Method Article

蛍光生涯イメージングを用いたエージングC.エレガンスにおけるアミロイド構造の特徴

DOI:

10.3791/61004

⸱

March 27th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund Berlin, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Molecular Neuroscience Group, Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 4Cell Biology, University of Bremen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蛍光寿命イメージングは、生きている、老化、およびストレスを受けたC.エレガンス病モデルにおけるタンパク質の凝集傾向を監視し、定量化し、区別する。

Abstract

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アミロイド線維は、ハンチントン、パーキンソン病、またはアルツハイマー病などの神経変性疾患の数に関連付けられている。これらのアミロイド線維は、内因性の転移性タンパク質ならびにプロテオスタシスネットワーク(PN)の成分を隔離し、細胞内のタンパク質のミスフォールディングを悪化させることができる。動物内のアミロイドタンパク質の凝集過程を評価するために利用可能なツールの数は限られています。我々は、非侵襲的な方法で、老化の進行と摂動時に、ニューロンなどの特定の細胞におけるアミロイド線維化のモニタリングおよび定量化を可能にする蛍光寿命顕微鏡(FLIM)のプロトコルを提示するPN.FLIMは、フルオロフォアの発現レベルとは無関係であり、さらなる染色や漂白を行うことなく凝集プロセスの分析を可能にします。蛍光体はアミロイド構造の近傍にあるときに消光し、蛍光寿命の減少をもたらす。この焼入れはアミロイドタンパク質の凝集と直接相関する。FLIMは、異なるアミロイドタンパク質、環境刺激、または生体内の遺伝的背景のフィブリリゼーションプロセスを非侵襲的な方法で比較するために適用できる汎用性の高い技術です。

Introduction

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タンパク質凝集は、老化と病気の両方で起こります。大きいアミロイドまたは非晶質の含物の形成および沈着につながる経路は従いにくく、それらのキネティックは同様に解明に挑戦する。タンパク質は、遺伝性疾患の場合のように、コード配列内の本質的な突然変異のために誤って折り畳まれる可能性があります。タンパク質は、老化の間に起こるように、それらを可溶性に保ち、適切に折り畳まれたプロテオスタシスネットワーク(PN)が損なわれるので、誤って折り畳まれる。PNは、分子シャペロンと分解機械を含み、タンパク質の生物発生、折りたたみ、人身売買、および分解を担当しています。

C.エレガンスは、その短い寿命、等元性の性質、および遺伝子操作の容易さのために老化と病気を研究するためのモデルとして登場しました。脆弱な組織でヒト疾患を引き起こすタンパク質を発現するいくつかのC.エレガン株トランスジェニック株が作成されました。重要なことに、凝集しやすいタンパク質を含む株の多くは、アミロイド障害の特徴を再現し、大きな含入物の形成を行う。C.エレガンスの透明なボディのおかげで、これらの凝集体は生体内で、非侵襲的かつ非破壊的に2で視覚化することができる。フルオロフォアとの融合で目的のタンパク質(POI)を生成することで、その位置、人身売買、相互作用ネットワーク、および一般的な運....

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Protocol

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1. C.エレガンスの同期

  1. C.エレガンスをアルカリ次亜塩素酸溶液処理を介して、または20°C8で4時間の単純な産8卵を介して同期する。
  2. 標準的な手順9に従ってOP50大腸菌を播種した線虫成長培地(NGM)プレート上で20°Cで線虫を成長させ、維持する。目的の発達段階または日まで線虫を老化する。
    注:このプロトコルでは、若い成人は4日目に画像化され、古い線虫は人生の8日目に画像化されます。

2. 給餌によるシャペロン機械のRNAi媒介ノックダウン

注:熱ショックタンパク質1(hsp-1)シャペロンのノックダウンを行い、対応するRNAiベクターを線虫10に供給する。hsp-1 RNAiプラスミドは、アリンガーライブラリから得られた(クローンID:F26D10.3)。

  1. 50 μg/mL アンピシリンを含むルリア ベルタニ (LB) 培地でhsp-1 RNAi プラスミドを発現する HT115 (DE3)大腸菌を 6 時間から一晩成長させます。
  2. イソプロピルβ-D-....

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Results

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このプロトコルは、自然な老化時とストレスを受けたときの両方で、生きているC.エレガンスにおける凝集種の形成を正確に監視する方法を示しています。ポリグルタミンタンパク質を発現するトランスジェニック線虫の4種類の株を40Q、44Q、または85Q反復で選択しました。これらのタンパク質は、異なる組織で合成され、異なるフルオロフォアに融合した。C.エレガン株は、体壁筋肉(mQ40-RFP)、神経系のQ40-CFP(nQ40-CFP)、および腸内のQ44-YFPまたはQ85-YFP(iQ44-YFPおよびiQ85-YFP)13を表す。13老化が凝集を促進する方法を説明するために、我々は8日目に若い線虫、4日目の若い線虫、および古い線虫におけるこれらのpolyQ株の寿命を収集した。PNの欠乏の影響を示すために、mQ40-RFP株とnQ40株でhsp-1のノックダウンを行いました。

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Discussion

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ここで提示されるプロトコルは、C.エレガンスモデルシステムの凝集された種を同定するための顕微鏡ベースの技術を記述する。FLIMは、蛍光寿命の減衰の測定を通じて、凝集した可溶性種の両方が蛍光に融合した存在を正確に特徴付けることができます。融合タンパク質が記録された平均寿命を凝集し始めると、より高い値から低い値16にシフトします。凝集の傾向は、寿命の低下によって推測することができます:寿命が低いほど、システム内の凝集タンパク質種の存在が高くなります。これにより、任意のタンパク質の凝集傾向に対するPNの老化、疾患、または障害の影響に従う可能性が高くなる。

この技術の多様性を強調するために、我々の結果は、FLIMが組織またはフッ素色に関係なく、様々なpolyQ構造の構造の変化を同定できることを明確に示した。重要なことに、FLIMは、α-シヌクレイン17のようなC.エレガンス内の他の凝集しやすいタンパク質の特性評価に既にうまく適用されている。さらに、任意の応力因.......

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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研究インフラプログラムのNIH局(P40 OD010440)によって資金提供されているCGCによって提供される筋肉-Q40-mRFP株。ニューロンQ40-CFPは森本研究室の一種の贈り物でした。我々は、DFG(KI-1988/5-1からJKへ、ニューロキュア・ド・エクセレンス・クラスターによるニューロキュア博士課程のフェローシップからMLP)、EMBO(MLPへの短期フェローシップ)、生物学者企業(CGおよびMLPへの旅行助成金)を承認する。また、ベルリンのマックス・デルブリュック分子医学センターにある先端光顕微鏡イメージング施設が、YFP構造を画像化するためのセットアップを提供していることを認めています。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
寒天 神戸I カール・ロス GmbH + Co. KG5210.2NGM 成分
アーリンガー ライブラリー hsp-1 siRNAソース バイオサイエンス UK リミテッドF26D10.3
アンピシリンカール・ロス GmbH + Co. KGK029.3抗生物質
B&H DCS-120 SPC-150ベッカー &Hickl GmbHFLIM Aquisitionソフトウェア
B&H SPC830-SPC イメージベッカー&Hickl GmbHFLIM Aquisition software
BD Bacto PeptoneBD-Bionsciences211677NGM component
C. elegans iQ44-YFPCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OG412
C. elegans iQ85-YFPKind gift from Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFP森本研究室からの親切な贈り物
C. elegans nQ40-CFP森本研究室からの親切な贈り物
Deckgläser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co.KG 0657.2カバー スリップ
イソプロピル -&β;-D-チオガラクトピラノシド (IPTG)Carl Roth GmbH + Co. KG2316.4
ライカ M165 FCライカカメラ AG取り付け 実体顕微鏡
ライカ TCS SP5ライカカメラ AG共焦点顕微鏡
レバミゾール塩酸塩AppliChem GmbHA4341麻酔薬
OP50 Escherichia coliCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OP50
PicoQuant PicoHarp300PicoQuant GmbHFLIM Aquisition software
アジ化ナトリウムCarl Roth GmbH + Co.KG K305.1麻酔薬
塩化ナトリウムCarl Roth GmbH + Co. KG3957.2NGM コンポーネント
Standard-objektträgerCarl Roth GmbH + Co. KG0656.1ガラススライドユニバーサル
アガロースバイオ&GmbHBS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1Carl Zeiss AG共焦点顕微鏡
Zeiss LSM510-Meta NLOCarl Zeiss AG共焦点顕微鏡
を販売

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
  2. Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Bio....

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