このプロトコルは、シプンキュラス・ヌダス・コエロミック流体中の標的遺伝子のmRNA発現レベルおよび空間パターンを検出するための、その場合のハイブリダイゼーションアプローチに有効であることを説明する。
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この記事について
サマリー
要約
situハイブリダイゼーション(ISH)では、組織に特異的な遺伝子(例えばmRNAおよびncRNA)の細胞分布パターンを提示する非常に有益な技術である。シプンキュリドワームシプンクルスヌドゥスは、栄養価と薬効が高いため、重要な漁業資源です。現在、シプンクルス・ヌドゥスの分子生物学に関する研究はまだ初期段階にあります。この記事の目的は、シプンクルスヌダコエロミック流体中の特定のmRNAを局所化するための敏感な方法を開発することです。このプロトコルには、ジゴキシゲニン標識アンチセンスおよびセンスリボプローブ製剤、コエロミック流体採取およびセクション調製、特異的リボプローブハイブリダイゼーション、抗体インキュベーション、着色およびポスト着色治療を含む、ISHの詳細なステップが含まれる。この方法を用いた実験の成功から得られた代表的な結果を示す。このプロトコルは、他のシプンキュラ種にも適用可能である必要があります。
概要
ISHは、目的とする特異的DNAまたはRNA配列を検出するために標識核酸プローブを用いて、形態学的に保存された組織11、2、32,3における標的遺伝子の空間発現パターンを記述するのに有用な方法である。通常、標的配列はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生成され、次いで、二ゴキシゲニンウリジン-5'-三リン酸で標識されたアンチセンス/センスRNAプローブを合成する鋳型として使用される。サンプルはリボプローブでインキュベーションする前に固定され、透過化される。過剰なプローブを洗浄した後、ハイブリダイゼーションは、アルカリホスファターゼ共役,33、4、5、6である抗ジガオキシゲニン抗体を用いた免疫ヒステクストケミストリーによって可視化される。5,6,4
シプンキュラスヌドゥス(フィラムシプンキュラ;オーダーシプンクリダ:シプンクリダ)は、セグメント化されていない、コエロメートと両側対称海洋ワーム
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プロトコル
動物の手順は、華橋大学の動物ケアと福祉委員会によって承認されました.
1. リボプローブ製剤
- プライマーデザイン
- プログラムのプライマー 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/) を開きます。dmrt1シーケンス (GenBank: MK182259) をシーケンス・ウィンドウにコピーします。
- プライマー長(23~25bp)、融解温度(55~60°C)、G/C含有量(40~60%)を設定します。[プライマーを選択]をクリックします。
注: RNA プローブに必要な最小サイズは約 500 bp です。 - T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列(5,-TAATACGACTACTATAGGG-3)を,選択したプライマーの1つに加えます。 ISH のdmrt1プライマーシーケンスを表 1に示します。
注:センスプローブの場合、T7 RNAポリメラーゼプロモーターは、フォワードプライマーの5'末端に位置しています。アンチセンスプローブの場合、T7 RNAポリメラーゼプロモーターは逆プライマーの5'末端に位置しています。
- PCR 増幅
- マ....
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結果
ISH に関連する手順の概要を図 1に示します。dmrt1用のアンチセンスおよび対応するセンスリボプローブを、コエロミック流体cDNAから増幅したPCR産物から合成した。PCR産物の真正性は、直接シーケンシングによって検証された。リボプローブは、メーカーのプロトコルに従ってT7 RNAポリメラーゼを用いて合成し、以前のレポート4を若干の変更を加えた。ISHの代表的なシグナルを図2に示します。dmrt1を標的とするアンチセンスリボプローブを有するシプンキュラスヌドゥスコエロミック流体のISHは、精子の栄養芽細胞に濃縮された紫色の染色を明らかにする(図2A、B、赤矢印)。センスリボプローブを陰性対照として用い、dmrt1用のセンスリボプローブはハイブリダイゼーション信号を検出しなかった(
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ディスカッション
これまでの研究では、ISHは複数の標的RNA16、17、18,17,18を検出するのに適している。本プロトコルでは、血中流体中のmRNAを検出する高分解能のISH法を説明し、Sipunculus nudusの最適化されたハイブリダイゼーション条件を強調した。我々が観察したdmrt1の明らかなシグナルは、遺伝子発現の検出においてこのプロトコルの応用が成功したことを示した(図2)。
実験中、一連のステップは特に注意を払う必要があります。まず、標的遺伝子のセンスリボプローブをコントロールとして合成する必要があります。合成後、リボプローブの品質はゲルでチェックする必要があります。RNAの合成が不十分な場合、セクションに染色は発生しません。第二に、サンプル採取プロセスは細胞の変形を防ぐために穏やかにする必要があり.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、中国国立自然科学財団(グラント31801034)、中国福建省自然科学財団(2016J01161)、華橋大学科学研究基金(15BS306)、大学院生の華橋大学の革新的な科学研究基金によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アガロー | Biowest | 111860 | |
| 抗ジゴキシゲニン-AP Fab フラグメント | ロシュ | 11093274910 | |
| BCIP/NBT アルカリホスファターゼ カラー現像キット | Beyotime | C3206 | |
| ウシ血清アルブミン | Σ | B2064 | |
| 遠心分離機 | エッペンドルフ | 5415R | |
| クエン酸 | シノファーム化学試薬株式会社 | 5949-29-1 | |
| クエン酸三ナトリウム | Sinopharm化学試薬株式会社 | 4/3/6132 | |
| カバースリップ | Beyotime | FCGF60 | |
| 脱イオンホルムアミド | アムレスコ | 1975 | |
| ジエチルピロカーボネート、DEPC | Sigma | D5758 | 有害物質 |
| ジゴキシゲニン (DIG) RNA ラベリング ミックス | ロシュ | 11277073910 | |
| DNase I、RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| 電気泳動ゲルイメージング | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| エタノール | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| ゲル抽出キットオ | メガ | D2500 | |
| ゲル電気泳動装置 | 北京Liuyi機器工場 | DYY-6C | |
| グリセロール | Sinopharm化学試薬株式会社 | 56-81-5 | |
| グリシン | シグマ | G5417 | |
| ヘパリン | シグマ | 8/1/9041 | |
| KCl | シノファーム ケミカル 試薬 Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm化学試薬Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | グマ | ||
| マレイン酸 | Sinopharm化学試薬株式会社 | 110-16-7 | |
| メタノール | Sinopharm化学試薬株式会社 | 67-56-1 | 有害物質 |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm化学試薬Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | 腐食性 |
| パラフィンフィルム | Bemis Company、Inc. | PM-996 | |
| パラホルムアルデヒド、PFA | シグマ | 158127 | 有害物質 |
| PCR 機器 | ライフサイエンス テクノロジー | Proflex | |
| ピン | ズ デリ | 16 | |
| ピペット | エッペンドルフ | プラス G | |
| ポリ-D-リジン処理 顕微鏡スライド | Liusheng | ||
| プロテイナーゼ K | シグマ | ||
| RNase フリーウォーター | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| 羊血清 | Beyotime | C0265 | |
| スライド染色ジャー | Beyotime | FG010 | |
| スライド収納ボックス | Beyotime | FBX011 | |
| 小型オートクレーブハサミ | Shuanglu | sku_8330 | |
| 分光光度計 | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA ポリメラーゼ | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA ポリメラーゼミックス (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ウォーターバス | 鄭州万里の長城科学 | HH-S2 |
参考文献
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology....
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再版と許可
