9. スポイジをpCa溶液( 図4A参照)で充填し、灌流システムをプライムします。
    注:これらの手順では、すべてのチューブは、すべての気泡がチューブから取り除かれ確認するために適切なソリューションで事前に充填されています。
    1. フローチャンババックグラウンドフローの流入管(図3、4A)をRxで埋めます。
    2. 使用する場合は、空気を除去するために超純水でマニホールドを洗い流します。これを行うには、超純水とのシリンジを出口に接続し、逆方向にフラッシュします。マニホールドの未使用ポートをブロックします。
    3. 各pCaシリンジを有効にして、それぞれのチューブをpCa溶液で満たします。次に、マニホールドとƟガラスに接続します。
    4. データ取得パネルソフトウェア (表を参照) でバルブ 1 と 6 を開き、ボタン '1+6' (図 6A) をチェックして、Ɵガラスが充填されたときに Ɵ ガラスをリラックス (pCa 9.0) およびアクティブ化 (4.5) のソリューションと閉じたバルブで満たします (図 6B)。

2. ミオブリルの取り付け

  1. 顕微鏡スライドにポリHEMAを塗布して、マイオブリブリルがガラスに付着するのを防ぎます。
  2. 組織均質化のためにホモジナイザー( 材料表を参照)を準備します。内部ローターロッドをきれいなティッシュペーパーで洗浄し、ホモジナイザーを組み立て、15sのアルコールで1倍回転し、超純水でそれぞれ15s回転させます。ホモジナイザーをリラックス液1 xで氷上15sにプリリンスする。
  3. ステップ1.4に記載されているように、筋肉組織を含むチューブにホモジナイザーロッドを入れ、チューブを氷上に保ちながら、ローターをスピード5で15s回転させ、筋肉組織を引き裂き、筋肥線維懸濁液を得る。
  4. ピペットは、組織浴中にポリHEMAでコーティングされた顕微鏡スライド上のミオフィブリル懸濁液と〜250μLの緩和溶液のピペットを含む。これは液体の低下を形成します。ほこりから保護するために蓋でお風呂を覆い、5〜10分待って、myofibrilsが底に沈むのを待ちます。
    注:サスペンションとリラックスした溶液の比率は、分離の品質に依存するため、それに応じて調整されます。例えば、ミオフィブリル収率が低く、懸濁液に適切なミオフィブリルが少ない場合は、ミオフィブリル懸濁液を追加し、リラックス性の溶液(例えば、75μLのミオフィブリル懸濁液および225μLのリラックス液)で希釈する。心臓および骨格筋組織は、その線条体パターンのために認識しやすいです。10xまたは40xの目的を使用して、このパターンは単一のミオフィブリルでも見える。他の組織が懸濁液中に存在する場合、筋線維は視覚的に選択することができる。5~10分の待ち時間をスキップできます。しかし、これはミオブリルを接着する難しさを増加させます。
  5. 接着剤(シェラック+エタノール;70%エタノールの2 mLで120mgのシェラック)を取り付ける針をコーティングします。これを行うには、接着剤を65°Cで30~60秒、ピペットを6μLの新しいコーティングされていないガラススライドに加熱します。接着剤の各取り付け針の先端を浸し、接着剤の層が見えるまで繰り返します。顕微鏡のステージ上に組織浴を置くスペースを作るためにマイクロマニピュレーターと垂直にプローブとピエゾを上に移動します。接着剤が入っているガラススライドを取り外します。
  6. マイフィブリルの取り付け
    1. ミヒブリ懸濁液を含むポリHEMAでコーティングされた顕微鏡スライドを顕微鏡ステージに置いて組織浴を置きます。ステージを使用して、40xの目的を持つ適切なミオブリルを見つけてください。必要に応じて、組織浴を移動して回転させて、ミオブリルを取り付け可能な位置に移動させます。
      注:約30μmの目に見える線種パターンを持つmyofibrilsを探してください。ステップ3.1および3.2.1の詳細に説明するように、筋の溶出前に長さとサルコメアの長さを確認することが可能である。これらは収縮中に壊れる可能性があるので、引き裂かれた筋線維を接着しないでください。
    2. フローチャンバーを組織浴内のmyofibrilsを含む液体ドロップのすぐ上の位置にスライドさせ(ステップ2.4でスライドにピペット化)し、下げます。それが液体の落下に当たる前に停止します。
    3. ピエゾ取り付け針を下げ、ミオフィブリルの下端に押します。ミオブリルが針に取り付けられているかどうかを確認するために少し持ち上げます。
    4. プローブがフローチャンバーに触れることなく、プローブの取り付け針が底に到達するのに十分な距離を流れチャンバーを下げます。
    5. ミヒブリルの上端にあるプローブの取り付け針を押します。ミオブリルが針に取り付けられているかどうかを確認するために少し持ち上げます。
    6. 目的がガラスの底に触れることなく焦点を合わせることなく、可能な限りお風呂の底からミオフィブリルを持ち上げます。

3. 実験の初期化

  1. マイクロマニピュレータ、カメラ、およびシステムコントローラソフトウェアを使用して (図7A、 材料表を参照)、サルコメアの長さを測定します。ピエゾまたはフォースプローブを動かして、ミオフィブリルの初期サルコメア長さを2.5μmに設定します。
    注意:2.5 μmのサルコメア長は、ミオシンヘッドとアクチンの間で最適なオーバーラップを保証します。
  2. システムコントローラソフトウェアの容器機能を使用して、ミオフィブリルの長さと幅を測定する(図7B、C)。C
    メモ:カメラを回転させると、水平または垂直に傾くことがあります。カメラの位置合わせを確認するために、カメラが回転し、傾いていないことを確認するために、精神レベルを使用することができます。
    1. 顕微鏡ステージを使用して、ビデオ画像の中央にミオブリルを配置します。
    2. ミオブリルの片側からもう一方の側に正方形を描きます。画像処理はコントラストに基づいているため、長さについては、必ず、接着剤の液滴の暗いエッジ (図 2A)を正方形に含めます。
    3. システム コントローラ ソフトウェアのデータの記録を開始し(一覧表を参照)、システムコントローラのソフトウェア データ記録を 5 時間中断して [一時停止] ボタンを押します。これで、長さがデータに記録されます。
    4. 幅については、まずカメラを 90° 回転させて (「 表」を参照) してから、ミオブリル自体のエッジのコントラストを使用します。
    5. システム コントローラ ソフトウェアのデータの記録を開始し( 一覧表を参照)、開始ボタンを押して、5 s の後にシステム コントローラ ソフトウェアのデータ記録を一時停止 します。これで、幅がデータに記録されます。
  3. 筋のアクティブな張力を決定する必要がある場合は、灌流のセットアップを使用する必要があります。その場合は、ステップ 3.4 に進みます。受動テンションだけが決定される場合は、ステップ 3.4 ~ 4.1.3.7 をスキップして、ステップ 4.2 に進みます。
  4. 灌流セットアップを配置し、初期化します。
    注: これは、アクティブな力を生成する場合にのみ必要です。受動テンション実験を行う場合は、ステップ4.2に進みます。
    1. 高速ステップモーター位置を4 Vに設定します(図5B)。
    2. テーブルの上にペフュージョンスタンドをスライドさせて、スタンドの左下隅をテーブルの上のテープに合わせます。
      注:フォースプローブやピエゾモーターに当たらないように注意してください。
    3. マニピュレータを使用して、Ɵガラスを目で大まかに配置します。
    4. 接眼を見て、マニピュレータを使用してƟガラスをミオフィブリルに向かって慎重に動かします。
    5. Ɵガラスの上部チャネルをマニピュレータを使用してmyofibrilと位置合わせし、高速ステップ(信号発生器の設定は表1)をシステムコントローラソフトウェアで実行して位置を確認します(図2B–C、表を参照)。
      注: ファストステップのアクティベーションフェーズ中に、ボトムチャネルが myofibril と一致していることを確認します (図 2B–C)。
  5. Rx (図 4A)のバックグラウンド フローをオンにして、流れチャンバ内に層状のバックグラウンド フローを作成します。
    注: バックグラウンド フローは、Ɵ ガラスからの pCa 溶液の流れの結果として乱流を防ぐために必要です。
    1. ルーアーバルブレバーで流れチャンバの流入をオンにします。
      1. 流れチャンバの排水を開始し、フローチャンバーのオーバーフローを防ぐために流出ポンプに次のパラメータを送信します(図9):バルブ = バスバルブ(2)。マイクロステップモード=マイクロ;プランジャーターゲット = 48,000;プランジャ速度 = 38-40 (任意)。
        注: 常に流体レベルが安定していることを確認してください。ミオブリルは乾燥して走るべきではありませんし、カンチレバーもしないでください。流れが少なすぎるよりも、少しオーバーフローする方が良いです。
  6. 熱電温度コントローラで温度を希望の値に設定するには(図8、材料表を参照)、希望する温度を入力し、Start'を押します。熱電温度コントローラソフトウェアのグラフを確認して希望の温度に達するまで待ち、続けてください。
    メモ:室温で実験を行う場合、熱電温度コントローラを使用する必要はありません。

4. 実験プロトコル

  1. どのアクティブな強制プロトコルを実行する必要があるかを決定します。
    注:研究に必要なデータに応じて、複数のタイプのアクティブフォース実験を行うことができます:ステップ4.1.1、飽和時の最大力の測定[Ca2+];ステップ 4.1.2, ステップ 4.1.1 に加えてカルシウム感受性を決定する Force-pCa 曲線を取得します;;ステップ 4.1.3, ステップ 4.1.1 または 4.1.2 に加えて短縮再伸縮プロトコルを行うことによって、テンション再開発の速度を決定します。
    1. 最大の活性力を測定します。
      1. システム コントローラ ソフトウェアでデータの記録を開始します ( 資料表を参照) をクリックして、 '開始' を押します。
      2. データ取得パネルでバルブ 1 と 6 を開き (材料表を参照)、ボタンをチェックしてボタン '1+6' をチェックして、リラックスした溶液のƟガラスの流れを開始し、Ɵガラスを通してソリューションを活性化します (図 6A)。
      3. 干渉計の上で [ 範囲のリセット ] を選択して押して、基線力が 0 V になるように干渉計の範囲をリセットします ( 材料表を参照)。
      4. 力のトレースが安定したら、Ɵガラスのファストステップ(ステップサイズ= 100 μm)を実行します。
        信号発生器の設定は、表1(図5C)にあります。図4Dに類似した活性化緩和トレースが記録され、システムコントローラソフトウェアに表示されます。
      5. [一時停止] ボタンを押して、システム コントローラ のソフトウェア データの記録を一時停止します。
      6. これ以上の活性化を行わない場合は、バルブ 1 と 6 を閉じてボタンのチェックを外してƟガラスの流れを止めます (図9、 材料表) を押して終了'を押してバックグラウンドフローを停止します。
    2. フォース-pCa曲線
      注:これは、ステップ4.1.1に似ていますが、異なるpCaソリューションを使用して複数のアクティベーションを行う場合は、最大のアクティブフォースを得ます。
      1. システム コントローラ ソフトウェアでデータの記録を開始するには、 Startを押します。
      2. データ取得パネルソフトウェアでバルブ1と2を開き、Ɵガラスを通してリラックスした溶液とpCa 6.2の流れを開始します。
      3. 干渉計の 「範囲をリセット」を選択して押すことで、干渉計の範囲をリセットして、ベースラインの力が 0 V になるようにします。
      4. 力のトレースが安定したら、Ɵガラスのファストステップ(ステップサイズ= 100 μm)を実行します。
        信号発生器の設定は 、表1にあります。
      5. [一時停止] ボタンを押して、システム コントローラ ソフトウェアを一時停止します。
      6. バルブ 1 と 3 (pCa 5.8)、バルブ 1 と 4 (pCa 5.6)、バルブ 1 と 5 (pCa 5.4)、バルブ 1 および 6 (pCa 4.5) について、ステップ 4.1.2.1 ~4.1.2.4 を繰り返します。
      7. これ以上の活性化を行わない場合は、バルブ1と6を閉じて、ボタンのチェックを外してƟガラスの流れを止めます(図9)を押してシリンジポンプ(図9)を止め、Luerバルブを閉じてバックグラウンドフローを停止します。
    3. 緊張再開発の測定率 (kTR).
      注: これは、最大アクティブフォースのステップ 4.1.1 に似ていますが、いくつかの変更と追加のステップがあります。
      1. ミオフィブリルを15%緩めるために必要なピエゾ運動を計算し、この値を信号発生器に入力する(図5D、表1)。
      2. 'Start'を押して、システム コントローラ ソフトウェアでデータの記録を開始します。
      3. データ取得パネル(図6A)でバルブ1と6を開き、リラックスした溶液とpCa 4.5の流れをƟガラスを通して流れ始める。
      4. 干渉計の 「範囲をリセット」を選択して押すことで、干渉計の範囲をリセットして、ベースラインの力が 0 V になるようにします。
      5. 力のトレースが安定したら、Ɵガラスのファストステップ(ステップサイズ= 100 μm)を実行します。
        信号発生器の設定は 、表1にあります。
      6. 力高原に達したら、ピエゾで短縮再伸縮を行う。
        信号発生器の設定は(図5D、表1)にあります。図 4Eに類似した活性化緩和トレースが記録され、システム・コントローラー・ソフトウェアに表示されます。
        注: カスタム プロトコルを作成して、上記の手順を自動化できます。
      7. [一時停止] ボタンを押して、システム コントローラ ソフトウェアを一時停止します。
      8. これ以上の活性化を行わない場合は、バルブ1と6を閉じて、ボタンのチェックを外してƟガラスの流れを止めます(図9)を押してシリンジポンプを停止し、LuerバルブをTerminate閉じてバックグラウンドフローを停止します。
  2. 受動力測定を行います。
    1. 連続的なストレッチを実行します。
      1. ミオフィブリルを伸ばすために必要なピエゾ運動を計算し、この値を信号発生器に入力する(表1)。
        注: 設定の例を示します。サルコメアの長さに対するストレッチの量とストレッチ時間を計算します。これらの設定は、サルコメア当たりの伸張速度がmyofibrils全体で等しく保たれるようにするために必要です。
      2. 'Start'を押して、システム コントローラ ソフトウェアでデータの記録を開始します。
      3. 干渉計の 「範囲をリセット」を選択して押すことで、干渉計の範囲をリセットして、ベースラインの力が 0 V になるようにします。
      4. ピエゾを操作するには、システムコントローラソフトウェアの信号発生器で連続ストレッチを実行します。信号発生器の設定例は 、表1にあります。
      5. ストレッチが終了した後、ピエゾで筋の長さにミオフィブリルを短くする(表1)。
    2. 段階的なストレッチを実行します。
      1. 'Start'を押して、システム コントローラ ソフトウェアでデータの記録を開始します。
      2. 干渉計の 「範囲をリセット」を選択して押すことで、干渉計の範囲をリセットして、ベースラインの力が 0 V になるようにします。
      3. システムコントローラソフトウェアで信号発生器を使用して段階的にストレッチを実行し、piezoを操作します。信号発生器の設定例は、表1(図5E)にあります。
    3. ストレッチが終了した後、ピエゾで筋炎の長さにミオフィブリルを短くします。信号発生器の設定例は 、表1にあります。
  3. [一時停止] ボタンを押して、システム コントローラ ソフトウェアを一時停止します。
  4. システム コントローラ ソフトウェアの [停止] ボタンを押して、データの記録を停止します。
  5. システム コントローラ ソフトウェアで [ファイル] および [ データの保存 ] を押して、データを保存します。

5. クリーニング

  1. 測定したミオブリルを取り除き、次のミオブリルに備えます。
    1. これを行うには、慎重に40xの目的で眼を見ながら、myofibrilを引き裂きます。
    2. フォースプローブとピエゾを上に移動します。Ɵガラスを上に、右に、そして後ろに移動します。その後、上に移動し、フローチャンバーを離れてスライドします。ティッシュバスを取り除きます。
    3. 取り付け針をきれいにするには、10xと眼を使用して焦点を合わせます。ブラシをエタノールに浸し、慎重にブラシを切り落とし、針から接着剤を取り除きます。
      注: 接着剤が外れるまでには、しばらく時間がかかる場合がありますのでご注意ください。
    4. 流れチャンバーとティッシュバスを超純水ですすいでください。
    5. 超純水で満たされた小さなペトリ皿にプローブを置きます。プローブが完全に水中に入っていることを確認します。
  2. 実験が完了したら、上記の手順でセットアップをクリーニングし、次の追加手順を実行します。
    1. フローバスからチューブを空にします。パラメータを流出シリンジポンプに送信します( 材料表、 図9を参照)。バルブ=バスバルブ(2);マイクロステップモード = ノーマル;プランジャーターゲット = 0;プランジャー速度 = 30.
      注: チューブが空の場合は、コマンドを終了します。
    2. ポンプを数回初期化します (図 9B)。
    3. 注射器を水切りします。これを行うには、すべてのルアーバルブを閉じ、すべてのバルブを開き、注射器の針からチューブを取り出し、特定のpCaのチューブを針の下に保持し、Luerバルブを開きます。圧力プラグを使用してプロセスをスピードアップします。
    4. チューブを注射器の針に取り付け直します。注射器に約5mLの超純水を充填します。Ɵガラスの下にカップを置きます。すべてのバルブを開き、圧力バルブを開いてシステムをフラッシュします。
    5. システムをシャットダウンします。PC、干渉計、および圧電コントローラの電源ブロックをオフにします。

6. データ分析

  1. データ ファイルを開き、目的のセグメントを選択して、システム コントローラ ソフトウェア ( 材料表を参照) からスプレッドシート ソフトウェア プログラムまたはクリップボードにデータ トレースをエクスポートします。表示されるトレースはエクスポートされます (例: 生の力、サルコメアの長さ、ピエゾ位置)。
  2. 選択したソフトウェア(MATLABなど)で解析を実行します。

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結果

データ トレースは、システム コントローラ ソフトウェアで記録され、開かれました ( 資料一覧を参照)。完全なトレースまたは選択したセグメントは、目的のソフトウェアでさらなる分析のためにクリップボードまたはテキストファイルにエクスポートされました。異なるソリューションの流れを制御するためのバルブは、カスタムソフトウェアまたは手動で切り替えられました。カスタム MATLAB スクリプトを使用して、活性化、テンション再開発、および緩和の速度を分析しました。受動力実験の最大活性力とピーク及び高原力を、システムコントローラソフトウェア力トレースから直接採取した。myofibrilを取り付けた後(図2)、目的のプロトコルを選択しました。

最大の活性力とカルシウム-マウスおよびヒト骨格筋生検から分離されたマイオフィブリル中の力の感受性
図4Aでは、活性力実験に用いる実験...

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ディスカッション

記載は、ヒトまたは動物骨格筋組織から分離された筋原線維の収縮機能を評価するプロトコルである。このセットアップの力の分解能は、以前にChavanらら12によって説明されています。要するに、検出繊維とカンチレバーの間に形成されたファブリ・ペロ空洞の長さのランダムな変動によって決定され、読み出しの出力(Vで表される)の出力でノイズの支配的な部分を生成し、偏向感度(m/Vで表される)とカンチレバーのばね定数(N/mで表される)によって、ノイズを与えます。セットアップでは、1,000 データポイント/s (サンプル/s) でサンプリングされた読み出しの出力での空気中の二乗平均平方根(rms)ノイズは約 2 mV です。典型的なミオフィブリル測定では、フェルールトッププローブを使用し、スプリング定数は〜0.7 N/m(偏向感度〜300 nm/V)です。この rms 値は、0.6 nm のカンチレバー偏向解像度に対応し、これは約 0.37 nN の力の感度に変換されます。力プローブは、読み出しレーザ13の波長の倍数に等しいカンチレバーの曲げを維持しながら、...

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開示事項

ミシエル・ヘルメスは、IONOptix Inc.の株主兼共同オーナーです。

謝辞

このプロジェクトは、AFMテレソンとネマリンミオパシーのための財団の建物の強さによって資金提供されました。著者は、この記事で言及されている製品の作成者を認めてほしいと考えています, IONOptix Inc. .

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
バイオスペックプロダクツ株式会社985370-XL筋原線維
カスタムコード化されたMatlab
カスタム製造シリアル接続を制御するLabviewプログラムが含まれています。バルブ
カスタム加工ペルチェモジュール
カスタム加工 カスタム加工
アルミティッシュチャンバー
カスタム加工バルブを制御するには;USB
IonOptixシステムコントローラソフトウェアを制御するPCソフトウェアが含まれています:ピエゾおよびファストステップ
サルコメアの長さ
IonOptixが含まれています:Optiforce(干渉計)、マイクロマニピュレータ、信号インターフェース、ピエゾモータおよびコントローラ。MyoStretcher
、IonOptix、フォースプローブ
、KoolanceADT-EX004S、
KoolanceEX2-755チェモジュール
マイクロソフト、データ登録
、オリンパスIX71
、オリンパスTH4-200
を冷却することに基づいています。Sigma-Aldrich529265ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート);組織の付着を防ぐ顕微鏡スライドのコーティング
TE-63-1.0-1.3組織フローチャンバー
TE Technology, Inc.TC-720USB
組織フローチャンバー
Thermo scientific2441081
Warner Instruments(Harvard Bioscience, Inc.)生産終了代替品:SF-77CST/VCS-77CSP
ワーナー・インスツルメンツ社(ハーバード・バイオサイエンス社)TG150-4ティッシュ
IonWizard用に1台、その他のソフトウェア
を分離するにはを制御するにはを冷却するにはIonOptix MCS100用の高度な信号発生器を備えたデータ記録ソフトウェアを記録するには、ペル、 Sigma-Aldrich 78471 結晶がエタノールに溶解して接着剤になる TE Technology, Inc.を冷却するには Tecan Trading AG 20736652 Tecan Trading AGを制御するPCソフトウェア、20739263シリンジポンプを使用してバックグラウンドフローを誘導し、高速ステップ灌流システムが含まれています。からの流出ペーパーを灌流するには、用に1台のPC

参考文献

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