我々は、頭蓋骨に安定させることができる先端に曲がった針を採用するインタセラセナーナル注射を記述し、したがって、基礎となるパレンチマへの損傷のリスクを排除する。このアプローチは、レプトメニンゲ細胞の遺伝的運命マッピングおよび操作や脳脊髄液の動きを追跡するために使用することができます。
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この記事について
サマリー
要約
ここで概説するプロトコルは、基礎となるパンキチマへの損傷のリスクを排除しながら、水槽マグナを介して溶液を安全かつ手動で注入する方法を説明しています。以前に公開されたプロトコルは、硬膜表面から最大1〜2mmに下げる必要があるストレート針を使用することをお勧めします。硬膜が穿刺されると、抵抗の急激な低下は、針を安定した位置に維持することが困難になります。私たちの方法は、代わりに、頭蓋骨の後頭部骨に対して安定させることができる先端に曲がった針を使用し、したがって、注射器が硬膜の穿孔後に組織に浸透するのを防ぎます。手順は、簡単で再現性があり、操作された動物に長続きする不快感を引き起こすものではありません。我々は、血管レプトメニンゲ細胞の遺伝的運命マッピングの文脈におけるインタセラセナーナル注射戦略について述べている。さらに、神経発達におけるレプトメニンの役割の調査や細菌性髄膜炎の蔓延など、これらの現象に関連する遺伝子の遺伝的切開を通じて、幅広い研究課題に取り組むためにも利用できる。さらに、この手順は、一定の送達のための自動注入システムと組み合わせることができ、蛍光標識された分子の注入を介して脳脊髄液の動きを追跡するために使用される。
概要
レプトメニンゲ細胞は、脳を重ねた薄層に組織化された線維芽細胞様集団であり、コラーゲン架橋に関与する遺伝子(例えばDcnおよびLum)を発現し、脳髄膜バリア(例えばCldn11)1、2の確立に1,含まれる。レプトメニンゲ細胞は、脳脊髄液排液3の厳密な制御から、発達中の脳44,55における神経前駆細胞の指導まで、幅広い生理機能に関与している。最近の研究では、新生児のレプトメニンジが脳のパレンチマに移行し、機能的皮質ニューロン6に発展する放射状グリア様細胞を収容する可能性が提案されている。
レプトメニンゲ細胞は、表面アストロサイトに近接して位置し、それらと共有し、ならびに他の層状アストロリア、コネキシン-30(Cx30)7の発現を共有する。7以下に概説する外科的処置は、Cx30+細胞中のtdTomatoを条件付きで発現するトランスジェニックマウスのシスターナマグナへのエンドキシフェンの1回の送達を介して、これらの髄膜細胞の広範かつ+特....
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プロトコル
ここに提示された外科的処置は、ストックホルム・ノラ・ジュルフェルセクセティスカ・ナムントによって承認され、研究所(スウェーデンのカロリンスカ研究所)が提供する仕様に同意して実施された。
注:インタシターナル注射は、複数の研究目的に柔軟に適応することができる。R26R-tdTomato12およびCreERを担うトランスジェニックマウスラインにおけるエンドキシフェンの注入に基づいて運命マッピング用レプトメニンゲ細胞を効率的に標識するために開発された手順を以下に提示し、後者はCx30プロモーター13の下で提示する。細胞のこの集団の標識は、以下に概説するのと同じ手順を用いてウイルス構築物の注入によって達成され得る。最後に、このアプローチは、蛍光トレーサーの注入によって、脳脊髄液の流れを追跡するために使用することができる。
1. インジェクションシステムの準備
注:適切な外科室と無菌状態で処置を行うことをお勧めします。手術用具は熱(オートクレーブ、ガラスビーズの殺菌器)を使用して殺菌するか、または熱に敏感であれば高レベルの化学消毒剤を使用して消毒することができる。化学消毒を使用する場合は使用前に使用する前に、機器をすす....
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結果
Cx30プロモーター13と誘導蛍光レポーターの下でCreERを発現するトランスジェニックマウスにおけるエンドキシフェンのインタシビサーナル注射は、皮質中の隣接するCx30発現表面およびパレンキカルアストロサイトに標識することなく、レプトメニンゲン細胞の特異的な組み換えを可能にする(図1)。システルナマグナへのアクセスを得るために、麻酔動物は体と頭部を約120°の角度に配置し、首の後ろを伸ばすことを可能にする(図1A)。硬膜のアトラント後頭部部分は、首の筋肉の鈍い解剖を通して露出され、したがって、基礎となるシステルナマグナへのアクセスを得る。安全な手動注入は先端から3mmでおよそ30°に曲がった針で行われる。これにより、シリンジを頭蓋骨の後頭骨に対して保持することができ、投与中の安定性が向上する(図1.......
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ディスカッション
ここで概説するプロトコルは、運命マッピングのためにレプトメニンゲ細胞にラベルを付ける簡単で再現可能な手順を示しています。我々は、Cx30-CreERでtdTomato蛍光レポーターの発現を誘導するために、タモキシフェンの活性代謝産物であるエンドキシフェンのインタセラシサーナル注射を使用する。R26R-tdトマトマウス12,,13.
シスターナマグナ9を介して脳脊髄液へのアクセスを得るために使用される他のプロトコルと比較して、我々のアプローチは、頭蓋骨の後頭部骨に安定させることができる曲がった針の使用のおかげで安全な手動投与を保障する。システルナマグナの硬膜が穿穿されると、抵抗が急激に低下します。この時点で、他のプロトコルは、針を硬膜表面から最大1〜2mmまで下げ、手動で手順9を通して安定した位置に保つことを推奨する。針がまっすぐとは対照的に、針は頭蓋骨に固定され、組織の深.......
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開示事項
著者らは競合する利益を宣言しない。
謝辞
この研究は、スウェーデン研究評議会、スウェーデン癌学会、スウェーデン戦略研究財団、クヌート・オーク・アリス・ワレンベルス・スティフタース、カロリンスカ研究所(StratRegen)の幹細胞と再生医療の戦略研究プログラムからの助成金によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 麻酔ユニット | ユニベントール 410 | 8323102 | 気化器、チャンバー、チャンバーとマウスヘッドホルダーに接続するチューブの完成 |
| 麻酔(イソフルラン) | バクスターメディカル AB | 000890 | |
| ベタジン | シグマ-アルドリッチ | PVP1 | |
| カルプロフェン | オリオン ファーマ | AB 014920 | 商品名 リマジル |
| シアノアクリレート接着剤 | カール | 0258.1 | 代替の |
| メドボンド組織接着剤 | ールティング | 50479 | |
| DMSO | シグマアルドリッチ | D2650 | |
| エンドキシフェン | シグマアルドリッチ | E8284 | |
| エタノール70% | ヒストラブ | 01370 | |
| ハミルトンシリンジ(30G斜め針) | ハミルトン | 80300 | |
| リドカイン | アスペン ノルディック | 520455 | |
| マウスヘッドホルダー | ナリシゲインターナショナル | SGM-4 | 吸入性鎮痛薬用マウスピース付き。あるいは、定位フレームを使用してください |
| さみ | ファインサイエンスツール | 15009-08 | |
| シェーバー | Aesculap | GT420 | |
| 滅菌吸収スピア | ファインサイエンスツール | 18105-01 | 滅菌綿棒も良い選択肢です |
| 外科用セパレーター | ワールド精密機器 | 501897 | |
| ピンセット | デュモン | 11251-35 | |
| ビスコティアーズ | バウシュ&ロムノルディックAB | 541760 |
参考文献
- Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
- Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to t....
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再版と許可
