アシル樹脂アシスト捕捉によるプロテインS-アシル化の検出

S-アシル化は、陰唇チオエステル結合¹を介して標的タンパク質上のシステイン残基に脂肪アシル鎖を付加することを含む可逆的な翻訳後修飾である。それはパルミテ酸塩、飽和16-炭素脂肪酸²を有するタンパク質の修飾として最初に報告された、したがって、この修飾は、しばしばS-パルミトイル化と呼ばれる。パルミチン酸に加えて、タンパク質は、様々な長く短い飽和(ミリステイトおよびステアレート)、一価不飽和(オレ酸塩)および多価不飽和(アラキドキおよびエイコサペンタノエート)脂肪酸^{33、4、5、6、74,5,6,7}によって可逆的に修飾することができる。真核細胞において、S-アシル化はDHHCタンパク質アシルトランスセラーゼとして知られる酵素ファミリーによって触媒され、システイン脱アシル化の逆反応はタンパク質チオエステラーゼによって触媒され、そのほとんどは依然として謎8^{のままである。}

チオスター結合の可射性により、この脂質修飾を可逆的にし、タンパク質のクラスタリング、細胞質膜局在、細胞内の密売、タンパク質相互作用およびタンパク質安定性^99,1010を動的に調節することを可能にする。その結果、S-アシル化は、ハンチントン病、アルツハイマー病およびいくつかのタイプの癌(前立腺癌、胃、膀胱、肺、大腸)を含むいくつかの障害に関連しており、この翻訳後タンパク質改変¹¹を検出するための信頼できる方法の開発を必要とする。

パルミテは、放射性([3H]、14C)または^3[125I])を用いた代謝標識は、タンパク質S-アシル化^{12、13、14,13,}をアッセイするために開発された最初のアプローチの¹つである。¹⁴しかしながら、放射線標識ベースの方法は健康上の懸念を提示し、非常に敏感ではなく、時間がかかり、そして非常に豊富なタンパク質¹⁵の脂質を検出するだけである。放射性標識に対するより速く非放射性の代替は、生体直交脂肪酸プローブによる代謝標識であり、これはタンパク質S-アシル化¹⁶の測定ダイナミクスをアッセイするために日常的に使用される。この方法では、化学レポーターを有する脂肪酸(アルキンまたはアジ化基)を、アシルトランスファーーゼタンパク質によってS-acylatedタンパク質に組み込む。アジドアルキン・ウイスゲン・シクロ付加反応(クリック化学)は、フッ素酸またはビオチンなどの官能性基を、S-acylateタンパク質^{17、18、19,18,19}の検出を可能にする集積脂肪酸に付着させるために使用することができる。

アシルビオチン交換(ABE)は、組織サンプル15に不適当な代謝標識の欠点のいくつかをバイパスするS-acylatedタンパク質の捕捉および同定に広く用いられている生化学的方法の^{1つである}。この方法は、組織および凍結細胞試料^20,21,21を含む多様な生物学的サンプルにおけるS-アシル化の分析に適用することができる。この方法は、中性ヒドロキシルアミンによるアシル基とシステイン残基との間のチオエステル結合の選択的切断に基づく。遊離チオール基は、次いでチオール反応性ビオチン誘導体で捕捉される。生成されたビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンアガロースを使用して親和性精製され、免疫ブロッティングによって分析されます。

アシル樹脂アシスト捕捉(Acyl-RAC)と呼ばれた代替アプローチは、後に、シオール反応性樹脂^22,23,23による遊離システインの直接結合と共にビオチン化ステップを置き換えるために導入された。この方法は、ABEと比較して少ないステップを有し、同様に、サンプル¹の広い範囲でタンパク質S-アシル化を検出するために使用することができる。

Acyl-RACは4つの主要なステップ(図1)で構成されています。
1. 無料チオール群のブロック;
2. システイン-アシルチオエステル結合の選択的切断中性ヒドロキシルアミン (HAM) システインチオール基を露出する;
3. チオール反応性樹脂を用いた脂質化されたシステインの捕獲;
4. 還元バッファーと溶出後の S-acylated タンパク質の選択的濃縮.

次いで、捕捉したタンパク質を免疫ブロッティングにより分析するか、または質量分析(MS)ベースのプロテオミクスを行い、S-acylatedプロテオームを様々な種および組織^{22、24、2524,25}の範囲で評価することができる。²²個々のS-アシル化部位は、捕捉されたタンパク質のトリプシン消化およびLC-MS/MS²²による得られたペプチドの分析によっても同定することができる。ここでは、細胞株と組織サンプルの両方で、複数のタンパク質のS-アシル化を同時に検出するためにacyl-RACを使用する方法を示す。

このプロトコルで使用されたマウスは、NIHガイドラインに従って安楽死させた。ヒューストンのテキサス大学保健科学センターの動物福祉委員会は、すべての動物の仕事を承認しました。

1. 細胞ライセートの調製

1. 表1に記載されているように、リシスバッファを準備する。PBSを10mLに、0.1gのn-ドデシルβ-D-マルトシド洗剤(DDM)を加え、溶解させて回転させます。100 μL のホスファターゼ阻害剤カクテル 2、ML211(10 μM)、PMSF (10 mM)、プロテアーゼ阻害剤カクテル (1x) を加え、使用前に氷上でバッファーを冷やします。
2. 培養器から細胞を含む必要な培地を、350 x gで15mLまたは50 mLの円錐形チューブおよびスピン細胞に移し、細胞の破片を取り除くために吸気します。
   注:我々は実行される各アシル-RAC反応のために1 x 10⁷細胞を使用しました。
3. ペレットをPBS 5 mL に再懸濁し、350 x gで 5 分間回転させて洗浄します。
   注:PBSの拡張インキュベーションによる細胞溶菌を避けるために、ステップ1.3を迅速に実行してください。
4. ステップ1.1で調製した600μLのリシスバッファーをペレットに加え、4°Cで30分間サーマルシェーカーで1500rpmで振って溶地します。
5. 透明溶解液は、ペレット洗剤不溶性材料に30分間4°Cで20,000 x gで遠心分離によって。予め冷却された1.5 mLマイクロフュージチューブでクリアしたライセートを収集し、氷の上に保管してください。
6. ブラッドフォード/BCAアッセイを実行してタンパク質濃度を推定します。実験を行う前に、異なるサンプル間で同量のタンパク質を確保することが重要です。1回の反応で500μg以上のタンパク質を使用することを推奨します。
   注:記載の実験では、マウス組織から培養された(Jurkat)細胞と初代脾細胞を使用しました。上記のライシス法は、他の細胞タイプにも採用することができる。上記の細胞タイプに対して得られる平均タンパク質濃度は、1×107細胞当たり⁷約500μgである。ジュルカット細胞は、2 mM L-グルタミン、10 mM HEPES、1 mMピルビン酸ナトリウム、4,500mg/Lグルコース、および1,500mg/L炭酸ナトリウムを_5%CO2で37°Cで10%FBSを添加して含むRPMI-1640培地で維持した。我々は、反応ごとに1 x 10⁷ジュルカット細胞を使用した。初代脾細胞は^、26に記載したマウス脾臓組織から単離した。簡単に言えば、脾臓組織を氷上で浸食し、続いて低張性溶液中の赤血球の溶解と遠心分離によるリンパ球からの分離を行った。反応ごとに1 x 10^7の一次細胞を使用しました。

2. アシル-RAC: フリーチオール群の遮断

注: 以降の手順はすべて室温(RT)で実行できます。

1. リセートを新鮮な1.5 mLマイクロフュージチューブに移し、以下に説明するクロロホルムメタノール(CM)沈殿を行う。
   1. メタノール(MeOH)とクロロホルム(CHCl3)₃を、リセートの最終比でリセートに加え、MeOH:CHCl₃ of 2:2:1を、均質な懸濁液を作り出すために激しく振る。
   2. 水相と有機相の間の相でペレット(「パンケーキ」)を形成するために5分間10,000 x gで回転します。
   3. 針またはゲルローディングチップを使用して、チューブを傾け、できるだけ多くの溶媒を吸引します。
   4. プロテインペレットを数分間空気乾燥し、600 μLのMeOHを加えて穏やかに洗浄し、ペレットを分解しないように穏やかに混合します。
   5. 残りのMeOHを慎重に取り除き、ベンチトップのプロテインペレットを約5分間乾燥させます。
   6. (オプション)MeOH洗浄後に壊れたペレットをスピンダウンして、試料の損失を避けるために、追加の遠心分離ステップを実行します。
      注: CM の降水ステップの後で実験を停止できます。ペレットが得られたら、500 μL の MeOH で-20 °Cで 1 週間まで保存できます。
      1. 2SHBバッファーの200 μLにタンパク質ペレットを溶解し、42°C/1500 rpmでペレットが溶解するまでサーマルシェーカーでボルテックスします。
   7. (オプション)ペレットを溶解するために超音波式水浴で追加の5〜10分間インキュベート。
      注:超音波処理の長さは、材料の溶解度によって異なります。しかし、長時間の超音波処理はタンパク質分解を引き起こす可能性があります。
2. 2SHBバッファーの998 μLに2 μL MMTSを加えて、2SHBで0.2%メチルメタンチオスルホン酸塩(v/v)を2SHBで調製します。
   メモ:実験ごとに、作りたての0.2%MMTSを使用してください。
3. 2SHBに0.2%MMTSの200 μLを加えて、各チューブに0.1%MMTSの最終濃度を加えます。サーマルシェーカーで1500rpmで振るとともに42°Cで15分間インキュベートします。

3. アシルRAC:ヒドロキシルアミン(HAM)の切断とS-アシル化タンパク質の捕獲

1. MMTSを除去するために、上記のように3〜4倍のCM沈殿を繰り返します。MMTSの除去は、MMTSの独特の臭気の欠如によって推定することができる。沈殿後、ペレットを溶解するまでサーマルシェーカーで42°C/1500rpmでボルテックスすることにより2SHBバッファーの100μLにペレットを溶解し、次いで300μLのバッファーAで希釈する。
2. 最終沈殿後、上記の2SHBバッファの200μLにサンプルを溶解し、240 μLのバッファAで希釈します。
3. いくつかの処置条件に応じてS-acylationの変化を比較する場合、再びタンパク質濃度を測定し、各条件に対して同量のタンパク質を使用して進めます。
4. 各サンプルから40μLを入力コントロールとして保持します。
5. サンプルを200 μLの2つの等しい部分に分割し、チューブを「+HAM」と「-HAM」としてマークします。50 μLの新たに調製したニュートラル 2 M HAM (pH 7.0-7.5) をチューブの 1 つに 400 mM の最終濃度 (+ HAM) に加え、2番目のチューブ (- HAM) に 50 μL を加え、負のコントロールとして使用します。チオプロピル・セファローズ(TS)ビーズの添加に進みます。
   注: CM の降水ステップの後で実験を停止できます。ペレットが得られたら、500 μL の MeOH で-20 °Cで 1 週間まで保存できます。2 M HAM の中性 pH は、アシルシステインチオエステル結合の選択性を保証し、慎重に調整する必要があります。過度の発泡によるサンプルの損失を避けるために、2SHBバッファでサンプルを取り扱う際には注意が必要です。以下のすべてのステップは、HAM および + HAM サンプルと同じです。
6. 各チューブに30 μLのTSビーズスラリーを加え、RTで1~2時間回転させます。
7. TSビーズをバッファAに1%SDSで4倍洗い、残ったHAMを取り除きます。
   1. マイクロフュージを使用して1分間、すべてのビーズサンプルをそっとスピンダウンし、上清を慎重に吸引します。
   2. バッファー A のビーズを 500 μL の 1% SDS で再中断します。
   3. ステップ 3.7.1 ~ 3.7.2 を繰り返します。
      注:活性化チオプロピルセファローズ(TS)は、カップリングする前に中性pHで洗い流さなければならない添加剤の存在下で凍結乾燥供給される。蒸留水は、膨潤や洗浄におすすめです。0.1gのビーズの重量を量り、蒸留水1mLで再懸濁し、RTで30分間回転しながら膨らまじ、緩衝液Aでビーズ1xを洗浄し、50%のゲル化培地から50%のバッファーの比率でスラリーを調製します。腫れたTSは、4°Cで1週間まで20%エタノールの存在下で中性pHで保存され得る。アジドイオンは2-ピリジルジスルフィド基と反応するため、静電剤としてアジドナトリウムを使用しないでください。より高い効率のために、新鮮なビーズを準備します。ビーズを取り扱いながら、P200ピペットチップの先端を少し切って、損傷を防ぐことができます。
      注:CMの降水後の任意の段階で実験を停止することができます。ペレットは、MeOHの500 μLで-20°Cで1週間まで保存することができます。

4. S-アシル化タンパク質の溶出と検出

1. 最後の洗浄後、上記のようにビーズを軽く回転させ、ビーズを邪魔することなくできるだけ多くの上澄み物を吸い込みます。
2. DTTを使用して4倍のSDSサンプルバッファーを使用してビーズからタンパク質を回収します。
   1. ビーズに50 μLの4倍のSDSサンプルバッファーを加え、80°Cでインキュベートし、サーマルシェーカーで15分間1500rpmでインキュベートします。チューブを冷まします。
   2. 5,000 x gでビーズを 3 分間遠心分離し、ビーズを完全にペレットし、ゲルローディングチップを使用して溶出したタンパク質を新鮮な 1.5 mL チューブに移します。
3. SDS-PAGEを実行し、ウェスタンブロッティングによって目的のタンパク質のS-アシル化を分析します。

上述したプロトコルに従って、我々は最初に、T細胞白血病患者27の末梢血に由来する不死化T細胞株であるJurkat細胞における複数のタンパク質のS-アシル化を同時に検出するために、acyl-RACを用いた。この方法の有用性を実証するために、以前にS-acylated9,289,28,2929と同定された調節性T細胞タンパク質が選択された。図2Aに示すように、チロシンキナーゼLckは、システイン残基と脂肪酸部分(+HAMレーン)との間のチオエステル結合を切断するために中性2Mヒドロキシラミンで処理されたライセートで検出することができる。2M NaCl(-HAMレーン)で処理した試料は重要な陰性対照を表し、チオエステル結合の検出に対するアッセイの選択性を示す。入力レーンは、シグナルの特異性をさらに確認し、目的のタンパク質がS-acylatedでない場合は陽性制御として機能することができる。次いで、膜を剥ぎ取り、タンパク質に対する抗体を再検出し、FynとLATを用いて、アシルRACアッセイを用いて複数のタンパク質のS-アシル化を同時に分析できることを実証した(図2A)。

この方法を用いた組織試料中のプロテインS-アシル化を検出する有用性を実証するために、マウス脾臓にアシルRACプロトコルを適用した。図2Bに示すように、Lck、FynおよびLATのS-アシル化は、この修飾が2種間で保存されていることを示す一次マウス脾細胞において容易に検出され得る。

図 1.アシル-RACの模式的表現。この方法は、4つの主要なステップからなる:(1)メチルメタンチオスルホン酸(MMTS)を有する遊離チオール基を遮断し、(2)システインアシルチオスター結合の選択的切断、システインチオール基を露出させる中性ヒドロキシルアミン(HAM)、 (3)新たに露出したシステインチオールを用いたタンパク質の捕捉を、チオール反応性樹脂と直接結合し、(4)還元溶出緩衝液を用いて捕捉したタンパク質を回収し、続いて免疫ブロッティングまたはMS分析を行う。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.S-アシル化タンパク質の検出アシルRACアッセイを用いて、Jurkat T細胞(A)およびマウス脾臓組織(B)におけるT細胞シグナル伝達タンパク質のS-アシル化を検出した。Lck-、Fyn-およびLAT特異的抗体を用いた免疫ブロットは、ヒドロキシルアミン処理試料中のこれらのタンパク質のS-アシル化を示す(+HAMレーン)。塩化ナトリウム(-HAMレーン)で処理されたサンプルは、陰性対照として機能する。未処理のライセートは入力レーンに示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表 1: プロトコルで必要とされる一般的に使用されるバッファーのバッファー構成。2SHBバッファとバッファAは事前に用意できますが、pHは定期的にチェックする必要があります。ライシスバッファーとHAMは実験の日を準備する必要があります。

利益相反は宣言されていません。